周 瑩， 韓玉龍， 駱 劍， 王 茜， 陳國(guó)華

(南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?70228)

鞍帶石斑魚(yú)、棕點(diǎn)石斑魚(yú)及其雜交子代DNA甲基化的MSAP分析

周 瑩， 韓玉龍， 駱 劍， 王 茜， 陳國(guó)華

(南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?70228)

為了探究海洋魚(yú)類雜交優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)生機(jī)制，以鞍帶石斑魚(yú)、棕點(diǎn)石斑魚(yú)及其雜交子一代石斑魚(yú)為研究對(duì)象，采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)對(duì)三個(gè)群體的基因組DNA的胞嘧啶甲基化修飾水平進(jìn)行了研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，棕點(diǎn)石斑魚(yú)、鞍帶石斑魚(yú)、雜交子一代石斑魚(yú)的基因組DNA的總甲基化率分別為57.18%，63.16%，54.76%，在石斑魚(yú)親本的基因組中，其DNA的甲基化程度較高，而在雜交子代中，其DNA的甲基化程度較低.三個(gè)群體的DNA全甲基化率分別為31.66%，39.71%，40.00%，半甲基化率分別為25.52%，23.44%，14.76%，雜交子代的半甲基化率顯著低于親本的半甲基化率.研究表明，鞍帶石斑魚(yú)與棕點(diǎn)石斑魚(yú)的雜交子代在基因組層面上和雙親相比發(fā)生了較大的甲基化水平的調(diào)整，于不同位點(diǎn)，DNA甲基化的增強(qiáng)或減弱對(duì)石斑魚(yú)雜種優(yōu)勢(shì)可能會(huì)產(chǎn)生影響.

石斑魚(yú)； DNA甲基化； 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性； 雜種優(yōu)勢(shì)

石斑魚(yú)隸屬鱸形目、鮨科、石斑魚(yú)屬，屬暖水性魚(yú)類，主要分布在熱帶及亞熱帶海區(qū)，屬世界名貴海水魚(yú)類，其在我國(guó)南部沿海地區(qū)均有廣泛養(yǎng)殖，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益.但近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈和其棲息地遭到破壞，從而造成野生石斑魚(yú)的種群規(guī)?？s小和種質(zhì)資源退化，致使石斑魚(yú)優(yōu)良品種缺乏，這已成為制約養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸因素[1-2].采用遠(yuǎn)緣雜交的方法來(lái)獲得具有雜種優(yōu)勢(shì)的子一代是快速有效的品種改良方式.石斑魚(yú)種類眾多，由于揭示石斑魚(yú)雜種優(yōu)勢(shì)的主要作用機(jī)制是開(kāi)展雜交育種工作的重要基礎(chǔ)，因此選擇合適的親本雜交組合就成為培育石斑魚(yú)優(yōu)良雜種的關(guān)鍵.

雜種優(yōu)勢(shì)的機(jī)制包括“顯性說(shuō)”、“超顯性說(shuō)”和“上位效應(yīng)說(shuō)”等，它們均在一定程度上揭示了雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的機(jī)制，這些機(jī)制主要源于親本之間的基因型差異.Romagnoli等[3]的研究證實(shí)了玉米雜種根尖中的基因差異表達(dá)與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)聯(lián)，不僅如此，越來(lái)越多的研究亦表明了基因表達(dá)差異對(duì)于雜種優(yōu)勢(shì)的作用[4-5].DNA甲基化作為主要的基因表觀修飾方式之一，其程度的改變已被證實(shí)會(huì)對(duì)高等動(dòng)植物的雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生顯著的作用[6-7].

棕點(diǎn)石斑魚(yú)(E.fuscoguttatus)俗稱老虎斑，其生長(zhǎng)速度較慢，飼養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，但是抗病力強(qiáng)；鞍帶石斑魚(yú)(Epinepheluslanceolatus)又稱龍躉石斑魚(yú)，其肉質(zhì)鮮美，體型較大，生長(zhǎng)速度快.以棕點(diǎn)石斑魚(yú)為母本和以鞍帶石斑魚(yú)為父本進(jìn)行雜交所得到的雜種子一代具有“虎斑頭、龍膽尾”的外型，其集母本抗病力強(qiáng)和父本生長(zhǎng)速度快等優(yōu)點(diǎn)于一身，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，體長(zhǎng)增長(zhǎng)比母本棕點(diǎn)石斑魚(yú)快35.9%，體重增長(zhǎng)快114.5%，顯示出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)[8-9].本實(shí)驗(yàn)以該雜交組合為研究對(duì)象，采用MSAP技術(shù)來(lái)分析鞍帶石斑魚(yú)、棕點(diǎn)石斑魚(yú)和其雜交子一代間DNA甲基化水平的差異，研究了DNA甲基化與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系，旨在揭示石斑魚(yú)雜種優(yōu)勢(shì)的機(jī)理和為雜交育種提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 材 料 實(shí)驗(yàn)材料取自海南陵水石斑魚(yú)養(yǎng)殖基地，選取了棕點(diǎn)石斑魚(yú)♀×鞍帶石斑魚(yú)♂的雜交子代幼魚(yú)群體，以母本棕點(diǎn)石斑魚(yú)群體自交的子代幼魚(yú)群體和父本鞍帶石斑魚(yú)群體自交的子代幼魚(yú)群體為樣本.每個(gè)群體分別隨機(jī)選取30尾，取尾鰭組織固定于φ=95%的酒精中，并帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用TIANGEN的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取樣品DNA，并以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，于-20℃保存.

1.2.2 雙酶切反應(yīng) 對(duì)于每份DNA，同時(shí)設(shè)置EcoRI+HpaII(以下記作H組)和EcoRI+MspI(以下記作M組)兩種酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系包括基因組500 ng DNA，5 U EcoRI，5 U HpaII/MspI，4 μL 10×Buffer Tango，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL.37 ℃水浴酶切6 h，轉(zhuǎn)65 ℃酶切變性10 min，最后用w=1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.2.3 連接接頭 連接體系為20 μL，包括5 μL酶切產(chǎn)物，1 μL E接頭，1 μL HM接頭，5 U T4DNA Ligase，4 μL 5×T4DNA Ligase Buffer，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL.16 ℃連接過(guò)夜，產(chǎn)物稀釋10倍以用于預(yù)擴(kuò)增.

1.2.4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)總體系為20 μL，其中含2 μL稀釋連接產(chǎn)物，1 μLE0和HM0預(yù)擴(kuò)引物，2 μL 2.5 mmol·L-1的 dNTPs，2 μL 10×Taq Buffer以及2 U Taq DNA Polymerase，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL.預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min.最后用w=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物稀釋20倍后用于選擇擴(kuò)增.

1.2.5 選擇性擴(kuò)增反應(yīng) 反應(yīng)總體系為20 μL，包括4 μL預(yù)擴(kuò)增稀釋產(chǎn)物，1 μL En選擴(kuò)引物和HMn選擴(kuò)引物，2 μL 2.5 mmol·L-1的dNTPs ，2 μL 10×Taq Buffer以及2U Taq DNA Polymerase，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μL.選擇擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，56～65 ℃ 30 s(-0.7℃/cycle)，72 ℃ 1 min，循環(huán)14次；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)23次，72 ℃ 5 min，16 ℃ 保存.最后用w=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物稀釋10倍.

實(shí)驗(yàn)所用的接頭和引物組合見(jiàn)表1，根據(jù)使用所有選擴(kuò)引物擴(kuò)增的結(jié)果，篩選出8對(duì)重復(fù)性好、多態(tài)性好、條帶清晰的選擇擴(kuò)增引物組合以用于本實(shí)驗(yàn)的研究，8對(duì)引物組合分別是：選引2—E1HM2，選引5—E1HM5，選引6—E2HM1，選引7—E2HM2，選引8—E2HM3，選引12—E3HM2，選引13—E3HM3，選引17—E4HM2.

表1 所用接頭和引物序列

1.2.6 產(chǎn)物檢測(cè) 采用JY-CX2B型電泳槽進(jìn)行6%變性聚丙烯酰氨凝膠電泳，選擴(kuò)稀釋產(chǎn)物與上樣緩沖液以2 ∶1的比例混合，95 ℃變性10 min，立即置于冰上待用.采用70 W恒功率預(yù)電泳1 h，取4 μL已變性產(chǎn)物，在70 W恒功率下電泳2 h，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染.

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 在MSAP圖譜上，對(duì)于同一樣品的DNA，分別用HpaII和MspI與EcoRI組合進(jìn)行雙酶切，因此每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)2個(gè)泳道，在同一位點(diǎn)，有條帶計(jì)為“1”，無(wú)條帶計(jì)為“0”.統(tǒng)計(jì)8對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)及帶型數(shù)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在2個(gè)泳道內(nèi)的有無(wú)的情況，可以將條帶類型分為4種：(1)A型：H、M兩個(gè)泳道都有帶，即“H/M”帶型為“1、1”，其表示該酶切位點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生甲基化，代表去甲基化位點(diǎn)；(2)B型：H泳道有帶，M泳道無(wú)帶，即“H/M”帶型為“1、0”，其表示該酶切位點(diǎn)為單鏈外甲基化，代表半甲基化位點(diǎn)；(3)C型：H泳道無(wú)帶，M泳道有帶，即“H/M”帶型為“0、1”，其表示該酶切位點(diǎn)為雙鏈內(nèi)甲基化，代表全甲基化位點(diǎn)；(4)D型：H、M兩個(gè)泳道都無(wú)帶，即“H/M”帶型為“0、0”，此時(shí)有三種情況，即表示該酶切位點(diǎn)存在雙鏈外側(cè)甲基化、雙鏈內(nèi)外側(cè)甲基化或無(wú)CCGG序列，此類型位點(diǎn)不做統(tǒng)計(jì).將得到的甲基化條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各個(gè)群體的總甲基化率、全甲基化率及半甲基化率.DNA甲基化的計(jì)算方法：全甲基化率=全甲基化條帶數(shù)/總擴(kuò)增帶數(shù)×100；半甲基化率=半甲基化條帶數(shù)/總擴(kuò)增帶數(shù)×100；總甲基化率=全甲基化率+半甲基化率.

2 結(jié) 果

2.1 雜交子一代群體的基因組DNA提取及雙酶切 MSAP對(duì)DNA的質(zhì)量要求較高，本實(shí)驗(yàn)提取的雜交子一代的DNA瓊脂糖凝膠(w=1%)電泳圖如圖1所示，基因組DNA的樣本基本無(wú)RNA及蛋白質(zhì)污染，質(zhì)量較高.經(jīng)EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI雙酶切后，雜交子一代的DNA酶切產(chǎn)物呈一片均勻分布的“Smear”帶，表明酶切充分，符合MSAP對(duì)酶切的要求，見(jiàn)圖2.

2.2 預(yù)擴(kuò)增 雜交子一代基因組DNA雙酶切后，連接接頭，連接產(chǎn)物經(jīng)預(yù)擴(kuò)增后，用w=1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，產(chǎn)物條帶大致呈彌散狀，其在100～1 000 bp之間穩(wěn)定存在，擴(kuò)增效果較好.

2.3 選擇擴(kuò)增 首先預(yù)擴(kuò)增稀釋產(chǎn)物，用篩選出的8對(duì)選擴(kuò)引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，用w=2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)選擴(kuò)效果，產(chǎn)物條帶區(qū)主要分布在低分子量區(qū)，重復(fù)性好、多態(tài)性好、條帶清晰.圖4是雜交子一代群體選擴(kuò)引物2的瓊脂糖凝膠(w=2%)電泳圖.

2.4 三個(gè)石斑魚(yú)群體的甲基化圖譜 用選擴(kuò)引物2擴(kuò)增的產(chǎn)物對(duì)三個(gè)石斑魚(yú)群體進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，其擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示了DNA甲基化的三種不同類型的條帶，即“H/M”帶型為“1、1”(A)，“H/M”帶型為“1、0”(B)，“H/M”帶型為“0、1”(C)三種條帶類型.由圖5中可以看出，每個(gè)石斑魚(yú)群體的DNA甲基化帶型都非常豐富，三種DNA甲基化帶型均有出現(xiàn).

2.5 親子代間DNA的甲基化水平 8對(duì)引物對(duì)3個(gè)群體的擴(kuò)增結(jié)果顯示，棕點(diǎn)石斑魚(yú)、鞍帶石斑魚(yú)、雜種子一代擴(kuò)增出的總條帶數(shù)分別為5 117，6 270，6 300.其中，甲基化總條帶數(shù)分別為2 926，3 960，3 450.母本棕點(diǎn)石斑魚(yú)群體的甲基化率平均為57.18%，其中全甲基化率為31.66%，半甲基化率為25.52%；父本鞍帶石斑魚(yú)群體的甲基化率平均為63.16%，其中全甲基化率為39.71%，半甲基化率為23.44%；雜交子一代群體的甲基化率平均為54.76%；其中全甲基化率為40.00%，半甲基化率為14.76%(見(jiàn)表2).親子代間的DNA甲基化水平存在較大的差異.

3 討 論

3.1 DNA甲基化水平與雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)分析 DNA甲基化作為真核生物基因組重要的表觀遺傳學(xué)修飾，被認(rèn)為是雜種優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生的重要機(jī)制.1997年，Reyna-López等[10]首次報(bào)道了MSAP技術(shù)，近年來(lái)，該技術(shù)日益成熟，由于其操作簡(jiǎn)單和具有高效性，因此它已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組DNA甲基化水平的研究中.儀治本等[11]分析了三個(gè)高粱(Sorghum)雜交種及其相應(yīng)親本的DNA甲基化水平，結(jié)果顯示：這三個(gè)雜交種的DNA甲基化水平(41.8%，47.6%，48.7%)都低于雙親的DNA甲基化水平(51.4%～63.0%).李愛(ài)等[12]也在落葉松(Larix)中發(fā)現(xiàn)其正反交的優(yōu)勢(shì)雜交子代的DNA甲基化水平(20.46%，19.92%)顯著低于中親值(22.99%).劉天嬌[13]在玉米(ZeamaysL)雜交種中也發(fā)現(xiàn)其DNA甲基化水平顯著降低.在牛(Bostaurus)[14]、豬(Susdomesticus)[15]、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)和鯽魚(yú)(Carassiusauratus)[16]等動(dòng)物的雜種優(yōu)勢(shì)中也普遍存在DNA甲基化水平的改變.于濤等[17]在扇貝雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，母本櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的甲基化率為24.13%，父本蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)的甲基化率為32.79%，而雜交子一代的甲基化率為19.98%，子代的DNA甲基化率低于親本的DNA甲基化率.上述動(dòng)植物雜種優(yōu)勢(shì)的研究顯示，其雜種一代的甲基化程度比親本的甲基化程度低，由此認(rèn)為：甲基化程度的降低是雜種優(yōu)勢(shì)的原因之一[18-19].

表2 雜交親子代間的DNA甲基化水平比較

DNA甲基化與基因表達(dá)有關(guān)，雜交子一代在基因組水平上發(fā)生DNA甲基化水平的降低可能會(huì)導(dǎo)致部分沉默基因的開(kāi)啟，這種結(jié)果可能導(dǎo)致雜種的潛在適應(yīng)性提高，從而產(chǎn)生高于親本的優(yōu)勢(shì).本研究在棕點(diǎn)石斑魚(yú)、鞍帶石斑魚(yú)及雜交子一代中建立了MSAP方法的反應(yīng)體系，獲得了清晰、穩(wěn)定的擴(kuò)增圖譜.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，棕點(diǎn)石斑魚(yú)、鞍帶石斑魚(yú)、雜交子一代石斑魚(yú)的基因組DNA總甲基化率分別為57.18%，63.16%，54.76%，雜種子代的總甲基化率低于親本的總甲基化率.這與其他研究所發(fā)現(xiàn)的雜種一代的甲基化程度比親本的甲基化程度低的結(jié)果相一致，說(shuō)明在具備雜種優(yōu)勢(shì)的子代石斑魚(yú)中，其甲基化水平也顯著地降低，推測(cè)這有利于雜種優(yōu)勢(shì)的形成.

3.2 雜交優(yōu)勢(shì)與甲基化水平的關(guān)系存在物種差異 本文在石斑魚(yú)雜交子一代約6 000個(gè)位點(diǎn)的分析結(jié)果顯示，棕點(diǎn)石斑魚(yú)、鞍帶石斑魚(yú)、雜交子一代石斑魚(yú)的基因組DNA總甲基化率分別為57.18%，63.16%，54.76%.相較于部分動(dòng)植物的基因組DNA甲基化水平，如毛竹(Phyllostachysheterocyclavar.pubescens)[20](24.44%～32.12%)、泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[21](20.8%～24.1%)、背角無(wú)齒蚌(Anodontawoodiana)[22](35.5%～56%)，以及哺乳動(dòng)物如牛[14](33.1%～40.03%)、豬[15](40.6%～44.8%)等來(lái)說(shuō)，本文中的石斑魚(yú)群體的基因組DNA甲基化水平屬于程度較高的類群，盡管雜交子一代的甲基化水平仍然較高，但卻獲得了明顯的雜種優(yōu)勢(shì).實(shí)驗(yàn)得到石斑魚(yú)雜交子一代的半甲基化率(14.76%)顯著低于親本群體的半甲基化率(25.52%和23.44%)，然而其全甲基化率卻為40.00%，顯著高于母本的全甲基化率(31.66%)，與父本的全甲基化率(39.71%)相近.這不同于在扇貝[17]和牛[14]中所得到的雜交后代的全甲基化率(其低于親本)，但是與親子代間的DNA全甲基化水平均大于半甲基化水平這一結(jié)果相符合.這一方面說(shuō)明基因組DNA甲基化水平的高低存在物種的差異性；另一方面也提示雜種子代的DNA甲基化水平相對(duì)降低對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)更具意義.

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Methylation-sensitive Amplification Polymorphism Analysis of Genomic DNA Methylation onEpinepheluslanceolatus,Epinephelusfuscoguttatusand Their Hybrid Generation

Zhou Ying, Han Yulong, Luo Jian, Wang Qian, Chen Guohua

(State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan University, Haikou 570228, China)

To investigate the generation mechanism of heterosis in fish hybrids,Epinephelusfuscoguttatus,Epinepheluslanceolatusand their hybrids populations were used as the objects of research, methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) was used to analyze the DNA cytosine methylation of their genome. The results showed that the MSAP values of the three groups were 57.18%, 63.16%, and 54.76%, respectively. The full-methylation ratios of these populations were 31.66%, 39.71% and 40.00%, respectively, and the half-methylation ratios were 25.52%, 23.44%, and 14.76%, respectively. Compared with their parental lines, the DNA methylation level of the hybrids was changed significantly, and at the different sites, the heterosis of the groupers should benefit from the DNA methylation and DNA demethylation.

grouper; DNA methylation; MSAP; heterosis

2017-02-26

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A407)，海南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(ZDYF2016085).

周瑩(1992-)，女，河北邯鄲人，海南大學(xué)海洋學(xué)院2014級(jí)碩士研究生，E-mail:1499364556@qq.com

駱劍(1980-)，男，湖南衡山人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：魚(yú)類生殖與遺傳. E-mail:luojianfish@aliyun.com

1004-1729(2017)02-0145-07

S 917.4

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0026