姚 倩，高玲琳，姜亞磊，楊雨輝，王學(xué)梅

海南畜禽糞中四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的含量及其分布特征

姚 倩，高玲琳，姜亞磊，楊雨輝，王學(xué)梅

(海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228)

利用超聲波提取-固相萃取高效液相色譜法測定了海南省不同地區(qū)典型養(yǎng)殖場雞/豬糞便中2種四環(huán)素類(TCs)和2種大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)抗生素的含量與分布特征.結(jié)果表明：四環(huán)素類化合物的平均總含量和檢出率均高于大環(huán)內(nèi)酯類化合物的平均總含量和檢出率.在豬糞中，四環(huán)素類化合物的總含量在0～8 460.8 μg·kg-1之間，平均為385.4 μg·kg-1，檢出率最低為53.2%，以土霉素為主；而大環(huán)內(nèi)酯類化合物的總含量在0～1 052.8 μg·kg-1之間，平均為46.9 μg·kg-1，檢出率最低為25.9%，以泰樂菌素為主.在雞糞中，四環(huán)素類化合物的總含量在0～2 839.3 μg·kg-1之間，平均為159.3 μg·kg-1，檢出率最低為57.1%，以金霉素為主；而大環(huán)內(nèi)酯類化合物的總含量在0～845.2 μg·kg-1之間，平均為28.1 μg·kg-1，檢出率最低為14.3%，以北里霉素為主.在豬糞和雞糞中兩類化合物的分布特征存在差異，豬糞中兩類抗生素的總含量均較高的地區(qū)為瓊海市和臨高縣，雞糞中兩類抗生素的總含量均較高的地區(qū)為儋州市和瓊海市.

畜禽糞； 四環(huán)素類； 大環(huán)內(nèi)酯類； 抗生素； 殘留

獸用抗生素是用于動物疾病的預(yù)防和治療，以加快其生長和提高其經(jīng)濟(jì)效益的一類物質(zhì)，其中四環(huán)素類(TCs)和大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)抗生素近年來被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[1-2].研究表明，抗生素在動物體內(nèi)只有少部分被吸收和利用，絕大部分則未被代謝而隨排泄物進(jìn)入污水或環(huán)境中[3].由于排泄物中的抗生素含量普遍較高，因此它現(xiàn)在已成為環(huán)境污染的重要來源[4].這些糞便80%以上未進(jìn)行分解就被直接施用于菜地、果園和農(nóng)田[5]，這既破壞了土壤微生物的平衡[6]，又促進(jìn)了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[7]，它被農(nóng)作物吸收和積累后[8]，會造成食品的抗生素污染[9]，最終危害人類的健康.

海南省作為一個農(nóng)業(yè)省份，畜牧業(yè)在其中發(fā)揮著重要的作用，所以畜禽糞便中抗生素的殘留問題是不容忽視的，然而目前有關(guān)海南省畜禽糞中抗生素殘留的狀況卻鮮有報道.為此，本研究針對畜牧養(yǎng)殖中普遍使用的四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，分析了在海南省不同地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)殖場中抗生素在雞/豬糞便中的殘留情況，旨在為控制抗生素污染和評估農(nóng)業(yè)環(huán)境提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)[4].

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 高效液相色譜儀(型號為LC-20AD)，配有紫外檢測器(型號為SPD-M20A)，自動進(jìn)樣器(型號為SIL-20A)，購自SHIMADZU公司；電子天平(型號為XPE105)，購自METTLER TOLEDO公司；隔膜真空抽濾機(jī)(型號為GM-0.5A)，購自天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；氮氫空發(fā)生器(型號為QPT-300Ⅱ)，購自上海全浦科學(xué)儀器有限公司；Waters Oasis HLB固相萃取小柱，購自海南一鼎生物科技有限公司；超聲波清洗器(型號為SB-80)，購自上海卓博精密機(jī)械有限公司；高速冷凍離心機(jī)(型號為Centrifuge5418)，購自Eppendorf公司.

金霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥94.6%)、北里霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥92.0%)、泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥96%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；土霉素對照品(純度≥88.8%)，購自中國藥品生物制品檢定所.甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，均購自TEDLA公司；磷酸二氫鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉等均為國產(chǎn)分析純.

抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取各種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于甲醇中，并定容至10 mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，于4℃保存，然后按需要稀釋成各質(zhì)量濃度梯度.

1.2 樣品采集 雞和豬糞便見表1，其采自海南省不同地區(qū)的雞/豬養(yǎng)殖場，共126份樣品，其中雞糞便49份，豬糞便77份.新鮮樣品經(jīng)冷凍(-80℃)、干燥、粉碎、篩濾(80目)后備用.

表1 畜禽糞便樣品

1.3 樣品的預(yù)處理 抗生素的提取：取1.00 g處理后的糞樣溶于10 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液中，超聲20 min，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，反復(fù)2次，合并上清液，每個樣品設(shè)定2組平行.

固相萃?。罕?、甲醇、超純水各5 mL活化HLB小柱，上清液過柱(5 mL·min-1)，先以φ=5%的甲醇水溶液(8 mL)沖洗小柱，然后用二氯甲烷(10 mL)洗脫，接著用氮氣(40℃)吹至近干，將其溶于1 mLφ=20%的甲醇水溶液中，最后用有機(jī)濾膜(0.22 μm)過濾，待測.

1.4 高效液相色譜的分析條件和質(zhì)量控制 Hypersil BDS C18色譜柱(5 μm，4.6 m×250 mm)，柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A為0.01 mol·L-1的磷酸二氫鈉溶液，B為乙腈，流速為1.0 mL·min-1；梯度洗脫程序：流動相B開始占比為22%，7 min時上升到80%，10 min時降到22%，全程運(yùn)行10 min.

將混合標(biāo)準(zhǔn)品母液以二倍稀釋法逐級稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)梯度質(zhì)量濃度為5 000，2 500，1 250，625，312，156 ng·mL-1的4種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程的R2都大于0.999(見表2).測得樣品在三個添加水平下的回收率為76.9%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～7.7%，檢測限為0.02～0.05 μg·kg-1.樣品檢測色譜圖見圖1.

表2 抗生素的液相色譜分析和線性方程

2 結(jié)果與分析

2.1 豬糞中四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留特征

2.1.1 含量特征 由表3可見，在豬糞樣品中，四環(huán)素類化合物的總含量在0～8 460.8 μg·kg-1之間，平均含量為385.4 μg·kg-1，最低檢出率為53.2%，其中土霉素被檢出的平均含量和檢出率均高于金霉素被檢出的平均含量和檢出率；大環(huán)內(nèi)酯類化合物的總含量在0～1 052.8 μg·kg-1之間，平均為46.9 μg·kg-1，最低檢出率為25.9%，其中，泰樂菌素被檢出的平均含量和檢出率均高于北里霉素被檢出的平均含量和檢出率.由此可知，四環(huán)素類化合物的平均含量和檢出率均高于大環(huán)內(nèi)酯類的平均含量和檢出率，因此其污染程度也高于大環(huán)內(nèi)酯類化合物的污染程度.

表3 豬糞(干重)中四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的含量 μg·kg-1

注：ND為未檢出，以數(shù)值0計算.

2.1.2 空間分布特征 圖2為不同地區(qū)豬糞中四環(huán)素類抗生素總含量的空間分布特征，由圖2可知，不同地區(qū)豬糞中四環(huán)素類總含量由高到低的順序為：瓊海市>屯昌縣>臨高縣>萬寧市>儋州市>昌江縣>東方市>三亞市>陵水市>樂東縣，其中，瓊海市、屯昌縣、臨高縣均高于500 μg·kg-1，三亞市、陵水市、樂東縣的總含量大體相當(dāng)，且均低于300 μg·kg-1.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總含量的空間分布特征見圖3，其總含量由高到低的順序為：臨高縣>萬寧市>瓊海市>屯昌縣>樂東縣>三亞市>昌江縣>陵水市>儋州市 >東方市，其中，臨高縣和萬寧市的總含量相對較高，均高于70 μg·kg-1，樂東縣、三亞市、昌江縣、陵水市的總含量大體相當(dāng)，含量均在40 μg·kg-1左右.因此，在瓊海市和臨高縣豬糞中，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總含量較高，在陵水市和東方市的豬糞中，四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總含量則較低.

2.2 雞糞中四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留特征

2.2.1 含量特征 由表4可見，在雞糞樣品中，四環(huán)素類化合物的總含量在0～2 839.3 μg·kg-1之間，平均含量為159.3 μg·kg-1，最低檢出率為57.1%，其中，金霉素的平均含量低于土霉素的平均含量，而其檢出率卻高于土霉素的檢出率；大環(huán)內(nèi)酯類化合物的總含量在0～845.2 μg·kg-1之間，平均含量為28.1 μg·kg-1，最低檢出率為14.3%，其中，北里霉素的平均含量和檢出率較泰樂菌素的高.由此可知，四環(huán)素類化合物的平均含量和檢出率均較大環(huán)內(nèi)酯類化合物的高，因此，其污染程度也高于大環(huán)內(nèi)酯類化合物的污染程度.

表4 雞糞(干重)中四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類化合物的含量 μg·kg-1

注：ND為未檢出，以數(shù)值0計算.

2.2.2 空間分布特征 在不同地區(qū)的雞糞中，四環(huán)素類抗生素的總含量的空間分布特征見圖4.由圖4可知，四環(huán)素類抗生素的總含量由高到低的順序為：儋州市>屯昌縣>瓊海市>臨高縣>昌江縣>萬寧市.其中，儋州市的總含量高于200 μg·kg-1，屯昌縣、瓊海市、臨高縣和昌江縣的總含量大體相當(dāng)，均在150 μg·kg-1左右.不同地區(qū)雞糞中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總含量的空間分布特征見圖5，其總含量由高到低的順序為：儋州市>瓊海市>萬寧市>屯昌縣>臨高縣>昌江縣.儋州市和瓊海市的總含量大體相當(dāng)，均高于40 μg·kg-1，而臨高縣和昌江縣均低于20 μg·kg-1.因此，在儋州市和瓊海市的雞糞中，其四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總含量均較高，在臨高縣和昌江縣的雞糞中，其四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的總含量均較低.

3 討 論

本研究調(diào)查了海南省不同地區(qū)典型養(yǎng)殖場雞/豬糞便中2種四環(huán)素類(TCs)和2種大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)抗生素的污染特征.相關(guān)研究表明[10～12]，糞便中各類抗生素的含量最高能達(dá)到mg·kg-1級，在研究中，僅四環(huán)素類抗生素的最高檢出含量能達(dá)到mg·kg-1級，而大環(huán)內(nèi)酯類的含量相對較低，其含量的差異可能與畜禽飼養(yǎng)中用藥方案的不同有關(guān).根據(jù)農(nóng)業(yè)部168公告——《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》，常用抗生素在作為飼料藥物添加劑以助生長時，其含量較低，而當(dāng)其被用于疾病治療時，其添加量則較高，以北里霉素為例，在雞飼料中作為促生長的添加劑時，其重量百分濃度為5×10-6～11×10-6，而在其被用于疾病治療時，其重量百分濃度高達(dá)1×10-4～3.3×10-4；在豬飼料中作為促生長添加劑時，其重量百分濃度為5×10-6～5.5×10-5，而在其被用于疾病治療時，其重量百分濃度卻高達(dá)8×10-5～3.3×10-4，因此，不同的用途會導(dǎo)致畜禽糞便中抗生素含量的不同.此外，對于不同生長期的豬與不同種類的雞，其用藥方案不同也會導(dǎo)致糞便中抗生素的含量和種類出現(xiàn)差異，如哺乳豬和斷奶仔豬，由于其免疫力和抵抗力較弱，容易感染細(xì)菌性疾病，因此在飼養(yǎng)過程中，抗生素使用的種類和數(shù)量較多，使用周期較長，使用頻率亦較高，從而致使其糞便中抗生素的含量相對較高，種類也相對較多；又如育肥豬，由于其免疫力和抵抗力較強(qiáng)，因而其感染細(xì)菌性疾病的幾率較小，同時抗生素對其的促生長作用較弱，此時，為了減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，一般使用較少，故其糞便中所檢測出的抗生素的含量和種類相對于仔豬要少；對于孕期母豬，用藥方案通常較為謹(jǐn)慎，一般在細(xì)菌感染后，多用中草藥和其他治療方法，因此，其糞便中抗生素的含量和種類相對較低或較少[13].在肉雞和蛋雞飼料中添加抗生素均可提高生產(chǎn)性能，但使用于肉雞多為了增重，而使用于蛋雞則多為提高產(chǎn)蛋率.總之，為了達(dá)到不同目的和提高經(jīng)濟(jì)效益，常會采用不同的用藥方案，這些均會導(dǎo)致糞便中抗生素的含量和種類不同.

由于地理環(huán)境的差異，不同地區(qū)會采用不同的養(yǎng)殖方式，因此其畜禽糞便中抗生素的含量亦有所差異.在本文所調(diào)查的地區(qū)，其養(yǎng)殖方式多為散養(yǎng)和圈養(yǎng)，散養(yǎng)的畜禽大多是從自然界中獲得新鮮的草料以及活蟲來作為食物，其活動量大，肉質(zhì)鮮美，但容易感染細(xì)菌性疾病，且多用抗生素來治療，這種養(yǎng)殖方式的糞便不集中，難處理，會對環(huán)境造成污染；而圈養(yǎng)畜禽多以飼料為食物，其活動量小，消耗少，增膘快，而且為提高經(jīng)濟(jì)效益，其飼料中多添加抗生素以促進(jìn)生長和預(yù)防疾病，因此在不同養(yǎng)殖方式下的畜禽糞便中，抗生素的含量會有所不同.

抗生素隨糞便進(jìn)入環(huán)境后大多數(shù)都不會被處理，它通常是隨著糞便被直接作為糞肥而施于農(nóng)田、果園和菜園，并隨農(nóng)田灌溉系統(tǒng)進(jìn)入土壤和地下水環(huán)境，也可經(jīng)雨水淋洗而進(jìn)入河流或湖泊等水體，從而對土壤和水體造成污染[14].Batt等的研究發(fā)現(xiàn)，糞肥施于土壤22天后，在土壤表層0～5 cm處就能檢測到四環(huán)素類抗生素的存在，且其含量高達(dá)281.34 mg·kg-1[15].Kong等的研究表明，抗生素會對土壤環(huán)境中微生物群落的多樣性帶來負(fù)面影響[16].微生物群落多樣性的減少會導(dǎo)致土壤和糞肥中的有機(jī)質(zhì)不能更好地腐爛和分解，從而影響土壤的肥力，使植物的生長受到抑制，甚至死亡，最終打破原有的生態(tài)平衡[17].進(jìn)入水體中的抗生素會破壞水中的微生物平衡，同時它還會對水中生物的生長造成影響.Sanderson等研究了226種抗生素對水生生物的危害性，結(jié)果表明：抗生素對藻類、大型溞、魚類等都具有毒性，但對不同物種其毒性程度不同[18].環(huán)境中的細(xì)菌長期在低濃度抗生素的壓迫下，其基因容易發(fā)生突變，從而產(chǎn)生耐藥性[19].耐藥菌質(zhì)粒在不同生物之間的水平傳播會使環(huán)境易獲得具有該質(zhì)粒的細(xì)菌而產(chǎn)生耐藥性，而這些耐藥菌以病原體的形式感染人體后會影響對人體疾病的治療[20].所以，在飼養(yǎng)過程中若不遵守休藥期或長期使用抗生素作為飼料添加劑，那么就會導(dǎo)致動物性食品的藥物殘留，當(dāng)人長期食用具有藥物殘留的肉、蛋等動物性食品時，其腸道微生物平衡會遭到破壞，同時其腸道細(xì)菌也可能產(chǎn)生耐藥性，這會增加治療人類細(xì)菌性疾病的難度，同時也可能會引起一系列的其他疾病，如器官病變等，此外，對于具有過敏體質(zhì)的個體，低劑量的藥物殘留還可能引起變態(tài)反應(yīng)，也可能使青少年生長發(fā)育受到影響[21].

4 結(jié) 論

在海南省的畜禽糞便中，四環(huán)素類化合物的平均總含量和檢出率均高于大環(huán)內(nèi)酯類化合物的平均總含量和檢出率.在豬糞和雞糞中，這兩類化合物的空間分布特征存在差異，豬糞中這兩類抗生素的總含量均較高的地區(qū)為瓊海市和臨高縣；雞糞中這兩類抗生素的總含量均較高的地區(qū)為儋州市和瓊海市.為避免抗生素殘留對環(huán)境以及人體造成危害，必須加強(qiáng)抗生素的管理和使用規(guī)范，應(yīng)建立起一套藥物殘留的監(jiān)控體系，制定違規(guī)的相應(yīng)處罰手段，同時應(yīng)探索安全、高效和經(jīng)濟(jì)的飼料添加劑，這一點顯得尤為重要.但考慮到目前抗生素殘留的檢測方法和步驟較為繁瑣、資金花費也較大，因此建議使用高溫堆肥[22]，這樣故可降低糞便中抗生素的含量，此外，還可根據(jù)不同類型抗生素的性質(zhì)，優(yōu)化堆肥的過程和條件，培育、馴化和篩選出耐高溫的抗生素降解菌，以此來提高抗生素的降解效率.

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Distribution Characteristic of Tetracycline and Macrolide Antibiotics Contents in Swine and Chook Manures of Hainan Province

Yao Qian, Gao Linglin, Jiang Yalei, Yang Yuhui, Wang Xuemei

(College of Tropical Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China)

In the report, solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) were performed to detect the occurrence and distribution of two tetracyclines and two macrolides in swine and chook feces sampled from large scale feeding operations in different areas of Hainan province. The results indicated that the average content and detection rate of tetracyclines compounds were higher than that of macrolides. The total concentrations of tetracyclines ranged from 0 μg·kg-1to 8 460.8 μg·kg-1(F. W.) with an average of 385.4 μg·kg-1, the lowest detection rate was 53.2% in all swine dung samples. The dominant compounds in swine manures were oxytetracycline. The total concentrations of macrolides ranged from 0 μg·kg-1to 1 052.8 μg·kg-1(F. W.) with an average of 46.9 μg·kg-1, the lowest detection rate was 25.9% in all swine dung samples. The dominant compound in swine manures was tylosin. The total concentrations of tetracyclines ranged from 0 μg·kg-1to 2 839.3 μg·kg-1(F. W.) with an average of 159.3 μg·kg-1, the lowest detection rate was 57.1%. The dominant compound in chook manures was aureomycin. And macrolides ranged from 0 μg·kg-1to 845.2 μg·kg-1(F. W.) with an average of 28.1 μg·kg-1, the lowest detection rate was 14.3% in all chook dung samples. The dominant compound in chook manures was kitasamycine. There were significant differences among the distribution characteristics of both compounds in swine and chook dungs, the amounts of two kinds of antibiotics in swine dungs from Qionghai and Lingao were higher than that of other places in Hainan, the amounts of two kinds of antibiotics in chook dungs from Danzhou and Qionghai were higher than that of other places in Hainan.

manures; tetracyclines; macrolides; antibiotics; remain

2017-02-24

海南省科技廳“產(chǎn)、學(xué)、研一體化”項目(cxy20150021)

姚倩(1992- )，女，山西運(yùn)城人，海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院2015級碩士研究生，E-mail: 996714594@qq.com

楊雨輝(1971- )，男，黑龍江綏化人，博士、教授，研究方向為獸醫(yī)藥理與毒理，E-mail: yanguniverse@sina.com

1004-1729(2017)02-0152-07

X592

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0024