郭瑛 韓冰 王麗 孫華麗 劉貴明 蔣榮猛

數(shù)字PCR技術(shù)在布魯菌病療效判定中的應(yīng)用價值

郭瑛 韓冰 王麗 孫華麗 劉貴明 蔣榮猛

目的 探討數(shù)字PCR技術(shù)檢測血清布魯菌含量對療效判定的應(yīng)用價值。方法 選擇2015年1月至2016年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院收治的15例布魯菌病恢復(fù)期患者，即布魯菌病急性期患者經(jīng)過規(guī)范抗生素治療6周后仍有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀的患者為研究對象，用數(shù)字PCR技術(shù)檢測血清布魯菌含量，并同時做血培養(yǎng)和布魯菌凝集試驗，比較三種試驗結(jié)果。結(jié)果 15例患者布魯菌病恢復(fù)期患者血清凝集試驗結(jié)果均為陽性，14例患者未在血清中檢測出布魯菌DNA，僅有1例患者血清布魯菌DNA定量檢測結(jié)果為陽性，并且血培養(yǎng)陽性。剩余14例患者血培養(yǎng)陰性。結(jié)論 數(shù)字PCR技術(shù)為發(fā)現(xiàn)和確診布魯菌病現(xiàn)癥感染病例提供了快速、快捷的方法，但仍需大樣本進(jìn)行驗證。

布魯菌病；數(shù)字PCR技術(shù)

布魯菌病是一種古老的人畜共患性疾病，由布魯菌感染引起，以長期發(fā)熱、肝脾大、關(guān)節(jié)疼痛和慢性化為特征的人畜共患傳染病，曾被命名為波狀熱和地中海熱。在世界范圍內(nèi)均有分布。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年新增約50萬病例[1]。我國主要流行于內(nèi)蒙古自治區(qū)、吉林省、黑龍江省、新疆維吾爾自治區(qū)、西藏自治區(qū)等。布魯菌病有多種傳播途徑，臨床表現(xiàn)多樣，病程可長達(dá)數(shù)月至數(shù)年。部分布魯菌病患者在治療過程中或治療后，仍有自覺布魯菌病癥狀，如發(fā)熱、乏力、盜汗和肌肉關(guān)節(jié)痛等。此時，早期正確鑒別診斷是治療失敗、復(fù)發(fā)還是重新感染是后續(xù)治療成功的關(guān)鍵。目前，布魯菌病實驗室診斷技術(shù)缺乏快速、簡便的方法，仍以分離培養(yǎng)和血清凝集試驗、補體結(jié)合試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗為主要檢測手段。布魯菌分離培養(yǎng)是實驗室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上主要采用血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)。但是培養(yǎng)陽性率低，要求條件高，且存在生物安全性風(fēng)險，臨床因?qū)嶒炇覘l件限制不能常規(guī)開展。在我國，臨床常規(guī)開展的血清凝集試驗主要為虎紅平板凝集試驗(RBT)和試管凝集試驗。RBT主要檢測血清中總抗體，技術(shù)簡單，價格便宜，被廣泛作為初篩試驗使用。陽性診斷價值較低，對于沒有布魯菌暴露危險因素患者診斷價值較高，對于反復(fù)暴露和既往感染患者診斷價值有限。試管凝集試驗(SAT)常被用作布魯菌病的診斷技術(shù)，主要檢測IgG、IgM和IgA。但是各國具有診斷意義的抗體滴度標(biāo)準(zhǔn)不一致，未找到合適的抗體滴度診斷標(biāo)準(zhǔn)，且慢性期敏感性較低。補體結(jié)合試驗(Coombs)主要檢測血清中不完全和非凝集抗體，作為SAT的補充。Coombs在慢性期和復(fù)發(fā)患者中診斷價值優(yōu)于血清凝集試驗，敏感性和特異性較高。但該項檢測方法操作復(fù)雜、耗時，需要一定的設(shè)備，難以在臨床常規(guī)開展。ELISA能夠檢測血清中IgM和IgG抗體。單獨檢測IgM抗體可為急性期患者提供可靠的診斷，但是，當(dāng)患者體內(nèi)存在高滴度的IgG抗體時，干擾對IgM抗體的檢出。不僅如此，類風(fēng)濕因子也可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。PCR技術(shù)自出現(xiàn)以來，被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷。美國指南推薦PCR技術(shù)作為布魯菌病診斷初篩試驗，以IS711為引物的PCR試驗被廣泛應(yīng)用于檢測血清中布魯菌含量，應(yīng)用前景廣闊。但普通PCR技術(shù)檢測敏感性低，且為相對定量，結(jié)果不夠精確。布魯菌血培養(yǎng)技術(shù)耗時、陽性率低，且存在生物安全風(fēng)險。布魯菌血清凝集試驗、補體結(jié)合試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗和普通PCR技術(shù)均存在一定的局限性。本文初步探討利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測血清布魯菌DNA含量對布魯菌病恢復(fù)期的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院收治的15例布魯菌病恢復(fù)期患者，即布魯菌病急性期患者經(jīng)過規(guī)范抗生素治療6周后仍有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀的患者。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 符合布魯菌病急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)：①流行病學(xué)史：發(fā)病前與家畜和畜產(chǎn)品、布魯菌培養(yǎng)物等有密切接觸史，或生活在布魯菌病流行區(qū)的居民等。②有發(fā)熱、乏力、多汗、肌肉和關(guān)節(jié)痛，或伴有肝、脾和淋巴結(jié)腫大等臨床表現(xiàn)。③實驗室分離出布魯菌，試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗或布魯菌病抗人-球免疫球蛋白試驗陽性。④病史≤6個月。

1.2.2 非急性期：符合布魯菌病急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)，并接受抗生素治療6周后，仍有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀的患者。

1.3 數(shù)字PCR試驗方法

1.3.1 主要試劑:血液DNA提取試劑盒購自qiagen公司，QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，微滴發(fā)生卡(DG8TM Cartridges)，微滴發(fā)生油(QX200TM Droplet Generation Oil for EvaGreen)購自伯樂公司，引物在上海生工公司合成。

1.3.2 數(shù)字PCR:引物針對IS711基因設(shè)計[2]，擴增產(chǎn)物長度252 bp,引物序列如下，BF:CATGCGCTATGTCTGGTTAC；BmR：AGTGTTTCGGCTCAGAATAAT。模板DNA提取按照試劑盒的說明書。布魯菌基因組DNA由中國疾控中心布病室贈予。實驗設(shè)計包括空白對照孔，陽性對照孔，陰性對照孔，樣品孔?？瞻讓φ湛啄０逵脽o菌水替代，陽性對照孔模板是布魯菌的基因組DNA，陰性對照孔模板是健康人基因組DNA，樣品孔模板是15名患者血清提取的DNA。

1.3.3 配制數(shù)字PCR反應(yīng)體系:Eva Green Supermix 12 μl,模板DNA 33 ng，上下游引物2 pmol，加水至24 μl。吸取20 μl轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡的sample行(中間行)，油滴行加入70 μl微滴發(fā)生油，蓋上膠墊后，平穩(wěn)放置在微滴生成儀中，開始生產(chǎn)微滴。將生成微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板，反應(yīng)條件：95℃ 變性5 min，95℃30 s，57℃ 60 s，40個循環(huán)，4℃ 5 min，90℃ 5 min，4℃保存。將反應(yīng)完成的96孔板平穩(wěn)放入微滴讀取儀中，打開quanta soft軟件，輸入樣品信息后，點擊run。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 15例布魯菌病恢復(fù)期患者中，男5例，女10例;年齡21～56歲。布魯菌乳膠凝集試驗由北京地壇醫(yī)院完成，本組病例均為陽性。血培養(yǎng)陽性1例。

2.2 流行病學(xué)史 15例患者均來自疫區(qū)或從事畜牧業(yè)相關(guān)工作。

2.3 臨床表現(xiàn) 15例患者有明顯的布魯菌病自覺癥狀，主要為發(fā)熱、腰痛肌肉和關(guān)節(jié)痛、乏力等。見表1。

2.4 血清布魯菌定量檢測 有自覺癥狀的15例布魯菌病恢復(fù)期患者中，1例血清布魯菌DNA定量明顯升高，2.34拷貝/μl，且血培養(yǎng)陽性。其余患者均未檢測出布魯菌DNA。

表1 15例布魯菌病恢復(fù)期患者的臨床癥狀

3 討論

布魯菌病經(jīng)過規(guī)范6～8周抗生素治療后，95%的患者病情有不同程度的好轉(zhuǎn)，進(jìn)入恢復(fù)期。然而，少部分患者仍自覺有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀，如發(fā)熱、乏力、盜汗、腰痛和關(guān)節(jié)痛等。此時，需要對布魯菌病恢復(fù)期患者進(jìn)行正確診斷，鑒別是治療失敗、復(fù)發(fā)還是重新感染，將決定臨床醫(yī)生的治療決策。目前，診斷布魯菌病主要依靠分離培養(yǎng)和凝集試驗、補體結(jié)合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和普通PCR技術(shù)。

布氏桿菌分離培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上主要采用血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)。據(jù)統(tǒng)計，急性期患者血培養(yǎng)敏感性為18.4%～90%，慢性期敏感性差，30%～70%[3-5]。骨髓培養(yǎng)比血培養(yǎng)靈敏度高，尤其是對已經(jīng)應(yīng)用抗生素患者[6]。培養(yǎng)陽性率主要取決于疾病分期、抗生素應(yīng)用和培養(yǎng)方法等[7]。

布氏桿菌分離培養(yǎng)存在生物安全性問題。據(jù)不完全統(tǒng)計，在過去的25年中，實驗室布氏桿菌感染率為18%～31%[8]。目前僅應(yīng)用于科研，臨床因?qū)嶒炇覘l件限制不能常規(guī)開展。

RBT主要檢測血清中總抗體，技術(shù)簡單，價格便宜，被廣泛作為初篩試驗使用。Skendros等[9]研究顯示，在急性期，RBT敏感性接近100%，特異性87.5%，陰性預(yù)測值接近100%，而陽性預(yù)測值只有11.4%。然而，Arabaci等[10]對急性期患者研究發(fā)現(xiàn)，RBT敏感性48.1%，特異性96.1%,陽性預(yù)測值為1，陰性預(yù)測值低于0.5。由此可見，不同地區(qū)RBT急性期診斷價值存在差異。Al Dahouk等[11]認(rèn)為，慢性期RBT敏感性差，約70%?？傮w而言，RBT對于沒有布氏桿菌暴露危險因素患者診斷價值較高，對于反復(fù)暴露和既往感染患者診斷價值有限[12]。

SAT常被用作布魯菌病的診斷技術(shù)，主要檢測IgG、IgM和IgA。WHO指南推薦其為初篩試驗，我國指南認(rèn)定為確診試驗。但是，無論作為初篩試驗，還是確診試驗，SAT均存在一定問題：(1)具有診斷學(xué)意義的抗體滴度尚未確定。WHO指南推薦SAT≥1∶160為布魯菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)。我國指南規(guī)定急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)為SAT滴度≥1∶100，慢性期≥1∶50。(2)敏感性一般。據(jù)統(tǒng)計，SAT在急性期診斷敏感性從37.4%～90%[10,13]不等。慢性期敏感性差，為27.5%[14]。但恢復(fù)期SAT滴度較急性期升高4倍或以上，診斷價值較高[15]。

Coombs主要檢測血清中不完全和非凝集抗體，作為SAT的補充。Coombs在慢性期和復(fù)發(fā)患者中診斷價值優(yōu)于血清凝集試驗，敏感性和特異性較高。不僅如此，Roushan等[6,10]研究認(rèn)為，Coombs對于急性期診斷價值優(yōu)于SAT、RBT和ELISA等。腦脊液Coombs對于合并腦膜炎患者診斷價值較大[14,16]。但該項檢測方法操作復(fù)雜、耗時，需要一定的設(shè)備，難以在臨床常規(guī)開展。

ELISA能夠檢測血清中IgM和IgG抗體。Roushan等[6,10]研究顯示，單獨檢測IgM抗體可為急性期患者提供可靠的診斷，敏感性和特異性與SAT和Coombs相近。但是，單一檢測血清中布氏桿菌抗體，可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果[16,17]。例如，當(dāng)患者體內(nèi)存在高滴度的IgG抗體時，干擾對IgM抗體的檢出。不僅如此，類風(fēng)濕因子也可導(dǎo)致假陰性結(jié)果，試驗前應(yīng)將其除去。ELISA對慢性期和復(fù)發(fā)患者的診斷價值優(yōu)于SAT，與Coombs相似，但試驗方法更為簡單[15,18]。

當(dāng)前，用編碼BCSP31設(shè)計的B4/B5引物常被用于人布魯菌病診斷。Casanova等[17,19]研究發(fā)現(xiàn)，診斷布魯菌病急性期敏感性為98.3%，特異性為100%。對慢性期和復(fù)發(fā)患者也有一定診斷價值[20]。Fadeel等[18,21]報道了一個多重PCR實驗(Bruce-ladder)用于從種水平上鑒定所有布氏桿菌，包括布氏桿菌的6個陸生種、海洋種和疫苗株S19、RB51、Revl。另有研究對比了分別以IS711、bcsp31、per設(shè)計的探針和引物的實時PCR，結(jié)果證明依據(jù)IS711設(shè)計引物和探針的PCR在鑒別布氏桿菌時表現(xiàn)最好的靈敏性、特異性、高效性和重復(fù)性[19,22]。Castano等[20,23]研究顯示，在布魯菌病流行地區(qū)，用以B4/B5為引物的傳統(tǒng)PCR作為布魯菌病初篩試驗，以IS711為引物的實時PCR作為確證試驗，不僅可用于布魯菌病診斷，還可鑒定種型，具有廣闊應(yīng)用前景。

目前，我國布魯菌病實驗室診斷主要依靠RBT初篩，SAT進(jìn)行確診。但是，SAT試驗作為確診試驗存在不足，表現(xiàn)在：(1)無論急性期還是慢性期，具有診斷價值的抗體滴度閾值尚未確定，缺乏大規(guī)模樣本驗證。(2)在疾病早期，由于抗體合成需要至少1周時間，SAT滴度可能<1∶160[3,4,23]。因此，對于急性期患者，一份SAT檢測結(jié)果滴度<1∶160，不能除外布魯菌病。臨床高度懷疑布魯菌病應(yīng)在1～2周后復(fù)查。(3)SAT對于慢性期診斷特異性一般。32%的患者即使經(jīng)過正規(guī)治療，隨訪1年后，SAT滴度仍≥1∶80[12]。因此，布魯菌診斷必須結(jié)合患者病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查進(jìn)行綜合判定。當(dāng)前，開展新型實驗室診斷技術(shù)迫在眉睫。

PCR技術(shù)作為病原學(xué)檢測技術(shù)已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用于臨床。第一代PCR技術(shù)通常采用電泳的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，存在操作繁瑣，容易出現(xiàn)交叉污染，只適用于定性研究等局限。為了克服傳統(tǒng)PCR的不足，并滿足生物學(xué)研究中對核酸定量分析的要求，1992年誕生了第二代PCR，即熒光定量PCR。熒光定量PCR在PCR擴增的同時對反應(yīng)體系中引入的熒光信號進(jìn)行實時檢測分析，通過三個參數(shù)(熒光信號、-Cq值、DNA模板起始濃度)間的關(guān)系，確定靶標(biāo)基因相對于外部參照(標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ諛颖?的含量或表達(dá)水平。由于熒光定量PCR的結(jié)果曲線依賴-Cq值、PCR擴增效率和參照系，2009年由科學(xué)家們協(xié)商制訂的定量PCR實驗指南明確了定量PCR試驗流程標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的必要性；更具意義的是指南還給出了規(guī)范定量PCR流程和質(zhì)控環(huán)節(jié)的check-list，其核心目標(biāo)旨在規(guī)范各實驗室的數(shù)字PCR技術(shù)流程，統(tǒng)一試驗技術(shù)思路、保證熒光定量PCR試驗信息的透明度，以確保定量PCR試驗結(jié)果的重復(fù)性、可靠性。然而對于-Cq值、PCR擴增效率和參照系的依賴仍是定量PCR技術(shù)的最大技術(shù)瓶頸，在這個意義上的定量也只能是相對的、間接的。而且在靶核酸分子風(fēng)度低、樣本間模板濃度差異細(xì)微的情況下，定量PCR的檢測靈敏度和精確度都受到了限制，已不能滿足臨床實驗室診斷的要求。

在這樣的背景下，第三代PCR技術(shù)應(yīng)運而生。QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)屬于第三代PCR技術(shù)。QX200微滴發(fā)生器可將含有核酸分子的熒光PCR反應(yīng)體系分割成數(shù)萬個納升級的微滴，核酸分子在各微滴中隨機分級，每個微滴或不含特檢核酸靶分子，或者至少一個待檢核酸靶分子，且每個微滴都是一個獨立的PCR反應(yīng)器。經(jīng)PCR擴增后，QX200微滴分析儀逐個對每個微滴進(jìn)行檢測，有熒光信號的微滴判讀為“1”，沒有熒光信號的微滴判讀為“0”，從而將熒光模擬信號數(shù)字化，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。最終根據(jù)泊松分布原理及陽光微滴的比例，分析軟件可直接給出待檢靶分子的拷貝數(shù)濃度，上述過程中熒光信號產(chǎn)生原理與定量PCR相同，可以采用具有序列特異性TapMan探針，也可以采用成本更低的新型核酸嵌入式染料-EvaGreen，因此，定量PCR與數(shù)字PCR的銜接是無縫的。

全新的數(shù)字化終點檢測方式和分子技術(shù)的定量手段，賦予QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)卓越的性能，即無需標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照，對影響PCR效率的抑制物不敏感，大大提高了檢測靈敏度、精確度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，并實現(xiàn)了真正意義上的絕對定量。數(shù)字PCR技術(shù)較普通PCR技術(shù)而言，敏感性更高，且能夠定量，是今后早期快速檢測布魯菌的發(fā)展方向。

本研究初步探討分析15例布魯菌恢復(fù)期病例的臨床資料和數(shù)字PCR檢測血清布魯菌DNA定量檢測結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，15例患者布魯菌血清凝集試驗結(jié)果均為陽性，說明凝集試驗抗體可能為既往感染后產(chǎn)生的IgG抗體，并不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染。14例患者未在血清中檢測出布魯菌DNA，僅有1例患者血清布魯菌DNA定量檢測結(jié)果為陽性，說明部分布魯菌病恢復(fù)期患者血清中布魯菌含量很低或不存在。因此，對于規(guī)范治療進(jìn)入恢復(fù)期仍然有自覺癥狀的患者，可以利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測血清布魯菌DNA的含量，為布魯菌病的后續(xù)治療提供依據(jù)。同時，數(shù)字PCR檢測血清布魯菌DNA陽性患者，血培養(yǎng)也是陽性，表明數(shù)字PCR可以取代血培養(yǎng)作為恢復(fù)期是否還有布魯菌存在的一種方法，但只是初步探討，尚需要擴大樣本量驗證。對于血清布魯菌數(shù)字PCR檢測陽性的患者，考慮存在現(xiàn)癥布魯菌感染，臨床應(yīng)繼續(xù)給予抗布魯菌治療。

臨床資料顯示，血清布魯菌DNA檢測陽性病例較陰性病例有明顯的高熱癥狀(體溫39.5℃)，且布魯菌血培養(yǎng)陽性，提示存在菌血癥。14例血清布魯菌DNA定量檢測陰性患者有不同程度發(fā)熱，但無高熱，體溫37.3～38℃，血培養(yǎng)陰性，提示可能不存在布魯菌菌血癥。14例患者都存在不同程度的腰痛、關(guān)節(jié)痛和睪丸腫痛等自覺布魯菌病臨床癥狀，分析靶器官損傷可能不是布魯菌直接損傷所致，而是由遲發(fā)型免疫反應(yīng)所致，與文獻(xiàn)報道[9,10]相符。對于布魯菌數(shù)字PCR檢測陰性，但仍有自覺癥狀的患者，是否需要繼續(xù)治療，需綜合患者臨床表現(xiàn)，紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白、血清凝集試驗結(jié)果綜合考慮，評估是否需要繼續(xù)治療。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.013

項目來源：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院院內(nèi)科研基金(編號：DTQL201404)

010000 呼和浩特市，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部(郭瑛);首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心，感染病科國家臨床重點?？?韓冰、孫華麗、蔣榮猛);中科院北京基因組研究所(王麗、劉貴明)

蔣榮猛，100015 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心，感染病科國家臨床重點?？?；

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R 516.7

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1002-7386(2017)15-2292-04

2017-02-14)