李妍 王西娣 陳美玲 楊健 王蕊 鮮小萍 張?zhí)烊A

陜西地區(qū)6年間結(jié)核分枝桿菌耐藥情況分析

李妍 王西娣 陳美玲 楊健 王蕊 鮮小萍 張?zhí)烊A

目的 了解我所結(jié)核分枝桿菌分離株的耐藥情況。方法 對2010年1月至2015年12月培養(yǎng)的385株陽性菌株進行菌種鑒定及比例法藥物敏感性試驗，并對6 種抗結(jié)核藥物的耐藥情況分析。結(jié)果 385株結(jié)核分枝桿菌復合群菌株中，總體耐藥率為35.3%(136/385)。耐藥率由高到低依次為：SM 23.1%(89/385)，INH 21.0%(81/385)，RFP 16.4%(63/385)，OFX 7.8%(30/385)，EMB 7.0%(27/385)，KM 1.6%(6/385)。單耐藥14.0%(54/385)>耐多藥13.5%(52/385)>多耐藥7.5%(29/385)>廣泛耐藥0.3%(1/385)。結(jié)論 陜西地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥狀況仍較嚴重，應需采取更有效的措施，減少耐藥菌的傳播。

陜西地區(qū)；結(jié)核分枝桿菌；耐藥結(jié)核病

據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織(WHO)報告顯示，2014年全球共有150萬人死于結(jié)核病，其中21萬死于耐多藥結(jié)核病，估計全球共有900萬結(jié)核病新發(fā)病例，其中新發(fā)耐多藥患者為48萬；我國新發(fā)病例為93萬，耐多藥患者為5.2萬例[1]。結(jié)核病仍然是目前最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一，其中耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)已成為結(jié)核病控制工作中的難點。為了解本地區(qū)結(jié)核病的耐藥現(xiàn)狀和流行趨勢，完善適合于本地區(qū)的結(jié)核病防控措施及指導結(jié)核病個體化治療方案提供依據(jù)，我們回顧近6年來本實驗室的藥敏檢測結(jié)果，對本地區(qū)的耐藥情況作出初步的分析和研究，具體情況如下。

資料與方法

一、材料

1 菌株：選擇本所檢驗科2010年1月至2015年12月痰培養(yǎng)陽性菌株，共401株。

2 主要試劑：本實驗所用分枝桿菌藥敏及菌型鑒定培養(yǎng)基均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。結(jié)核分枝桿菌標準株(H37Rv)由中國疾病預防控制中心結(jié)核病臨床防治中心國家參比實驗室惠贈。

二、試驗方法

1 藥物敏感試驗：本實驗采用比例法[2]藥敏試驗，所用6種藥物分別是異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(SM)、卡那霉素(KM)和氧氟沙星(OFX)，終濃度分別為：INH 0.2μg/mL，RFP 40.0μg/mL，EMB 2.0μg/mL，SM 4.0μg/mL，KM 30.0μg/mL和OFX 2.0μg/mL。將肉眼可見菌落生長1-2w的培養(yǎng)菌株進行刮菌、磨菌，同時與1麥氏的標準比濁管進行比濁，配制成1mg/mL的菌懸液，后用無菌生理鹽水分別稀釋至10-2mg/mL和10-4mg/mL濃度，分別取0.01mL菌液均勻地接種至對照及含藥培養(yǎng)基斜面上，置37℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。

2 菌種鑒定：與藥敏試驗同時進行[2]，將1mg/mL的菌懸液進行100倍稀釋，接種0.1mL于對硝基苯甲酸 (PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基上。置37℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。僅PNB培養(yǎng)基上生長者為結(jié)核分枝桿菌復合群。

3 結(jié)果判定：計算公式：耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基上生長的的菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上生長的的菌落數(shù))×100%。若耐藥百分比<1%者則視為敏感株，耐藥百分比≥1%者則視為耐藥株。

4 質(zhì)量保證：每批藥敏試驗均用H37Rv作為敏感對照；若對照培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個，則試驗失敗，應重復操作。

三、耐藥結(jié)核病相關(guān)定義

1 單耐藥結(jié)核病(MR-TB)：指僅對一種抗結(jié)核藥物耐藥。

2 多耐藥結(jié)核病(PDR-TB)：指對1種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥(但不包括同時對異煙肼和利福平耐藥)的結(jié)核病。

3 耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)：指至少同時對異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核病。

4 廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)：指除對異煙肼和利福平耐藥之外，同時對任意一種氟喹諾酮類藥物及對三種二線抗結(jié)核藥物注射劑(卡那霉素和丁胺卡那霉素、卷曲霉素)中的至少一種耐藥[3]。

四、統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，使用 SPSS17. 0系統(tǒng)，采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。多個率之間進行多重比較，通過計算兩率之差的可信區(qū)間來推斷比較組間有無差異。

結(jié) 果

一、菌型鑒定

共分離出401株分枝桿菌，經(jīng)初步鑒定，385株(385/401，96.0%)屬于結(jié)核分枝桿菌，16株(16/401，4.0%)屬于非結(jié)核分枝桿菌。

二、藥敏試驗結(jié)果

對1種或1種以上抗結(jié)核藥耐藥(以下簡稱任一耐藥)者有296株，其耐藥率由高到低依次為：S 23.1%(89/385)，H 21.0%(81/385)，R 16.4%(63/385)，O 7.8%(30/385)，E 7.0%(27/385)，K 1.6%(6/385)。6年期間，S和H的耐藥率始終居于前兩位，趨勢基本保持一致，O和K基本保持穩(wěn)定，有抬高的趨勢，R上升較快，E呈下降趨勢，其中S、H、R耐藥率保持在較高水平，且呈倍數(shù)上升。各年度的耐藥率和耐藥趨勢(見表1、圖1)。

三、結(jié)核分枝桿菌耐藥結(jié)果

385株結(jié)核分枝桿菌復合群菌株中，單耐藥14.0%(54/385)>耐多藥13.5%(52/385)>多耐藥7.5%(29/385)>廣泛耐藥0.3%(1/385)。

其中，單耐藥結(jié)核病患者的菌株共54株，6種藥的耐藥率由高到低依次為：S 6.2%(24/385)，O 3.1%(12/385)，H 2.6%(10/385)，E 1.0%(4/385)，R 0.5%(2/385)，K 0.5%(2/385)。29株多耐藥結(jié)核病患者的菌株有12種不同形式的耐藥組合，耐藥情況由高到低依次為：H+S 2.3%(9/385)，R+S 1.3%(5/385)，H+E+S 1.0%(4/385)，H+K 0.5%(2/385)，H+O 0.5%(2/385)，H+E 0.3(1/385)，E+S 0.3(1/385)，S+O 0.3(1/385)，R+S+O 0.3(1/385)，E+S+O 0.3(1/385)，R+E+O 0.3(1/385)，R+E+S+O 0.3(1/385)。52株耐多藥結(jié)核病患者的菌株有8種不同形式的耐藥組合，耐藥情況由高到低依次為：H+R+S 6.2%(24/385) H+R 2.1%(8/385) H+R+E+S 1.8%(7/385) H+R+E+S+O 1.3%(5/385) H+R+S+O 1.0%(4/385) H+R+E 0.5%(2/385) H+R+O 0.3%(1/385) H+R+S+K 0.3%(1/385) 。廣泛耐多藥有1株為H+R+S+K+O 耐藥率為0.3%(1/385)。(見表2)。

表1 2010-2015年385株結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果[(n，%)]

注： H(INH)；R(RFP)； E(EMB); S (SM)；O(OFX)；K(KM)

圖1 2010-2015年6種藥物耐藥率的時間趨勢圖

表2 2010-2015年385株結(jié)核分枝桿菌耐藥情況(n，%)

注： H(INH)；R(RFP)； E(EMB); S (SM)；O(OFX)；K(KM)

討 論

耐藥結(jié)核病的防治工作是我國目前面臨的重大挑戰(zhàn)之一，其很大一部分原因在于患者抗結(jié)核藥物的不規(guī)范使用以及結(jié)核病防控方面仍存在不足。據(jù)2007-2008 年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查結(jié)果顯示[4]，我國肺結(jié)核患者中耐多藥率為8.3%。2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查顯示[5]，結(jié)核分枝桿菌分離菌株總耐多藥率為6.8 %，廣泛耐藥率為2.1%。因此，根據(jù)藥物敏感性試驗結(jié)果合理選擇化療方案以及有效控制結(jié)核病的傳播對耐藥結(jié)核病的防治具有重要意義。

本實驗結(jié)果顯示，2010-2015年間，385株結(jié)核分枝桿菌對6種藥物的總耐藥率為35.3%(136/385)，這與吉林市[6]的總耐藥率34.2%接近，高于長沙地區(qū)[7]的20.56%，但低于2010 年全國第五次結(jié)核病流調(diào)結(jié)果(42.1%)[5]、南京(49.53%)[8]及青海(56%)[9]。從2010年到2015年結(jié)核分枝桿菌的耐藥率每年依次為19.0%(4/21)、20.0%(13/65)、28%(7/25)、40.5%(30/74)、36.0%(49/136)、51.6%(33/64)，提示我省結(jié)核病耐藥情況呈逐年上升趨勢，而且抗結(jié)核藥物的耐藥率總體仍以S為最高，其次為H，這與筆者之前的結(jié)果[10]以及本所趙麗芬[11]研究結(jié)果相同。因此筆者認為常規(guī)進行藥敏試驗對痰涂片陽性的患者非常重要，同時對高危人群開展耐藥可疑者篩查也有一定的必要性，這樣可以方便了解患者的耐藥情況，同時根據(jù)藥敏結(jié)果制定合理的化療方案也有利于減少耐藥結(jié)核病的發(fā)生。

本研究385株結(jié)核分枝桿菌中，單耐藥為14.0%(54/385)依次高于耐多藥13.5%(52/385)、多耐藥7.5%(29/385)及廣泛耐藥0.3%(1/385)，結(jié)果提示，近幾年來我省防癆雖然取得了一定成效[12]，但單耐藥處于較高水平的問題仍然突出，尤其是S、H、R三種藥物的耐藥率處于較高水平，這與病人不規(guī)律、不合理用藥有很大關(guān)系，病人治療過程中因各種原因停藥、中斷藥物治療，是造成耐藥的根本原因。早期有研究表明，抗結(jié)核藥物的用藥時間與耐藥率有一定關(guān)系[13]。比如鏈霉素，隨著用藥時間的延長其耐藥率會上升，成正比關(guān)系，且居于其他一線藥的耐藥率之首，但至6個月以后耐藥發(fā)生趨于緩慢。其原因可能與早期首選的以異煙肼、鏈霉素聯(lián)合化療方案為主有關(guān)，而且，鏈霉素是最早使用的抗結(jié)核藥物，長期應用會使結(jié)核菌接觸藥物的時間增長,加大了發(fā)生耐藥基因突變的幾率,這與本研究結(jié)果中鏈霉素的單耐藥率最高一致。雖然藥物因素是造成耐藥結(jié)核病的基礎，但是濫用藥物、不規(guī)范治療以及對病人的督導管理不善，病人的治療依從性差仍是產(chǎn)生耐藥的主要原因。最新研究提示，傳播才是耐藥性結(jié)核病的重要原因[14]。傳統(tǒng)細菌學檢測方法耗時長，痰培養(yǎng)需要4-6周，藥敏試驗需要在培養(yǎng)的基礎上再加一個月時間，這就嚴重影響了患者的診療時間，使結(jié)核分枝桿菌的傳播不能及時控制。因此需要推廣快速、準確、經(jīng)濟的新的結(jié)核病檢測技術(shù)，縮短肺結(jié)核及耐藥肺結(jié)核的診斷時間，減少耐藥結(jié)核菌的傳播。

總之，本文的實驗室數(shù)據(jù)反映了近6年來本所就診的結(jié)核病患者總體耐藥情況，能對本省結(jié)核病耐藥及流行病學方面的研究提供一定參考價值。但我們也深感此項研究的種種不足，如6年期間標本數(shù)量較少，原因在于我所只收治門診病人，病源量較少；耐多藥13.5%(52/385)與趙麗芬[11]研究結(jié)果13.2%接近但是仍高于全國平均水平(6.8%)[5]，與我所為省級結(jié)核病防治中心，患者多為復治的疑難病例，因此難免產(chǎn)生耐藥性；此外，本所是結(jié)防機構(gòu)，其資料也不能完全代表一個地區(qū)的流行情況，若選取不同區(qū)域的縣級單位為監(jiān)測點，資料才更具代表性。以上不足之處，我們會在后續(xù)的工作中予以補充和完善。因此，在新型結(jié)核病防治管理模式下，我省的結(jié)核病防治尤其是耐藥肺結(jié)核防治工作仍需采取更有效的措施，包括對患者的宣傳教育、督導隨訪、后續(xù)的管理等方面，積極提高患者的依從性；要規(guī)范臨床用藥，合理治療，提高患者治愈率，避免停藥及中斷治療，從而避免耐藥患者的產(chǎn)生；同時積極推廣新診斷技術(shù)，縮短耐藥肺結(jié)核的診療時間，減少耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播。

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[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部．全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告(2007-2008年)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2010．

[5] 王黎霞,成詩明,陳明亭,等．2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J]．中國防癆雜志，2012，34(8)：485-508．

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Analysis of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis during past 6 years in Shaanxi area

LI Yan, WANG Xi-di, CHEN Mei-ling, YANG Jian, WANG Rui, XIAN Xiao-ping, ZHANG Tian-hua

Shaanxi Provincial Institute for TB Control and Prevention, Xi’an, Shaanxi 710048, China

Objective To investigate the status of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis (MTB) in our institute. Methods The proportional method was used in bacteria identification and drug sensitivity tests of 385 strains from January 2010 to December 2015. The drug resistance of 6 kinds of anti-tuberculosis drugs was analyzed. Results The overall resistance rate to anti-tuberculosis drugs was 35.3% (136/385) in 385 strains of the MTB complex group. The sequence of resistance rate from high to low was 23.1% of SM (89/385), 21.0% of INH (81/385), 16.4% of RFP (63/385), 7.8% of OFX (30/385), 7.0% of EMB (27/385), and 1.6% of KM (6/385). MR-TB rate was 14.0% (54/385), MDR rate was 13.5% (52/385), PDR rate was 7.5% (29/385) and XDR rate was 0.3% (1/385). Conclusion The drug resistance of MTB in Shaanxi area is still serious, and more effective measures should be taken to reduce the spread of drug resistant bacteria.

Shaanxi area; Mycobacterium tuberculosis; drug-resistant tuberculosis

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.038

陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目(No 2016SF-272)

710048 陜西 西安，陜西省結(jié)核病防治研究所

張?zhí)烊A，E-mail：zhthfzhk@126.com

2016-11-22]