刁梁輝，丁錦麗，尹太郎，黃春宇，楊菁，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心.深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所.深圳 518045；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

·實驗研究·

反復(fù)妊娠失敗患者種植窗期子宮內(nèi)膜調(diào)節(jié)性T細胞功能相關(guān)因子的表達

刁梁輝1，丁錦麗2，尹太郎2，黃春宇1，楊菁2，曾勇1*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心.深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所.深圳 518045；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 430060)

目的 分析反復(fù)妊娠失敗患者種植窗期子宮內(nèi)膜調(diào)節(jié)性T細胞相關(guān)生物標(biāo)記物的表達情況。 方法 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)(n=23)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)(n=33)與對照組(n=15)女性FOXP3、CTLA-4和TGF-β3水平。通過Vectra?自動病理成像定量分析系統(tǒng)計算其陽性細胞率。 結(jié)果 RIF組、RM組患者子宮內(nèi)膜CTLA-4陽性細胞率顯著高于對照組(P<0.01)，而TGF-β3陽性細胞率顯著低于對照組(P<0.01)。FOXP3陽性細胞率與CTLA-4陽性細胞率顯著正相關(guān)(r=0.68，P<0.01)。 結(jié)論 RIF、RM患者子宮內(nèi)膜種植窗期TGF-β3、CTLA-4表達異常，表明TGF-β3、CTLA-4可能參與RIF、RM種植窗期子宮內(nèi)膜免疫耐受調(diào)節(jié)，影響其子宮內(nèi)膜容受性。

反復(fù)種植失敗； 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)； 調(diào)節(jié)性T細胞； FOXP3； CTLA-4； TGF-β3

(JReprodMed2017，26(7)：705-710)

從免疫學(xué)的角度，胚胎既可看作是“特殊的腫瘤”，亦可認為是“同種異體移植物”。因此，母胎界面免疫耐受狀態(tài)的失衡與妊娠失敗緊密相關(guān)。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是CD4+T細胞的亞型。研究表明，Tregs在移植物抗宿主反應(yīng)、身免疫性疾病及鼠和人類母胎界面免疫耐受的維持中均發(fā)揮重要作用[1-2]。生理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜Tregs在增殖期逐漸增加，而黃體期逐漸下降[3]，而在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)或子宮內(nèi)膜異位癥等病理狀態(tài)下，黃體期Tregs沒有下降趨勢。因此排卵前Tregs的增多可能對于誘導(dǎo)免疫耐受和胚胎成功著床，以及組織損傷和修復(fù)發(fā)揮著重要作用[3-4]。正常狀態(tài)下，胚胎抗原的刺激使Tregs募集到子宮內(nèi)膜局部，Tregs數(shù)量或功能降低會打破母胎界面的免疫耐受狀態(tài)，使胚胎遭受母體免疫系統(tǒng)的攻擊，從而導(dǎo)致妊娠失敗[5-6]。另外，在胚胎著床過程中，滋養(yǎng)細胞入侵子宮內(nèi)膜類似組織修復(fù)的過程，而Tregs在炎癥修復(fù)中起著重要作用[7]。因此，研究種植窗Tregs及其相關(guān)因子在子宮內(nèi)膜的表達及分布情況具有重要意義。

FOXP3是Tregs分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在Tregs的發(fā)育和功能上起重要作用，被認為是Tregs的特異性標(biāo)記物。Galgani等[8]的研究表明，與對照組患者相比，RM和反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure，RIF)患者子宮內(nèi)膜FOXP3+Tregs顯著降低。細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)主要表達于CD4+CD25+Tregs表面，可能通過細胞間相互作用傳遞抑制信號，增強Tregs的功能，從而參與妊娠維持。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)對初始CD4+T細胞分化為Th17細胞或Tregs具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[9]。TGF-β可增強FOXP3的表達，促使初始CD4+T細胞分化為Tregs[9]。CD4+CD25+Tregs主要通過TGF-β發(fā)揮抑制活性[10]。TGF-β3屬于TGF-β超家族成員，有研究表明，RM患者滋養(yǎng)細胞TGF-β3水平是顯著降低的[11]，注射TGF-β3能有效降低流產(chǎn)模型小鼠的流產(chǎn)率[12]，表明TGF-β3在胚胎種植及妊娠維持中可能起著重要作用。目前關(guān)于Tregs相關(guān)因子在種植窗期子宮內(nèi)膜表達情況的研究較少。本研究通過免疫組化技術(shù)檢測RIF、RM和正常育齡婦女子宮內(nèi)膜FOXP3、CTLA-4和TGF-β3的表達水平，探討子宮內(nèi)膜Tregs相關(guān)因子與反復(fù)妊娠失敗的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年10月至2016年8月在本院就診的71例患者作為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)有規(guī)律月經(jīng)周期，平均27～35 d；(2)納入研究前3個月內(nèi)未接受激素治療；(3)夫婦雙方外周血染色體核型正常。本研究分為3組，分別是反復(fù)種植失敗組(RIF組，23例)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)組(RM組，33例)和對照組(15例)。RIF組為經(jīng)歷至少2次取卵周期、3次或3次以上的移植周期，移植的總優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)≥6個仍未取得臨床妊娠[13-14]；RM組為經(jīng)歷2次或2次以上20周前的自發(fā)性流產(chǎn)患者；對照組為：(1)因男方因素首次IVF助孕并成功分娩的患者；(2)女方內(nèi)分泌及解剖結(jié)構(gòu)正常。患者年齡22～39歲，平均(32.11±3.15)歲。所有納入患者均已簽署知情同意書，實驗流程已獲本院倫理學(xué)委員會認可。

二、研究方法

1.子宮內(nèi)膜標(biāo)本收集：利用子宮內(nèi)膜取樣器(Gynetics，Lommel，比利時)獲取患者種植窗期(LH+7～9 d)子宮內(nèi)膜組織。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗子宮內(nèi)膜組織，去除血塊，室溫條件下用10%福爾馬林固定，4～6 h后常規(guī)進行脫水、石蠟包埋。

2.性激素測定：月經(jīng)第2～3天收集患者外周血，采用化學(xué)發(fā)光法檢測血清FSH、LH、E2、孕酮(P)及泌乳素(PRL)水平。

3.免疫組織化學(xué)：包埋子宮內(nèi)膜組織作4 μm厚度切片，常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫15 min，5%胎牛血清封閉20 min阻斷非特異性染色。乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液微波加熱處理后，分別滴加鼠抗人FOXP3(eBioscience，美國)、鼠抗人TGF-β3(Abcam，美國)或鼠抗人CTLA-4(Santa Cruz，美國)抗體工作液，37℃孵育1 h。以PBS代替一抗作為陰性對照，以FOXP3，CTLA-4和TGF-β3表達陽性的人扁桃體組織切片作為陽性對照。滴加兔、鼠通用二抗(Dako Cytomation，丹麥)，37℃ 孵育 30 min。滴加 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)工作液(Dako Cytomation)顯色，待顯色至棕黃色時終止。蘇木素復(fù)染，氨水返藍，梯度酒精脫水，樹膠封片。Vectra?自動病理成像定量分析系統(tǒng)(Perkin Elmer，美國)定量分析FOXP3，CTLA-4和TGF-β3陽性細胞率，操作流程參考文獻所述[15]。納入被組織覆蓋面積超過80%的圖像，陽性細胞率定義為DAB陽性細胞數(shù)/子宮內(nèi)膜總細胞數(shù)。

4.HE染色：石蠟切片常規(guī)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)，確定子宮內(nèi)膜分期。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)表示。正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，非正態(tài)分布資料比較采用Mann-Whitney U檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman’s 相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者一般資料

本項研究共納入患者71例，其中對照組15例，RIF組23例，RM組33例。組間年齡、體重指數(shù)(BMI)及基礎(chǔ)性激素資料無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，RIF組、RM組妊娠失敗次數(shù)均顯著高于對照組(P<0.01)(表1)。

表1 RIF、RM和對照組基本資料

注：△資料呈非正態(tài)分布；與對照組比較，**P<0.01

二、FOXP3、CTLA-4和TGF-β3在子宮內(nèi)膜表達及分布情況

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖1。FOXP3、CTLA-4和TGF-β3陽性細胞少量分散表達于種植窗期子宮內(nèi)膜組織。FOXP3主要呈細胞核表達，陽性細胞主要分布在間質(zhì)。CTLA-4和TGF-β3均呈細胞膜和胞質(zhì)表達，陽性細胞分布于間質(zhì)(圖1)。

三、FOXP3、CTLA-4和TGF-β3在各組子宮內(nèi)膜的表達差異

通過比較3組種植窗期子宮內(nèi)膜FOXP3、CTLA-4和 TGF-β3的陽性細胞占總細胞百分率，結(jié)果顯示：RIF組、RM組的CTLA-4陽性率顯著高于對照組(P<0.01)，TGF-β3陽性率顯著低于對照組(P<0.01)，RIF、RM組FOXP3陽性率與對照組比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

四、FOXP3、CTLA-4和TGF-β3相關(guān)性分析

種植窗期子宮內(nèi)膜FOXP3、CTLA-4和TGF-β3陽性率的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3與CTLA-4顯著正相關(guān)(r=0.68，P<0.01)，但FOXP3與TGF-β3、TGF-β3與CTLA-4無顯著相關(guān)性(r=0.14，P>0.05；r=0.04，P>0.05)(圖2)。

A：FOXP3； B：TGF-β3； C：CTLA-4圖1 FOXP3、TGF-β3和CTLA-4在子宮內(nèi)膜的免疫組織化學(xué)染色 200×

組 別例數(shù)FOXP3△CTLA?4TGF?β3△對照組15007(004～010)001±001013(004～017)RIF組23009(003～023)003±002??004(002～007)??RM組33005(004～023)003±002??003(002～004)??

注：△資料呈非正態(tài)分布；與對照組比較，**P<0.01

A：FOXP3與CTLA-4相關(guān)性分析；B：TGF-β3與CTLA-4相關(guān)性分析；C：FOXP3與TGF-β3相關(guān)性分析圖2 3組FOXP3、CTLA-4和TGF-β3相關(guān)性分析圖

討 論

妊娠失敗的主要原因包括內(nèi)分泌紊亂、自身免疫性疾病、染色體異常等，其中，染色體異常是主要因素。證據(jù)顯示超過50%的流產(chǎn)與胚胎染色體異常有關(guān)，且自然流產(chǎn)和RM胚胎異常率無顯著差異[16-17]。成功的妊娠由胚胎和內(nèi)膜共同作用而完成，正常的子宮內(nèi)膜應(yīng)同時具備合適的選擇性和接受性。早期研究顯示，約40%的RM子宮內(nèi)膜為超生育力狀態(tài)[18]，隨后的研究進一步證實，RM患者的子宮內(nèi)膜無法識別高等級胚胎和低等級胚胎[19]。然而，研究表明，經(jīng)種植前基因診斷技術(shù)(PGS)篩選后，囊胚的繼續(xù)種植率仍然僅65.5%左右[20-21]，表明即使染色體正常也不能確保成功妊娠，表明了子宮內(nèi)膜在胚胎種植中的重要作用。而大量證據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜免疫功能的紊亂可能降低子宮內(nèi)膜容受性，且與一系列生殖并發(fā)癥，如RIF和RM密切相關(guān)[22]。證據(jù)提示RIF和RM子宮內(nèi)膜可能存在一些相似的問題—對胚胎的選擇存在障礙，因而可能會表現(xiàn)在某些特定細胞因子、關(guān)鍵調(diào)控分子或細胞的表達差異上。胚胎種植的過程中，Tregs對子宮內(nèi)環(huán)境免疫穩(wěn)態(tài)的維持和胚胎種植均起重要作用[4]。Tregs的分子標(biāo)記物包括FOXP3，CD25high，CD127low，CTLA-4、IL-10、TGF-β等[23]。在動物研究中，流產(chǎn)模型小鼠Tregs的數(shù)量顯著降低，而妊娠早期轉(zhuǎn)輸來自正常妊娠小鼠的Tregs可顯著降低其流產(chǎn)率[24]。在人類研究中，Sasaki 等[25]首次報道了Tregs可能與自然流產(chǎn)有關(guān)。數(shù)據(jù)顯示在正常妊娠早期，蛻膜中含有大量CD4+CD25+Tregs，外周血中CD4+CD25+Tregs數(shù)量較非妊娠期增加，但自然流產(chǎn)患者蛻膜Tregs數(shù)量并未增加；與人工流產(chǎn)患者比較，自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中CD4+CD25highTregs數(shù)量顯著降低。本項研究結(jié)果表明，RM和RIF患者種植窗期子宮內(nèi)膜FOXP3陽性細胞率與對照組無顯著差異，與Galgani等[8]報道的RM和RIF患者FOXP3+Tregs低于對照組的結(jié)論不一致。獲取和檢測子宮內(nèi)膜組織方法的不同可能解釋兩項研究結(jié)果的差異。Galgani等[8]采用免疫熒光技術(shù)檢測了宮腔鏡下獲取的月經(jīng)第21～23天的子宮內(nèi)膜標(biāo)本，而本項研究采用免疫組化技術(shù)檢測子宮內(nèi)膜取樣器獲取的種植窗期(LH+7～9)子宮內(nèi)膜組織。正常婦女子宮內(nèi)膜FOXP3+Tregs在增殖期達到高峰，而在黃體期下降，而在病理狀態(tài)下，黃體期Tregs沒有下降趨勢[3]，因此推測排卵前子宮內(nèi)膜Tregs的增多對于誘導(dǎo)免疫耐受和胚胎成功著床可能起著重要作用。FOXP3是Tregs分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通常被認為是最特異的Tregs功能標(biāo)記物，但研究顯示活化T細胞也可瞬時表達FOXP3，并且在Tregs中，僅表達FOXP3并不能發(fā)揮其免疫抑制功能[26]，所以本研究進一步分析其他Tregs功能相關(guān)分子的表達情況。

CTLA-4也稱CD152，主要表達于Tregs和CD4+效應(yīng)T細胞表面與CD28競爭結(jié)合CD80/CD86，傳遞負性調(diào)節(jié)信號下調(diào)T細胞免疫，被稱為T細胞的剎車信號。目前關(guān)于子宮內(nèi)膜CTLA-4的表達及定位的研究較少。Jin等[27]的研究表明，流產(chǎn)患者蛻膜組織CTLA-4蛋白水平顯著低于對照組，而Wang等[28]的研究表明，自發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜CTLA-4 mRNA水平顯著高于對照組。在本項研究中，RIF和RM患者CTLA-4陽性細胞率顯著高于對照組，且CTLA-4和FOXP3陽性率顯著正相關(guān)，提示CTLA-4和FOXP3可能在降調(diào)RIF/RM患者子宮內(nèi)膜炎癥方面起協(xié)同作用，即RIF和RM患者可能由于子宮炎性環(huán)境過高誘導(dǎo)大量活化T細胞的浸潤，同時誘導(dǎo)Tregs的增殖，下調(diào)該炎性環(huán)境。

Tregs由CD4+幼稚T細胞分化途徑受TGF-β家族調(diào)控[9]。TGF-β與初始CD4+T細胞表面受體結(jié)合，可增強FOXP3的表達，促使初始CD4+T細胞分化為Tregs[10]。另外，男性精漿中TGF-β能誘導(dǎo)女性耐受反應(yīng)，從而促進母體對父型抗原的免疫耐受，防止胚胎丟失[2]。另外，TGF-β能將初始CD4+CD25-細胞體外誘導(dǎo)為具有抑制功能的CD25+FOXP3+細胞[29]。CD4+CD25+Tregs主要通過TGF-β發(fā)揮抑制活性[11]，TGF-β抗體能阻斷CD25 T細胞的抑制效應(yīng)[30]。同時，TGF-β可參與到內(nèi)膜細胞的增殖分化、血管形成和子宮內(nèi)膜蛻膜化過程[31]。有研究表明，RM患者滋養(yǎng)層細胞TGF-β3水平是顯著降低的[5]。動物實驗表明，經(jīng)陰道注射TGF-β3能有效降低流產(chǎn)率[32]，表明TGF-β3在胚胎種植及妊娠維持中可能起著重要作用。本項研究檢測正常婦女和RIF、RM患者種植窗期子宮內(nèi)膜TGF-β3的表達情況，結(jié)果表明，種植窗期對照組患者子宮內(nèi)膜TGF-β3陽性率顯著高于RIF/RM組，表明TGF-β3表達的下調(diào)可能與RIF/RM患者子宮內(nèi)膜Tregs數(shù)量和功能異常及子宮內(nèi)膜容受性下降有關(guān)。

綜上所述，本項研究結(jié)果表明，種植窗期子宮內(nèi)膜免疫調(diào)節(jié)因子TGF-β3、CTLA-4的異常表達可能與RIF和RM相關(guān)，但具體的機制還需進一步研究。

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[編輯：郭永]

《生殖醫(yī)學(xué)雜志》補刊補訂消息

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本刊編輯部

Expressions of regulatory T cell related factors in endometrium during implantation window in women with repeated reproductive failure

DIAOLiang-hui1，DINGJin-li2，YINTai-lang2，HUANGChun-yu1，YANGJing2，ZENGYong1*

1.ShenzhenKeyLaboratoryforReproductiveImmunologyofPreimplantation，ShenzhenZhongshanInstituteforReproductionandGenetics，F(xiàn)ertilityCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，Shenzhen5180452.ReproductiveMedicalCenter，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060

Objective：To analyze the expression of regulatory T(Treg)cell related biomarkers in the endometrium during implantation window in the women with repeated implantation failure (RIF) or recurrent miscarriage (RM).

Methods：Immunohistochemistry was used to identify fork head box P3 (FOXP3)，cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4) and transforming growth factor β-3 (TGF-β3) in the endometrium during implantation window from the women with RIF (n=23) or RM (n=33) and matched controls (n=15).The images were acquired and analyzed automatically by the Vectra?automated quantitative pathology imaging system.

Results：The rate of CTLA-4 positive cells in RIF group and RM group was significantly higher than that in control group (P<0.01)，while the rate of TGF-β3 positive cells was significantly lower than that of control group(P<0.01).The percentage of FOXP3+and CTLA-4+in the endometrium were positively correlated(r=0.68，P<0.01).

Conclusions：The expressions of endometrial CTLA-4 and TGF-β3 in pre-implantation endometrium of women with RIF and RM are abnormal，which suggests that these immune suppression markers may involve in regulating endometrial receptivity.

Repeated implantation failure； Recurrent miscarriage； Regulatory T cells； FOXP3； CTLA-4；TGF-β3

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.07.017

2016-12-05；

2017-01-14

深圳市科技創(chuàng)新委員會基礎(chǔ)研究項目(JCYJ20140415114504394)、深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目(201505029)

刁梁輝，男，廣東河源人，博士，生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè).(*

，zengyong1966@gmail.com)