路雪蕊 歐陽伶俐 劉 壯 劉蓉蓉 李慧靜(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，保定 071001)

響應面法優(yōu)化酶法降低小麥粉致敏性的研究

路雪蕊 歐陽伶俐 劉 壯 劉蓉蓉 李慧靜
(河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，保定 071001)

采用酶聯(lián)免疫技術分析6種酶制劑處理對小麥粉致敏性的影響，以過敏原含量為指標，篩選出能夠降低小麥粉致敏性的酶制劑為菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，確定了同步酶解路線，通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化了酶解工藝參數(shù)。結(jié)果表明：菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶按酶活比為2∶5復配，料液比6.64%，酶解pH 6.53，酶解溫度47.7 ℃，酶解時間2.47 h，加酶量0.395 g/100 g蛋白質(zhì)，過敏原含量為0.593 μg/g蛋白質(zhì)，與理論值相差7.8%，致敏性降低了36.1%。因此，中心組合設計響應面法建立酶法降低小麥粉致敏性的模型設計合理，能夠預測制備低致敏性小麥粉的過敏原含量。

小麥粉 菠蘿蛋白酶 木瓜蛋白酶 過敏原含量 響應面法

小麥是我國主要的糧食作物之一，然而小麥中存在誘發(fā)過敏反應的過敏原蛋白，1995年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)指出90%的食物過敏反應是因8類食物引起，小麥位列第5[1]。Emmett等[2]與Venter等[3]研究表明，世界上有0.2%～0.9%的成人和0.4%～1.3%的兒童患有小麥過敏。小麥過敏可以引發(fā)多種過敏性疾病，如小麥運動激發(fā)過敏癥、乳糜瀉腸炎、職業(yè)哮喘、鼻炎、蕁麻癥等，嚴重影響過敏患者內(nèi)臟、呼吸道與皮膚的健康，甚至危及生命[4]。酶法改性是利用酶制劑在溫和的條件下使蛋白質(zhì)進行水解和交聯(lián)，改變原有蛋白質(zhì)的線性表位或空間結(jié)構，從而影響食物過敏原的致敏性。酶法改性以反應條件溫和、高效專一和可控性等優(yōu)點已應用于牛乳、雞蛋、花生、大豆、海產(chǎn)品等食品的脫敏技術研究當中[5-9]。目前，酶制劑也作為一類高效的面粉改良劑，在面粉的品質(zhì)改良方面起著重要作用。盡管國外對小麥過敏方面做了相應的研究，然而我國開展小麥過敏的方面研究鮮有報道，雙酶復配同步法酶解小麥粉并對酶解后小麥粉致敏性的相關研究幾乎為空白。

本試驗以小麥粉為研究對象，采用蛋白酶和非蛋白酶處理小麥粉，以過敏原含量為指標，通過酶聯(lián)免疫技術分析了酶解后小麥粉致敏性的變化，篩選了有效的降低小麥粉致敏性的酶制劑，探討了酶解路線，研究了復配酶最適的酶解參數(shù)以及采用響應面法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，旨在通過酶法改性食品脫敏技術降低小麥粉的致敏性，改善小麥粉的品質(zhì)特性和提高食品安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥：邢臺市糧食貿(mào)易有限公司；菠蘿蛋白酶(1 200 000 u/g)、木瓜蛋白酶(3 000 000 u/g)：廣西南寧龐博生物公司；脂肪酶(10 000 Lu/g)、葡萄糖氧化酶(10 000 GODU/g)、中性蛋白酶(1.5 AU/G)：諾維信公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶TG-M(1 000 U/g)：泰興一鳴生物制品有限公司；小麥過敏原檢測試劑盒：Nippon Meat Packers公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

PHS-3C型pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；真空冷凍干燥機：新陽速凍設備制造有限公司；酶標儀：Thermo scientific公司；H3018DR離心機：上海知信實驗儀器技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥粉的酶解反應

稱取一定質(zhì)量的小麥粉，按照料液比加入蒸餾水不斷攪拌混勻，調(diào)制成漿液，用0.1 mol/L的NaOH溶液或0.1 mol/L HCl調(diào)整到酶制劑所需的pH，置于恒溫酶解裝置中，各種酶最適酶解反應條件見表1。按照酶與底物中所含蛋白的比值，加入酶制劑，開始水解計時。酶解過程中攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，到達酶解反應時間后，立即將酶解液放入100 ℃沸水浴滅酶5 min，真空冷凍干燥后備用。

表1 不同酶的酶解反應最適條件

1.3.2 酶解路線的確定

同步法：選用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比2∶5復配，雙酶同時加入反應體系，在最適的酶解條件下反應2 h后，立即將酶解液放入100 ℃沸水浴滅酶5 min，其他步驟同1.3.1。

分步法：在最適的酶解條件下，先加入菠蘿蛋白酶酶解反應1 h后，立即將酶解液放入100 ℃沸水浴滅酶5 min。再加入木瓜蛋白酶酶解反應1 h后，立即將酶解液放入100 ℃沸水浴滅酶5 min，其他步驟同1.3.1。

1.3.3 雙酶復配的影響試驗

菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比1∶5、2∶5、4∶5添加，以過敏原含量為測定指標。

1.3.4 中心組合設計響應面法優(yōu)化雙酶復配酶解試驗

先將菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復配，確定雙酶復配比例為2∶5(按照酶活比)。在料液比、酶解pH、溫度、時間、加酶量等單因素對小麥粉過敏原含量影響的基礎上，采用Design Expert 8.0.6軟件中的中心組合設計五因素五水平的響應面試驗，以五因素為自變量對雙酶同步法酶解工藝進行優(yōu)化，以小麥粉過敏原含量為響應值。本試驗按五因素五水平實施，共26個處理，其中中心點重復5次。各因素水平試驗設計方案見表2。

1.3.5 小麥粉酶解物過敏原含量的測定

酶聯(lián)免疫法是利用連接到抗體上的酶來檢測結(jié)合到一起的抗原和抗體；酶催化一種無色的底物(色原體)轉(zhuǎn)化為有色的產(chǎn)物,指示抗原-抗體復合物的存在。本試驗采用商業(yè)試劑盒夾心式酶聯(lián)免疫法測定小麥粉過敏原的含量，小麥粉過敏原是抗原。

取1 mg酶處理后的樣品于2 mL磷酸鹽緩沖溶液中，4 ℃靜置48 h，4 ℃ 12 000 g離心5 min，收集上清液，用于ELISA測定，用考馬斯亮藍法[10]測定所取樣品中總蛋白質(zhì)含量。將所需的酶標板在室溫下放置20 min，平衡至室溫。在酶標板上每孔加入上述樣品液10 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育30 min。反應完畢，棄溶液，每孔加入250 μL洗滌液，重復洗滌5次，拍干。將生物素標記的抗體溶液按每孔100 μL加入各孔，37 ℃反應30 min，反應完畢，棄去溶液，洗滌5次。然后將辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素溶液每孔加入100 μL，37 ℃反應30 min，反應完畢，棄去溶液，洗滌5次。加入底物四甲基聯(lián)苯胺緩沖溶液和H2O2溶液各50 μL，37 ℃避光孵育15 min顯色，加2 mol/L H2SO4終止液，每孔50 μL，在酶標儀上測定450 nm的吸光度值。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

使用SPSS 17.0軟件進行方差分析(ANOVA)，數(shù)據(jù)間的差異比較采用Duncan檢驗，顯著水平為P<0.05；采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進行響應面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶處理對小麥粉致敏性的影響

由圖1可以看出，6種酶處理后的小麥粉致敏性相對空白均有所下降，其中木瓜蛋白酶處理后小麥粉的過敏原含量最低，致敏性降低了13.8%(P<0.05)；菠蘿蛋白酶次之，致敏性降低了11.2%(P<0.05)；其他幾種酶降低效果低于這2種酶。故本試驗選用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶進行復配及酶解路線分析，以期達到更佳的脫敏效果。

圖1 不同酶處理對小麥粉過敏原含量的影響

2.2 酶解路線確定結(jié)果

由表3可以看出，同步法酶解路線過敏原含量顯著低于分步法。由于分步法酶解路線中間滅酶過程，溶液糊化，導致黏度增加，溶液流動性降低，不利于酶與底物分子充分接觸，酶解效率降低；另外所用的2種蛋白酶酶解工藝參數(shù)接近，具備同步法酶解路線的條件。因此，選用同步法酶解路線為最佳酶解路線。

表3 酶解路線對小麥粉過敏原含量的影響

2.3 各種因素對雙酶復配的影響

2.3.1 溫度對雙酶復配的影響

稱取5 g小麥粉，按照料液比為1∶10配制溶液，酶解條件為：溫度45、50、55 ℃，pH 6.65，加酶量按照E/S=1∶100，雙酶(菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶)按照酶活比1∶5、2∶5、4∶5添加，酶解2 h。對雙酶復配的溫度進行選擇，以過敏原含量為測定指標，結(jié)果如圖2所示。

注：同一曲線上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。

圖2 溫度對雙酶復配酶解小麥粉過敏原含量的影響

從圖2可以看出，當菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶復配比例為1∶5、2∶5、4∶5時，隨著溫度的升高，過敏原含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶復配比例為1∶5、2∶5、4∶5在酶解溫度為50 ℃時，過敏原含量達到最小，分別為0.777 4、0.735 1、0.780 9 μg/g蛋白質(zhì)。

2.3.2 pH對雙酶復配的影響

稱取5 g小麥粉，按照料液比為1∶10配制溶液，酶解條件為：溫度50 ℃，pH 6.5～6.8，加酶量按照E/S=1∶100，雙酶(菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶)按照酶活比1∶5、2∶5、4∶5添加，酶解2 h。對雙酶復配的pH進行選擇，以過敏原含量為測定指標，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對雙酶復配酶解小麥粉過敏原含量的影響

從圖3可以看出，當菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶復配比例為1∶5、2∶5、4∶5時，隨著pH的增大，過敏原的含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。但是，當菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶復配比例為2∶5時，pH 6.65，過敏原含量顯著低于雙酶復配比例1∶5和4∶5。因此，確定菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶復配比例為2∶5，酶解溫度為50 ℃，酶解pH為6.65進行試驗。

2.3.3 料液比對雙酶復配的影響

稱取5 g小麥粉，按照料液比為6%、8%、10%、12%配制溶液，酶解條件為：溫度50 ℃，pH 6.65，加酶量按照E/S=1∶100，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比2∶5添加，酶解2 h。對雙酶復配2∶5時料液比進行選擇，以過敏原含量為測定指標，結(jié)果如圖4所示。

隨著料液比的增大，過敏原含量先下降后升高。當料液比為10%時，過敏原含量達到最低。當料液比低時，溶液流動性好，有利于酶與底物充分接觸，有利于酶解反應，過敏原含量降低；當料液比為12%，溶液黏稠，不利于酶與底物充分接觸，限制了酶解反應，過敏原含量升高。故選擇料液比為10%。

圖4 加酶量、酶解時間和料液比對雙酶復配酶解小麥粉過敏原含量的影響

2.3.4 酶解時間對雙酶復配的影響

稱取5 g小麥粉，按照料液比為10%配制溶液，酶解條件為：溫度50 ℃，pH 6.65，加酶量按照E/S=1∶100，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比2∶5添加，酶解1～3 h。對雙酶復配2∶5時酶解時間進行選擇，以過敏原含量為測定指標，結(jié)果如圖4所示。

隨著酶解時間的延長，過敏原含量呈現(xiàn)先下降后上升趨于平緩的趨勢，說明酶解時間的適當延長，可能導致酶的活性增加，使過敏原含量降低；酶解時間的充分延長并不能使小麥粉過敏原完全消除。因此，在上述酶解反應條件下最適的酶解時間是2 h。

2.3.5 加酶量對雙酶復配的影響

稱取5 g小麥粉，按照料液比為10%配制溶液，酶解條件為：溫度50 ℃，pH 6.65，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶按照酶活比2∶5添加，其中加酶量0.5%～2%，酶解2 h。對雙酶復配2∶5時加酶量進行選擇，以過敏原含量為測定指標，結(jié)果如圖4所示。

圖4表明，隨著加酶量的增加，過敏原含量先下降后緩慢升高?？赡苁且驗榧用噶枯^小時，酶未被底物飽和，酶解反應不夠完全，從而過敏原含量較高；當加酶量較大時，酶與底物作用的位點達到飽和，雖繼續(xù)增加酶量也不會有更多的中間復合物生成，酶分子相互聚集，反而影響酶解效果，同時造成酶資源的浪費。綜合考慮，所取加酶量為1 g/100 g蛋白質(zhì)。

2.4 雙酶復配酶解小麥面粉的響應面優(yōu)化試驗

本試驗在雙酶復配基礎之上進行單因素試驗，確定了料液比、酶解pH、酶解溫度、酶解時間、加酶量等優(yōu)化條件。采用Design Expert 8.0.6軟件中的中心組合設計五因素五水平的響應面試驗，優(yōu)化雙酶復配酶解工藝，試驗設計方案及結(jié)果見表4。

表4 酶解條件優(yōu)化的響應面設計方案及結(jié)果

過敏原含量與料液比、酶解pH、酶解溫度、酶解時間、加酶量之間方差分析結(jié)果見表5。該數(shù)學模型F值10.47(P=0.008 1<0.01)，達到了極顯著水平。失擬項F值1.81(P=0.249 8>0.05)，差異不顯著。方差分析結(jié)果表明，過敏原含量回歸模型的擬合度良好。

表5 酶法以過敏原含量為響應值的優(yōu)化方差分析表

注：P<0.05為影響顯著，P<0.01為影響極顯著。

通過Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件對表4中試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合。根據(jù)方差分析結(jié)果，將不顯著的的因子去除，得到過敏原含量的回歸方程為：

Y=0.743 24+0.026 494A+0.065 186AD+0.042 107CD+0.053 319DE+0.018 769A2+0.022 930B2+0.044 142C2+0.017 533E2

由表5可得，回歸模型的一次項A(初始底物濃度，P=0.044 4)影響顯著；二次項B2、C2影響極顯著，A2、E2影響顯著；交互項AD對過敏原含量的影響極顯著，表明酶解可能使得過敏原的線性表位暴露，使得其致敏性極顯著增加；CD、DE對過敏原含量的影響顯著，表明酶解可能使得過敏原的線性表位暴露，使得其致敏性顯著增加。從F值可以看出，各個因素對過敏原含量影響的主次順序為初始底物濃度>酶解時間>酶解溫度>酶解pH>加酶量。

2.5 最佳試驗條件的確定及驗證

在所選的各因素范圍內(nèi)，通過Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件對過敏原含量這個評價指標進行條件優(yōu)化，得出雙酶同步法酶解小麥粉的最佳酶解條件為料液比為6.64%，酶解pH為6.53，酶解溫度為47.7 ℃，酶解時間為2.47 h，加酶量為0.395g/100 g蛋白質(zhì)，理論預測值過敏原含量為0.550μg/g蛋白質(zhì)。在最優(yōu)條件下進行酶解試驗的驗證，3次驗證試驗結(jié)果表明過敏原含量為0.593 μg/g蛋白質(zhì)，與理論預測值相差7.8%，在上述參數(shù)下，致敏性降低了36.1%。因此，響應面法優(yōu)化酶解小麥粉模型設計合理，適用于建立制備低致敏性小麥粉的回歸分析及參數(shù)優(yōu)化。

3 討論

本研究結(jié)果表明不同酶處理后的小麥粉過敏原含量不同，其原因是酶與底物作用的位點不同，使得小麥蛋白水解斷裂或者交聯(lián)，改變了原有蛋白質(zhì)的空間結(jié)構，造成了小麥蛋白與抗體識別能力的差異。葡萄糖氧化酶和脂肪酶處理后小麥粉致敏性分別降低了3.6%和3.0%。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理后小麥粉致敏性降低了5.0%，而Leszczyńska等[11]采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理小麥粉后，用兔血清測定了產(chǎn)物中谷蛋白的過敏原性，間接ELISA結(jié)果表明致敏性降低了30%，與本研究結(jié)果不相符，可能是由于本試驗測定產(chǎn)物中總蛋白的過敏原。Watanabe等[12]先用纖維素酶混合小麥粉再用鏈霉蛋白酶處理，從而得到了適合小麥過敏患者的低致敏性的小麥粉。其原理是纖維素酶降解小麥粉碳水化合物，鏈霉蛋白酶進一步降低小麥粉蛋白過敏原。Watanabe等[12-13]用纖維素酶、鏈酶蛋白酶處理小麥粉，表明該方法可以有效抑制小麥過敏反應且不產(chǎn)生副作用。Tanabe等[14]采用高專一性水解脯氨酸殘基附近肽段的菠蘿蛋白酶處理小麥粉，通過水解作用破壞過敏原的線性表位，來降低小麥面筋谷蛋白的致敏性。Ying等[15]研究6種蛋白酶處理小麥粉，測定小麥粉酶解物中醇溶蛋白過敏原，結(jié)果表明堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶更加有能力的降低小麥粉醇溶蛋白過敏原。但是堿性蛋白酶處理小麥粉，產(chǎn)生苦味物質(zhì)，不利于低致敏性小麥粉的制備。麥谷蛋白和麥醇溶蛋白是小麥蛋白的主要成分，麥谷蛋白分子質(zhì)量在80～120 u(高分子質(zhì)量谷蛋白亞基)和40～80 u(低分子質(zhì)量谷蛋白亞基)，麥醇溶蛋白分子質(zhì)量在30～80 u，通過菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶協(xié)同作用可更有效地降低小麥粉致敏性。國內(nèi)外鮮見菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶復配同步法酶解小麥粉及酶解后小麥粉致敏性的研究。此外，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶處理的小麥粉筋力減弱，適用于蛋糕、餅干等食品的制作[16]，為開發(fā)低致敏小麥制品提供了一個很好的途徑。

4 結(jié)論

本試驗篩選出有效降低小麥粉致敏性的酶制劑為菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，確定了同步法酶解路線，優(yōu)化了雙酶復配酶解工藝參數(shù)，通過響應面分析軟件得到了最佳的酶解條件：料液比6.64%，酶解pH 6.53，酶解溫度47.7 ℃，酶解時間2.47 h，加酶量0.395 g/100 g蛋白質(zhì)。在上述最佳條件下酶解得到過敏原含量為0.593 μg/g蛋白質(zhì)，致敏性顯著降低了36.1%(P<0.05)。

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Allergenicity Reduction of Wheat Flour by Response Surface Methodology to Optimize Enzymatic Method

Lu Xuerui Ouyang Lingli Liu Zhuang Liu Rongrong Li Huijing
(College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001)

Enzyme-linked immunosorbent assay was adopted to analyze the sensitization of wheat flour treated by six kinds of enzyme preparations.Based on the indexes of the allergen content,bromelain and papain were screened as enzymic preparations to reduce the allergenicity of wheat flour effectively and the synchronization enzymatic hydrolysis route was determined.Single factor experiment and response surface methodology were utilized to optimize enzymatic hydrolysis processing parameters.The results showed that the optimal parameters were as follows:bromelain and papain in enzyme activity ratio of 2∶5,feed liquid ratio of 6.64%,hydrolysis pH of 6.53,hydrolysis temperature of

47.7 ℃,hydrolysis time of 2.47 h,enzyme addition dosage of 0.395 g/100 g protein.Under the above optimal parameters,the allergen content reached to 0.593 μg/g protein,which indicated that there was a 7.8% difference with the theoretical value and the allergenicity was reduced by 36.1%.Therefore,the model design of enzymic method establishment and wheat flour sensitization by response surface methodology of central composite design was a feasible and reasonable mode,which could predict and prepare the allergen content of wheat flour with low sensitization.

wheat flour，bromelain，papain，allergen content，response surface methodology

國家自然科學基金(31171687)，河北農(nóng)業(yè)大學中青年骨干教師境外研修項目(201611),河北省食品科學與工程學科“雙一流”建設基金項目(2016SPGCA18)

2015-09-28

路雪蕊,女，1989年出生，碩士，糧油深加工與資源開發(fā)

李慧靜,女，1973年出生，教授，糧油深加工與資源開發(fā)

TS201.6

A

1003-0174(2017)04-0018-07