張 芹 周中凱 張惠媛(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

蕎麥殼水提物調(diào)控糖尿病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究

張 芹 周中凱 張惠媛
(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

為研究蕎麥殼水提物對糖尿病大鼠糞便菌群的影響，選取12只Wistar大鼠，糖尿病模型建立后隨機分為糖尿病組和蕎麥殼組，每組6只，于第5周末無菌采集大鼠糞便，對糞便菌群16SrRNA的V1-V3區(qū)進行擴增，利用Miseq高通量測序平臺測定基因序列，最后進行比對、分類。結(jié)果表明，蕎麥殼水提物組和糖尿病組大鼠糞便中菌群結(jié)構(gòu)及多樣性有較大差別，在目(Order)的水平上，蕎麥殼組Lactobacillales含量高于糖尿病組，糖尿病組Clostridiales含量高于蕎麥殼組；在屬(Genus)的水平上，蕎麥殼組Lactococcus、Blautia、Prevotella、Klebsiella含量高于糖尿病組，糖尿病組Ruminococcaceae_uncultured、Ruminococcaceae_unclassified、Clostridium_sensu_stricto_1、Turicibacter和Oligella含量較蕎麥殼組增加。說明糖尿病導(dǎo)致腸道菌群紊亂，大鼠通過飲用蕎麥殼水提物可改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)。

蕎麥殼水提物 糖尿病 腸道菌群 高通量測序

蕎麥是一種藥食同源的食物資源，分布于亞洲和歐洲，其中我國是世界蕎麥的主要產(chǎn)區(qū)之一，我國栽培的蕎麥種質(zhì)資源中以甜蕎為主，苦蕎種植相對較少。在蕎麥中存在許多有益成分，它既可以用作食材也可以作為藥用植物，因其優(yōu)良的保健功能，近年來蕎麥產(chǎn)品越來越受到人們的關(guān)注。然而蕎麥殼作為蕎麥制品的副產(chǎn)物，通常利用率很低，僅少部分被用于枕芯填料，大部分被直接丟棄，造成了資源的浪費。

蕎麥殼中含有大量的膳食纖維及黃酮、肌醇等，已有的研究表明，黃酮、肌醇等對于降血糖均具有一定的效果[1]。蕎麥殼中含有的抗氧化活性成分主要有蘆丁、槲皮素、沒食子酸、兒茶素和其他黃酮類物質(zhì)等。其中蘆丁含量最高，其作為一種次級植物代謝產(chǎn)物，具有很強的生物活性，對人體健康具有保健作用，能夠降低毛細血管通透性和脆性的作用，保持及恢復(fù)毛細血管的正常彈性，降低動脈硬化的風(fēng)險[2]。此外，蘆丁等生物類黃酮可通過保護胰島β細胞而預(yù)防和治療糖尿病，其對胰島素信號途徑的保護效應(yīng)可調(diào)節(jié)血脂代謝、控制細胞循環(huán)，從而實現(xiàn)降低糖脂毒性和改善胰島素抵抗[3]。近幾年來，有研究表明，存在于腸道內(nèi)的微生物，即腸道菌群，與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，糖尿病患者通常伴隨著腸道菌群紊亂的狀況[4]。蕎麥殼的活性成分在改善糖尿病癥狀的同時[1]，是否對腸道菌群有一定的改善作用，卻鮮有報道。因而，本研究通過建立糖尿病大鼠模型，研究蕎麥殼對糖尿病大鼠腸道菌群的影響，以期為蕎麥副產(chǎn)物的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器

蕎麥殼：為苦蕎(F.tataricumL.Gaertn.)品種，產(chǎn)自四川涼山地區(qū)。2%鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)溶液：溶劑為0.1 mol/L，pH=4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，現(xiàn)用現(xiàn)配。Stool DNA Kit糞便DNA提取試劑盒：Omega Biotek公司。ABI GeneAmp?9700型PCR儀：美國ABI公司。

1.1.2 實驗動物和樣品采集

Wistar大鼠：中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號：2012-0004，平均體重146.25±5.04 g，于天津科技大學(xué)實驗動物中心清潔級屏障動物實驗室飼養(yǎng)。動物日常護理及實驗條件參照《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境及設(shè)施標準》。本次動物試驗得到天津科技大學(xué)動物倫理委員會的許可，許可證號：2014-14-027。

大鼠自購入起基礎(chǔ)飼料適應(yīng)1周后尾靜脈注射STZ，注射量為45 mg/kg體重，注射時STZ冰浴并且30 min內(nèi)注射完，大鼠72 h后尾靜脈采血測隨機血糖值，血糖≥16.7 mmol/L作為大鼠建模成功的標準。造模成功的大鼠隨機分為糖尿病組(T1D組)和蕎麥殼組(HULL組)，蕎麥殼組大鼠自由飲用蕎麥殼水提物，而糖尿病組大鼠自由飲水，各組動物自由采食基礎(chǔ)飼料，飼料營養(yǎng)成分見表1。每組2籠，每籠3只。于第5周末，無菌采集大鼠糞便，每組取3個重復(fù)，放入滅菌后的離心管中以備菌群分析。

表1 動物飼料營養(yǎng)成分表

1.2 方法

1.2.1 蕎麥殼水提物的制備及抗氧化能力和多酚含量的測定

蕎麥殼樣品用75%的食用乙醇進行殺菌處理，然后自然晾干。將30 g處理后的蕎麥殼樣品加入500 mL純凈水中，進行超聲波雙頻提取，頻率分別為25 kHz和40 kHz，功率為240 W，時間為40 min，然后進行離心(3 000 r/min，15 min)，取上清液采用HPLC法測定總酚、黃酮、沒食子酸、原兒茶酸、蘆丁和槲皮素的含量[5]。每個指標均進行3次重復(fù)，結(jié)果以平均數(shù)±標準偏差(x±s)表示。

1.2.2 大鼠糞便菌群的基因組DNA提取與PCR擴增

采用Stool DNA Kit抽提大鼠糞便DNA，步驟按照說明書進行。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性。

采用引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、533R 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′，擴增細菌16SrRNA的V1-V3區(qū)。PCR反應(yīng)體系為：5×FastPfu緩沖液4 μL，5 μmol/L的正向引物0.8 μL，5 μmol/L的反向引物0.8 μL，DNA 10 ng，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，加ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；26個循環(huán)包括95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min，至10 ℃時停止。每個樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣量為3 μL。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物采用Miseq高通量測序平臺進行高通量測序。高質(zhì)量序列的提取:Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，將成對的reads拼接成1條序列，同時對reads質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)量質(zhì)控和過濾，去除序列末端的后引物和接頭序列、多堿基N、polyA/T尾巴及低質(zhì)量堿基；去除所得序列的barcode標簽序列、前引物序列以及長度短于200 bp、模糊堿基數(shù)>0、序列平均質(zhì)量低于20的序列。

操作單元(operational taxonomic units,OTU)聚類分析：提取非重復(fù)序列，使用QIIME分析平臺進行序列的生物信息學(xué)分析，與Silva數(shù)據(jù)庫中已比對的16S核糖體序列數(shù)據(jù)庫進行比對，對相似性在97%以上的序列進行歸并，生成分類操作單元OTU；菌群多樣性分析：根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果，進行alpha和beta多樣性計算，采用Ace、Chao、Simpson、Shannon評估指數(shù)分別對樣本進行多樣性分析。其中Ace、Chao指數(shù)是對菌群豐度進行評估；Simpson、Shannon指數(shù)對菌群多樣性進行評估；菌群分類學(xué)分析：采用R軟件將OTU中全部序列與Silva數(shù)據(jù)庫進行比對，找出其最相近且可信度達80%以上的種屬信息。并將每一個OTU中的所有序列進行類比，找出同一OTU中的不同序列的最近祖先的種屬信息。根據(jù)Silva庫中的參考序列對OTU進行種屬鑒定；菌群群落結(jié)構(gòu)分析：根據(jù)分類學(xué)分析比對結(jié)果，在屬水平上對樣品中群落結(jié)構(gòu)進行菌群種類和豐度分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用R軟件(R i386 3.0.1)進行繪圖分析，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蕎麥殼中部分酚類物質(zhì)含量

由表2可見，蕎麥殼水提物中總酚、黃酮含量均較高，總酚達到4.359 mg/g，黃酮含量為3.096 mg/g，進一步檢測水提物中主要多酚物質(zhì)的含量，包括沒食子酸、原兒茶酸、蘆丁和槲皮素，其中以蘆丁含量為最高，達3.055 mg/g，說明蕎麥殼水提物中的黃酮成分主要為蘆丁。

表2 蕎麥殼水提物中酚類物質(zhì)含量/mg/g

2.2 大鼠糞便菌群測序質(zhì)量及多樣性統(tǒng)計分析

由表3可見，糖尿病組糞便菌群基因序列經(jīng)97%相似性歸并后得到256個OTUs，蕎麥殼組得到241個OTUs。糖尿病組OTU較蕎麥殼組多，表明糖尿病組菌群多樣性較高，測序深度(Coverage)均在0.99以上，說明樣品中序列未被測到的概率較低。糖尿病組Chao指數(shù)平均值為296，蕎麥殼組為283，Ace、Chao指數(shù)是對菌群豐度進行的評估，以上數(shù)據(jù)表明，糖尿病組菌群豐富性較蕎麥殼組高；糖尿病組Simpson指數(shù)平均值為0.06，Shannon指數(shù)為3.87，蕎麥殼組Simpson指數(shù)平均值為0.09，Shannon指數(shù)為3.66，Simpson指數(shù)值越大，表明群落多樣性越低，Shannon值越大，表明群落多樣性越高。以上數(shù)據(jù)均表明糖尿病大鼠腸道菌群多樣性和豐度升高，而通過蕎麥殼水提物的飲食干預(yù)可在一定程度上減少糖尿病大鼠腸道菌群的多樣性和豐度。

表3 糖尿病組與蕎麥殼組微生物豐度及多樣性比較

注：各數(shù)據(jù)無上標表示同列間無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

在Phylum(門)的水平上，各組樣品的微生物群落構(gòu)成及其相對豐度如圖1所示。所有樣品均包含F(xiàn)irmicutes(厚壁菌門)和Bacteroidetes(擬桿菌門)2個主要的門，同時還包含Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)，Tenericutes(柔壁菌門)及其它一些門的微生物。

由圖2可見，在目(Order)的水平上，相對豐度較高的是Clostridiales、Lactobacillales、Bacteroidales3個主要的目，糖尿病組Clostridiales含量顯著高于蕎麥殼組，而蕎麥殼水提物組Lactobacillales顯著高于糖尿病組。另外，糖尿病組Erysipelotrichales、RF9、Burkholderiales含量高于蕎麥殼組，而蕎麥殼水提物組Corynebacteriales、Enterobacteriales含量高于糖尿病組。

注：HULL為蕎麥殼處理組，T1D為糖尿病組，各組均3個重復(fù)，余同。

圖1 糖尿病組和蕎麥殼大鼠糞便菌群在門水平上的分布

圖2 糖尿病組和蕎麥殼組大鼠糞便菌群在目水平上的分布

由圖3可見，在屬(Genus)的水平上，相對豐度較高的是Lactobacillus(乳酸菌屬)、S24-7_norank、Ruminococcaceae_uncultured3個屬，蕎麥殼組Lactobacillus、Lactococcus、Blautia、Prevotella、Klebsiella較糖尿病組升高，而Ruminococcaceae_uncultured、Ruminococcaceae_unclassified、Clostridium_sensu_stricto_1、Turicibacter、Oligella較糖尿病組有一定程度降低。

2.4 蕎麥殼組和糖尿病組大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)差異性比較

將豐度在前64位的微生物進行各組間豐度相似性聚類得到的heatmap，通過顏色梯度及相似程度反映各組在屬水平上群落組成的相似性和差異性。由圖4可見，糖尿病組3個重復(fù)有較高的相似性，蕎麥殼組3個重復(fù)間也呈現(xiàn)出較高的相似性。

通過門和屬水平的分析以及微生物群落結(jié)構(gòu)的heatmap分析，初步表明蕎麥殼組大鼠與糖尿病大鼠腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有較大差異。為進一步分析其差別，對每一樣品的OTU信息構(gòu)建了未加權(quán)的Unifrac歐氏距離矩陣(unweighted Unifrac distance matrix)?；谶@一矩陣進行了主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)。結(jié)果如圖5所示，前2個主成分分別解釋了總變量的53.67%和18.94%，說明其導(dǎo)致了糖尿病組和蕎麥殼組腸道菌群的差異，共解釋總變量的72.61%。在X軸的方向上，蕎麥殼組和糖尿病組的3個重復(fù)之間差異均較小，糖尿病組3個重復(fù)之間也差異較小，蕎麥殼組3個重復(fù)與糖尿病組3個重復(fù)在X軸的方向距離較遠，2組飼養(yǎng)條件及糖尿病造模一致，表明可能是蕎麥殼水提物的添加導(dǎo)致了2組腸道菌群之間差異較大。

圖3 糖尿病組和蕎麥殼組大鼠糞便菌群在屬水平上的分布

圖4 糖尿病組和蕎麥殼組糞便菌群熱圖分析

圖5 蕎麥殼組和糖尿病大鼠糞便菌群的主坐標分析

3 討論

本試驗對蕎麥殼水提物影響糖尿病鼠的腸道菌群進行了較為深入的研究，發(fā)現(xiàn)蕎麥殼水提物可影響糖尿病大鼠糞便菌群的多樣性和豐度。本課題組已對糖尿病大鼠的腸道菌群的變化特征進行了多次研究，均發(fā)現(xiàn)糖尿病可導(dǎo)致其腸道微生物的多樣性和豐度升高。Claesson等[6]對老年人的腸道菌群進行分析發(fā)現(xiàn)，腸道菌群的多樣性增加與體弱及疾病有很大關(guān)聯(lián)。本研究與該報道一致，糖尿病大鼠糞便菌群多樣性較高，而通過飼喂蕎麥殼水提物后，菌群多樣性有一定程度的降低，說明腸道菌群與糖尿病的發(fā)病之間可能存在一定關(guān)聯(lián)。

近幾年，較多研究表明，糖尿病患者腸道菌群發(fā)生了改變[4,7-8]。Larsen等[7]以18個2型糖尿病男性患者及18個正常男性為研究對象，采用454高通量測序技術(shù)對其糞便中微生物16SrRNA基因的V4區(qū)進行了測序，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者微生物菌群多樣性有較大差異。Lê等[8]采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究糖尿病患者和正常人群的糞便菌群，發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腸道的雙歧桿菌數(shù)目顯著低于健康人，而腸糞球菌數(shù)目高于健康人。Qin等[4]利用最新的腸道宏基因組測序(MGWAS)技術(shù)研究了342例中國2型糖尿病患者的糞便發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的腸道菌群發(fā)生了輕度紊亂，某些產(chǎn)丁酸細菌減少、機會致病菌增加，如Bacteroidescaccae、Clostridiumhathewayi、Clostridiumramosum、Clostridiumsymbiosum、Eggerthellalenta及Escherichiacoli，說明糖尿病患者通常伴隨著腸道菌群紊亂。

本研究采集大鼠糞便，采用Miseq高通量測序平臺檢測微生物組成和多樣性，將檢測到的微生物由門到種進行各個水平上的分類，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠糞便菌群與蕎麥殼組的糞便菌群存在差異。在目(Order)的水平上，Clostridiales、Lactobacillales、Bacteroidales在糖尿病組和蕎麥組均含量較高，蕎麥殼組Lactobacillales、Corynebacteriales、Enterobacteriales含量高于糖尿病組；糖尿病組Clostridiales、Erysipelotrichales、Burkholderiales含量高于蕎麥殼組，Burkholderiales屬變形菌門綱(Proteobacteria)，為革蘭氏陰性菌，包含很多重要的病原菌。在屬(genus)水平的分類上，蕎麥殼組Lactobacillus、Lactococcus、Blautia、Prevotella、Klebsiella較糖尿病組升高，Lactobacillus屬菌株通過在腸道內(nèi)產(chǎn)生有機酸降低腸道pH值、產(chǎn)生H2O2及細菌素等抗菌物質(zhì)抑制病原菌在腸道內(nèi)的增殖，以保持腸道微生態(tài)平衡。Lactococcus也是腸道中的有益菌，Lactobacillus和Lactococcus常被添加于酸奶及微生態(tài)制劑中用于調(diào)節(jié)腸道菌群。Blautia屬在腸道內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對于維持腸道健康有重要作用。Prevotella在以碳水化合物為主導(dǎo)飲食的人體腸道中含量較多，說明糖尿病大鼠飲用蕎麥殼水提物改善了腸道菌群。Klebsiella是腸道中的正常菌群，為適應(yīng)特定的環(huán)境會大量增殖，本研究中Klebsiella在種水平上進行分類為Klebsiella_unclassified，其與蕎麥殼提取物的代謝存在怎樣的關(guān)系有待進一步研究。從微生物在屬(genus)水平的分布柱狀圖中也可發(fā)現(xiàn)，蕎麥殼組Ruminococcaceae_uncultured、Ruminococcaceae_unclassified、Clostridium_sensu_stricto_1、Turicibacter、Oligella較糖尿病組有一定程度降低，Ruminococcaceae為大腸和糞便中的優(yōu)勢菌群，Oligella在種水平上進行分類為Oligellaureolytica，其為需氧革蘭氏陰性病原菌，常引起機體的感染。Clostridium_sensu_stricto_1及Turicibacter目前報道較少，但本課題組在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，相對于無糖尿病的大鼠，糖尿病大鼠糞便中Clostridium_sensu_stricto_1及Turicibacter顯著升高，因而Clostridium_sensu_stricto_1及Turicibacter與糖尿病之間的相關(guān)性仍需進一步的研究。腸道菌群在目和屬水平上的含量分布均表明，糖尿病大鼠與蕎麥殼處理的大鼠腸道菌群存在較大差異。本研究檢測糖尿病大鼠的糞便菌群，發(fā)現(xiàn)其中含有大量的致病菌，如Oligellaureolytica、Burkholderiales等，表明糖尿病大鼠存在一定程度的腸道菌群紊亂狀況。本研究中，糖尿病大鼠糞便中致病菌種類與Qin等[4]的報道不一致，可能是由于試驗對象和飲食結(jié)構(gòu)不同造成的。

蕎麥殼組和糖尿病組大鼠腸道菌群發(fā)生顯著變化的因素可能是蕎麥殼水提物的使用(圖5)。蕎麥殼含有大量的酚類化合物(表1)，可以作為抗氧化劑，起到抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防和抗癌以及抑制醛糖還原酶活性的作用[9]。酚類化合物在食物組分中是很重要的部分，其含量雖遠低于碳水化合物、蛋白質(zhì)等，但相關(guān)研究表明這類化合物在調(diào)控腸道微生物結(jié)構(gòu)等方面起到很重要的作用，參與多數(shù)腸道微生物的代謝過程，在大腸中酚類化合物與大腸微生物的交互作用對機體健康的影響起到重要作用[10]。酚類化合物在人體內(nèi)的吸收行為較復(fù)雜，目前較多研究表明,多酚在人體內(nèi)99%以自由酚的形式存在，經(jīng)人體攝入后，只有5%～10%在人體的十二指腸中被吸收，其余多酚未被小腸吸收而到達大腸，在大腸中被腸道微生物菌群代謝[11]。大鼠飲用蕎麥殼水提物后，很多種類的微生物的比例發(fā)生了顯著變化，蕎麥殼中的多酚物質(zhì)怎樣促進或者抑制腸道那些微生物生長的關(guān)系仍有待進一步的研究。

4 結(jié)論

利用大鼠建立糖尿病模型，并使糖尿病大鼠飲用蕎麥殼水提物，利用高通量測序技術(shù)研究糖尿病大鼠和蕎麥殼組大鼠的糞便菌群。發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠存在腸道菌群紊亂的狀況，而利用蕎麥殼提取物干預(yù)糖尿病大鼠，可增加糞便中有益菌含量，表明蕎麥殼提取物改善了糖尿病大鼠的腸道菌群。利用食品加工技術(shù)，將蕎麥殼加工成相關(guān)制品或提取有效成分，以供糖尿病患者食用，將對改善糖尿病癥狀起到積極的效果。

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The Manipulation of Faecal Microbiota in Diabetic Rats Intervened with Water Extract of Buckwheat Hull

Zhang Qin Zhou Zhongkai Zhang Huiyuan
(College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457)

In order to investigate the effect of water extract of buckwheat hull on faecal microbiota of diabetic rats,12 Wistar rats were randomly divided into diabetic and buckwheat hull groups.The fecal bacterial composition was investigated by Miseq high-throughput sequencing of the V1-V3 region of the 16SrRNA gene.Results showed that bacterial diversity and richness in diabetic subjects were somewhat higher than that in buckwheat hull group.Using the taxonomic characterization from the gene sequence,the results showed that the microbials enriched in buckwheat hull group were fromLactobacillales.while most of T1D-enriched microbials were from orderClostridiales,This study also found the proportion of genusLactobacillus，Lactococcus，Blautia，PrevotellaandKlebsiellawere increased in buckwheat hull group compared to that in the diabetic group,and the genusRuminococcaceae_uncultured,Ruminococcaceae_unclassified,Clostridium_sensu_stricto_1，TuricibacterandOligellawere reduced in buckwheat hull group compared to that in diabetic group.Our findings indicated that T1D rats had a moderate degree of gut bacterial dysbiosis,and water extract of buckwheat hull had a positive effect on gut microbiota.

water extract of buckwheat hull，diabetes，microbiota，high-throughput sequencing

國家自然科學(xué)基金(31471701)

2015-09-24

張芹，女，1981年出生，助理研究員，微生物學(xué)

周中凱，男，1964年出生，教授，博士生導(dǎo)師，食品科學(xué)與營養(yǎng)

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A

1003-0174(2017)04-0031-07