岳愛琴 王衛(wèi)東 徐海軍 王 敏 郭春絨 趙晉忠 杜維俊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院1，太谷 030801)(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院2，太谷 030801)

不同大豆品種大豆皂苷組成分析

岳愛琴1王衛(wèi)東2徐海軍2王 敏1郭春絨2趙晉忠2杜維俊1

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院1，太谷 030801)(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院2，太谷 030801)

為明確山西大豆資源胚和子葉中大豆皂苷含量的分布情況，篩選特異資源在育種中應(yīng)用，本研究以71份山西大豆種質(zhì)資源為材料，采用高效液相色譜-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MS/MS)分析不同材料中大豆皂苷組成和含量的差異。結(jié)果表明：參試材料胚和子葉中大豆皂苷含量變異范圍分別為17.02～83.51 mg/g和6.53～50.11 mg/g。A類、DDMP類、B類和E類皂苷均與總皂苷含量呈極顯著正相關(guān)。小粒型大豆材料胚中B類和E類皂苷含量、子葉總皂苷和DDMP類皂苷含量顯著高于中粒和大粒型材料。野生、半野生大豆材料胚中B類、E類大豆皂苷含量顯著高于栽培品種；野生大豆子葉總皂苷、DDMP類皂苷含量顯著高于半野生和栽培大豆。

大豆 皂苷 HPLC-ESI-MS/MS 百粒重

大豆皂苷是大豆種子生長(zhǎng)過程中形成的主要次生代謝產(chǎn)物之一。大豆皂苷屬于三萜類齊墩果酸型皂苷，主要分為A類、DDMP(2, 3-dihydro-2, 5-dihydroxy-6- methyl -4H-pyran-4-one)類、B類和E類皂苷4類[1-2](表1)。A類皂苷是大豆皂醇A在C-3和C-22位結(jié)合2個(gè)糖鏈組成，其中C-22位糖鏈末端糖基乙?；蠖乖泶糂在C-3位和C-22位分別結(jié)合1個(gè)糖鏈和DDMP基團(tuán)形成DDMP類皂苷，而DDMP類皂苷C-22位失去DDMP基團(tuán)形成B類皂苷，E類皂苷是B類皂苷C-22位發(fā)生氧化形成的[3-4]。研究表明，A類皂苷末端糖基乙?；瘜?dǎo)致大豆及其制品具有苦味和澀味[5]，而DDMP類、B類和E類皂苷具有降低膽固醇、抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、抗血脂氧化、抗炎以及抗HIV病毒等多種對(duì)人體有益的生理功能[6-10]。DDMP類、B類和E類大豆皂苷在植物中還可引起植物的防御反應(yīng)，使植物體具有抗菌、抗病毒和抗蟲等抗性[11-13]。因此，開展大豆皂苷遺傳改良，降低A類皂苷的合成積累，提高DDMP類、B類和E類皂苷含量，是提高大豆品質(zhì)及市場(chǎng)價(jià)值的一條經(jīng)濟(jì)有效途徑。

表1 大豆種子中大豆皂苷的種類

大豆皂苷組成和含量變異豐富的大豆資源以及大豆特異種質(zhì)資源的發(fā)掘，有利于今后開展大豆皂苷品質(zhì)的遺傳改良。目前，日本、韓國(guó)和美國(guó)等國(guó)家針對(duì)大豆種質(zhì)資源的大豆皂苷進(jìn)行了檢測(cè)[14-17]。Kim等[16]對(duì)來(lái)源于中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)3個(gè)國(guó)家大豆材料的大豆皂苷元A和B含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)我國(guó)大豆皂苷元含量位居首位，并且存在較大的變異范圍。然而我國(guó)對(duì)大豆皂苷的研究主要在醫(yī)藥和提取分離領(lǐng)域[18-20]，關(guān)于大豆皂苷組成和含量的研究較少[21]。此外，當(dāng)前研究者主要是對(duì)大豆整個(gè)籽粒的皂苷含量進(jìn)行測(cè)定，將胚和子葉分別進(jìn)行測(cè)定的報(bào)道較少。為此本研究利用HPLC-ESI-MS/MS對(duì)山西大豆種質(zhì)資源胚和子葉中大豆皂苷組成和含量分別進(jìn)行測(cè)定，明確皂苷各組成含量的變異范圍和規(guī)律，鑒定大豆皂苷組成和含量特異的種質(zhì)資源，以用于改良大豆皂苷品質(zhì)的育種與研究，為今后大豆功能產(chǎn)品的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種室提供的71份大豆材料作為研究對(duì)象，其中7份野生大豆，20份半野生大豆，44份栽培大豆。供試大豆材料于2015年種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，按小區(qū)種植，成熟后收獲種子，風(fēng)干，保存用于檢測(cè)大豆皂苷。Aa、Ab、Ba、Bb標(biāo)準(zhǔn)品：日本常磐植物化學(xué)研究所。

TSQ Quantum Ultra液質(zhì)聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技有限公司；震動(dòng)球磨儀GT200：北京格瑞曼儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆皂苷的提取

取0.1 g胚粉和子葉粉于離心管中，加入1 mL提取液(70%甲醇+0.01%乙酸)，超聲振蕩10 min后室溫浸提24 h，取上清液用2倍體積的正己烷萃取脫脂，0.22 μm濾膜過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HPLC-ESI-MS/MS分析大豆皂苷組分

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold(150 mm×2.1 mm，5 μm粒徑)。流動(dòng)相A：0.025%(V/V)乙酸的乙腈溶液；流動(dòng)相B：0.025%(V/V)乙酸的水溶液。梯度洗脫程序：0～12.5 min，13%～30%B；12.5～17.5 min，30%～40%B；17.5～23.5 min，40%B；23.5～27.5 min，40%～60%B；27.5～30 min，60%～100%B；30～35 min，100%B；36 min，13%B；平衡柱子6 min；運(yùn)行時(shí)間42 min；流速200 μL/min；噴霧電壓：3 500 V；鞘氣壓力30；輔氣壓力5；毛細(xì)管溫度：350 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用微量電子天平精確稱取大豆皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Aa、Ab、Ba、Bb各5 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL，配成1 000 μg/mL的儲(chǔ)備液。將各儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為100、200、400、800、1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。Aa、Ab、Ba、Bb的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為YAa=34.244X+672.00、YAb=6.815X+125.53、YBa=21.926X-98.328、YBb=16.581X-231.15。

1.2.2.3 樣品中大豆皂苷各組分的分析測(cè)定

每個(gè)樣品運(yùn)行42 min之后，調(diào)為選擇性離子抽提模式，抽提36種大豆皂苷組分的譜圖，根據(jù)質(zhì)荷比定性。根據(jù)Aa、Ab標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中A類皂苷各組分的含量，Ba、Bb標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中DDMP類、B類、E類皂苷各組分含量。樣品中A類、DDMP類、B類、E類皂苷含量為其各組分含量之和。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel及SPSS17.0對(duì)胚和子葉中大豆皂苷含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆皂苷總含量分析

用HPLC-ESI-MS/MS對(duì)山西71份大豆材料胚和子葉中大豆皂苷含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種之間大豆皂苷總含量差異較大，所有參試品種胚和子葉中總皂苷含量平均值分別為37.24和13.04 mg/g，其含量變異范圍分別為17.02～83.51 mg/g和6.53～50.11 mg/g(表2)。半野生材料WS258胚中總皂苷含量最高，栽培種強(qiáng)豐一號(hào)子葉總皂苷含量最高。所有參試材料中，胚中大豆皂苷總含量為子葉中的1.42～7.16倍。

表2 大豆胚和子葉中皂苷含量分析/mg/g

2.2 大豆皂苷各組分含量分析

不同大豆材料胚和子葉A類、DDMP類、B類和E類皂苷含量也存在較大的變異。其中胚和子葉A類皂苷的變異范圍分別為7.39～65.64 mg/g、0.62～29.14 mg/g，DDMP類皂苷的變異范圍分別為1.99～38.60 mg/g、1.13～20.86 mg/g。B類和E類皂苷含量相對(duì)較低，但品種之間仍然存在較大的變異幅度(表2)。說明在大豆種質(zhì)資源中可以篩選出低A類皂苷含量，高DDMP類、B類和E類皂苷含量的特用種質(zhì)，從而有利于開展大豆皂苷的優(yōu)質(zhì)育種工作。胚和子葉中A類皂苷含量之比為4.6∶1，DDMP類、B類和E類皂苷含量總和在胚和子葉中的比值為1.5∶1。A類皂苷在胚和子葉中分別占總皂苷含量的68.78%、43.17%。DDMP類皂苷胚和子葉中分別占總皂苷含量19.92%、51.38%。

2.3 大豆皂苷含量的相關(guān)分析

分析大豆胚和子葉中各類皂苷含量及其與總含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)胚和子葉中，A類、DDMP類、B類和E類皂苷均與總皂苷含量呈極顯著正相關(guān)。其中胚和子葉中A類皂苷與總皂苷相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.8以上；胚和子葉中A類皂苷與DDMP類皂苷相關(guān)性均不顯著；胚中DDMP類皂苷與B類、E類皂苷相關(guān)性均不顯著，而子葉中呈極顯著相關(guān)(表3、表4)。

表3 大豆胚中各類皂苷含量與總量的相關(guān)分析

注：﹡表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；﹡﹡表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)；下同。

表4 大豆子葉中各類皂苷含量與總量的相關(guān)分析

2.4 不同粒重類型大豆材料中皂苷含量的比較分析

根據(jù)百粒重大小將參試材料分為小粒(<13 g)、中粒(13～24 g)和大粒(>24 g)3種類型。對(duì)不同類型胚和子葉大豆皂苷含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)小粒型大豆材料胚中B類、E類大豆皂苷含量平均值分別高達(dá)3.51、1.71 mg/g，顯著高于中粒和大粒型材料，不同粒重大豆材料胚DDMP類皂苷和總皂苷含量差異不顯著(表5)。而小粒型材料子葉總皂苷、DDMP類皂苷含量平均值分別高達(dá)15.10、8.21 mg/g，顯著高于中粒型和大粒型品種。不同粒重大豆材料胚和子葉A類皂苷含量均無(wú)顯著差異(表6)。

表5 不同粒重類型胚大豆皂苷含量比較分析/mg/g

注：不同小寫字母表示同列之間的顯著性差異(P<0.05)，下同。

表6 不同粒重類型大豆材料子葉中皂苷含量比較分析/mg/g

2.5 野生、半野生、栽培大豆材料大豆皂苷含量的比較分析

對(duì)野生、半野生、栽培大豆材料子葉和胚中的大豆皂苷含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)野生、半野生大豆材料胚中B類、E類大豆皂苷含量顯著高于大豆栽培品種，而A類、DDMP類和總皂苷含量差異不顯著。野生大豆材料子葉中總皂苷、DDMP類皂苷含量平均值分別高達(dá)18.81、12.21 mg/g，顯著高于半野生和栽培大豆(表7、表8)。說明野生大豆材料是大豆皂苷含量遺傳改良的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。

表7 野生、半野生和栽培大豆胚中大豆皂苷含量比較分析/mg/g

表8 野生、半野生和栽培大豆子葉中大豆皂苷含量比較分析/mg/g

3 討論

本研究采用HPLC-ESI-MS/MS分析山西大豆材料胚和子葉中大豆皂苷含量，變異范圍分別為17.02～83.51 mg/g和6.53～50.11 mg/g，平均值分別為37.24和13.04 mg/g 。皂苷組成和含量豐富的遺傳變異，有利于今后開展大豆皂苷品質(zhì)育種工作。由于A類皂苷可引起大豆及其制品具有苦澀味[5]，而DDMP類、B類和E類皂苷具有多種對(duì)人體有益的生理功能[6-10]，因此富含DDMP類、B類和E類皂苷材料的利用價(jià)值高于富含A類皂苷的材料。本試驗(yàn)條件下，胚和子葉A類皂苷的變異范圍分別為7.39～65.64 mg/g、0.62～29.14 mg/g，DDMP類皂苷的變異范圍分別為1.99～38.60 mg/g、1.13～20.86 mg/g。說明在大豆種質(zhì)資源中可以篩選出低A類皂苷含量，高DDMP類、B類和E類皂苷含量的特用種質(zhì)，從而有利于開展大豆皂苷的優(yōu)質(zhì)育種工作。

本研究表明胚和子葉中大豆皂苷組成和含量不同，胚中大豆皂苷總含量是子葉中的1.42～7.16倍。胚中A類皂苷占總皂苷含量的68.78%，DDMP類、B類和E類皂苷含量?jī)H占31.22%；子葉中A類皂苷占總皂苷含量的43.15%，而DDMP類、B類和E類皂苷所占比例達(dá)56.85%。Kim等[16]研究表明，不同籽粒大小大豆皂醇A和B含量不同。Jang等[17]研究表明，小粒型整個(gè)籽粒大豆皂苷總含量高于中粒和大粒型大豆材料。本研究發(fā)現(xiàn)不同籽粒大小大豆材料胚中B類、E類大豆皂苷差異顯著，DDMP類和總皂苷含量差異不顯著；而子葉總皂苷和DDMP類皂苷含量差異顯著。這可能是由于胚和子葉中大豆皂苷具有不同積累和調(diào)控途徑，但關(guān)于胚和子葉中大豆皂苷積累機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，山西大豆材料胚和子葉中大豆皂苷組成和含量存在較大的變異范圍，可以為大豆皂苷含量的改良提供優(yōu)質(zhì)材料。A類、DDMP類、B類和E類皂苷含量均與總皂苷含量呈極顯著正相關(guān)。不同百粒重和生態(tài)類型大豆材料子葉中總皂苷含量差異顯著，胚中差異不顯著。小粒型大豆材料子葉總皂苷含量顯著高于中粒和大粒型材料，野生大豆子葉總皂苷含量顯著高于半野生和栽培大豆，而胚總皂苷含量差異不顯著。

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Analysis of Soyasaponin Compounds in Different Soybean Varieties

Yue Aiqin1Wang Weidong2Xu Haijun2Wang Min1Guo Chunrong2Zhao Jinzhong2Du Weijun1

(College of Agronomy, Shanxi Agricultural University1, Taigu 030801)(College of Arts and Science, Shanxi Agricultural University2, Taigu 030801)

To understand soyasaponins content distribution in hypocotyls and cotyledons of soybean seeds in Shanxi, and to isolate specific resources in breeding application, we analyzed soyasaponins content in 71 varieties from Shanxi using high-performance liquid chromatography(HPLC)-electrospray ionization(ESI)-mass spectrometer(MS)/ MS. Results indicated that, the total content of soyasaponins among the soybeans varied from 17.02 to 83.51 mg/g in hypocotyls, from 6.53 to 50.11 mg/g in cotyledons. Group A, DDMP, B and E had a high positive correlation with the total soyasaponins content. Among the different-sized soybean seeds, the average Group B and E content of the hypocotyls, the total soyasaponins and Group DDMP content of the cotyledons in small seeds were higher than that in medium or large seeds. The hypocotyls of wild and semi-wild soybeans had higher concentration of average Group B and E soyasaponins than cultivated soybean, and the cotyledons of wild soybeans had higher total soyasaponins and Group DDMP content than that of semi-wild and cultivated soybeans.

soybean, soyasaponin, HPLC-ESI-MS/MS, hundred-grain weight

時(shí)間：2017-01-24

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20120311005-3),山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目(2015148)，山西省自然科學(xué)基金(201601D011076)

2016-03-13

岳愛琴，女，1975年出生，副教授，大豆品質(zhì)育種

杜維俊，女，1968年出生，教授，野生大豆資源鑒定、分子評(píng)價(jià)和種質(zhì)創(chuàng)新

S565.1

A

1003-0174(2017)05-0038-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20170124.1049.002.html