張曉慧 孟慶然 張連富,2

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122) (國家功能食品工程技術(shù)研究中心2，無錫 214122)

甘露醇辛酸二酯的酶法合成、鑒定及其應(yīng)用研究

張曉慧1孟慶然1張連富1,2

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122) (國家功能食品工程技術(shù)研究中心2，無錫 214122)

脂肪酶催化合成甘露醇辛酸二酯，利用HPLC-MS確定產(chǎn)物，使用混合介質(zhì)正己烷：乙醚(7∶3)對目標產(chǎn)物進行萃取純化，產(chǎn)物純度達到90%以上。采用HPLC-MS、NMR確定目標產(chǎn)物為1,6-二辛酸甘露醇酯。將甘露醇辛酸二酯添加到不同植物油中，探討在不同植物油中的最低添加量以及在不同加工條件下所制備凝膠油的加工特性。添加量達到0.8%～1.0% (m/m) 時，植物油即可呈現(xiàn)較好的凝膠態(tài)。在添加量為10%，攪拌速率為500 r/min，加熱溫度為125 ℃條件下所制備的凝膠油具有穩(wěn)定的加工特性。

甘露醇辛酸二酯 酶法合成 分離純化 凝膠油 流變

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，焙烤類、涂抹類等食品所占的比重越來越大，這就使得食品專用油脂的消耗量快速增加[1]。目前，國內(nèi)市場上常見的專用油脂(人造奶油或涂抹脂產(chǎn)品等)大多數(shù)以氫化油為主要成分，其中反式脂肪酸和飽和脂肪酸含量(質(zhì)量分數(shù)在10%左右)超標問題比較嚴重[2]。研究表明，食用大量含反式/飽和脂肪酸的食物會加速動脈硬化，容易誘發(fā)心腦血管疾病、冠心病、糖尿病和老年癡呆等疾病[3-4]，故積極研究開發(fā)低/零反式脂肪酸和低飽和脂肪酸類型的專用油脂產(chǎn)品具有重大意義[5]。基于這一認識，液態(tài)植物油有機結(jié)構(gòu)化所制備的凝膠化油脂越來越受到重視。

常見的凝膠油制備方法是通過添加小分子凝膠劑到液態(tài)植物油中，在一定的加工條件下，使液態(tài)油成為固態(tài)或半固態(tài)的膠狀物。此種方法制備的凝膠油通常具備可加工的黏彈性，且滿足低反式脂肪酸和低飽和脂肪酸等要求[6-7]。目前，用于制備凝膠油的凝膠因子主要有脂肪酸、脂肪醇、植物蠟及植物素等[8]。這些凝膠劑大多是長碳鏈脂肪酸及其衍生物，不易消化且對人體無額外的營養(yǎng)的價值，故研究開發(fā)中碳鏈的脂肪酸酯備受青睞[9]。本研究通過酶法合成一種新型的中碳鏈脂肪酸糖醇酯，通過分離純化得到目標產(chǎn)品。將純化產(chǎn)物添加到液態(tài)植物油中，研究產(chǎn)物的凝膠效果。本研究不僅豐富了凝膠因子的種類，也為開發(fā)新的凝膠劑提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Novozym 435固定化脂肪酶(10 000 PLU/g)：諾維信中國生物技術(shù)有限公司；4?分子篩：上海環(huán)球分子篩有限公司；精煉一級大豆油：上海益海嘉里公司；色譜級甲醇、AR級甘露醇、辛酸、丙酮、正己烷、乙醚等：中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 試驗儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；ELSD 3300蒸發(fā)光散射檢測器：美國Alltech公司；ZMD 4000 Mass檢測器：美國Waters公司；Physica MCR301型流變儀：奧地利Anton Par公司；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器：常州邁科諾儀器有限公司；ADVANCE Digital 400MHz核磁共振譜儀：德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘露醇辛酸酯的合成

甘露醇(0.364 g)、辛酸(0.864 g)稱量至25 mL圓底燒瓶中，加入15 mL丙酮，于磁力攪拌上平衡1 h后加入0.1 g酶催化劑、2 g 4?分子篩，混勻后于(50±1)℃、200 r/min 的磁力加熱攪拌器中回流反應(yīng)72 h。目標產(chǎn)物合成過程如圖1所示。

圖1 酶催化合成甘露醇酯流程圖

1.3.2 產(chǎn)物HPLC分析

取2 mL反應(yīng)混合液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC檢測，色譜柱為C18柱(5 μm, 3.9 mm×150 mm Agilent, UAS)，流動相條件：A-甲醇，B-0.1%甲酸溶液，梯度洗脫30 min(A：65%～85%，B：35%～15%)，流速為1.0mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，ELSD漂移管溫度40 ℃，載氣流1.5 L/min。按面積歸一法計算產(chǎn)物純度。

1.3.3 產(chǎn)物純化及結(jié)構(gòu)鑒定

將反應(yīng)混合物過濾去除分子篩和固定化酶(回收)，濾液減壓濃縮去除溶劑。向濃縮物中加入10 mL蒸餾水，于分液漏斗中充分振蕩混合，靜置10 min，保留上層油相，用適量正己烷與乙醚混合物(7∶3)多次洗滌油相混合物，5 000 r/min離心10 min，沉淀物真空干燥后即得到產(chǎn)物。稱取10 mg產(chǎn)物，溶于2 mL的甲醇，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進行HPLC-MS、NMR[10-11]檢測，確定其結(jié)構(gòu)。

1.3.4 凝膠油的制備

將得到的產(chǎn)品按一定的比例與液態(tài)植物油混合，以不同的攪拌速率，在不同的溫度下分別加熱攪拌10 min，制得不同樣品，樣品冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置1 d后進行檢測(時間參數(shù)研究除外)。

1.3.5 凝膠油熔點測定

采用GB 24892—2010方法測定所制備凝膠油的滑動熔點(SMP)。

1.3.6 凝膠油流變學(xué)性質(zhì)測定

采用Physical MCR301型流變儀測定振蕩頻率對上述不同條件下制得的凝膠油流變學(xué)性質(zhì)的影響。分別取適量樣品(約2 g)，于25 ℃下測定其流變性，測定條件：2 cm椎板(1°58′47″，截距為54 μm)；屈服應(yīng)變0.1%(在線性黏彈區(qū)間)，掃描頻率0.1～10 Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成產(chǎn)物檢測

試驗分別對反應(yīng)底物和反應(yīng)產(chǎn)物進行了HPLC分析，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，底物甘露醇和辛酸的保留時間分別為(0.45±0.05)、(4.35±0.03) min；反應(yīng)后多出的響應(yīng)峰即為產(chǎn)物峰，產(chǎn)物的保留時間分別(3.30±0.04)、(5.60±0.06)min。由保留時間可以看出，產(chǎn)物2的極性相對較小，由此推測產(chǎn)物1為單酯，產(chǎn)物2為二酯。

圖2 合成反應(yīng)前后HPLC分析圖譜

2.2 產(chǎn)物的分離及鑒定

分離產(chǎn)物HPLC-MS檢測結(jié)果如圖3所示。液相圖上只有1個峰，質(zhì)譜結(jié)果顯示產(chǎn)物離子峰m/z=433[M-H]-，而甘露醇二酯的分子質(zhì)量為434，故判定質(zhì)譜上的離子峰為甘露醇二酯的離子并結(jié)合1個H-。

為了進一步鑒定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，本研究對其進行NMR檢測，1H、13C NMR結(jié)果為：

1H (75 MHz, CD3OD)：σ0.86(t,2×3,J=6.8 Hz), σ1.32(m,2×8H), σ1.62(m,2×2H), σ2.37 (t,2×2H,J=7.3 Hz), σ3.58-4.45(m,8H)；

13C NMR (75 MHz, CD3OD)：σ175.87(C-8, 8’), 70.61(C-10, 10’), 70.41(C-11, 11’), 67.77(C-9, 9’), 35.02(C-7, 7’),32.86(C-6, 6’), 30.21(C-5, 5’), 30.11(C-4, 4’), 26.01(C-3, 3’), 23.67(C-2, 2’), 14.40(1, 1’)。

圖3 甘露醇辛酸二酯的HPLC-MS圖譜

由此確定產(chǎn)物為1,6-二辛酸甘露醇酯。甘露醇的結(jié)構(gòu)為立體結(jié)構(gòu)，由于空間阻力的存在，在參與酯化的過程中，其優(yōu)勢構(gòu)象位置1，6位置參與反應(yīng)的機率更大，這與Jia等[12]研究報道一致。

2.3 凝膠油的性質(zhì)表征

2.3.1 甘露醇辛酸二酯最小添加量

在制備凝膠油時，凝膠劑的最小添加量常作為衡量凝膠效果的指標之一[13]。將本研究合成的甘露醇辛酸二酯添加到下列不同植物油中，最小添加量如表1所示。

表1 甘露醇辛酸二酯最小添加量

從結(jié)果可看出，所制備凝膠劑的最小添加量在不同植物油中差別較小。在橄欖油的最少添加量為0.8%，在葵花籽油的添加量達到1.0%。

2.3.2 不同加工方式對凝膠型油脂黏彈性影響

凝膠的物理強度主要體現(xiàn)在硬度、均勻性以及凝膠油的加工特性等方面。動態(tài)振蕩流變學(xué)在一定程度上可以反映凝膠油的物理屬性，其中儲能模量(G′)是硬度的體現(xiàn)，損耗模量(G″)衡量流動性，屈服應(yīng)變σy表示凝膠的韌性。在屈服應(yīng)變σy處，G′急劇下降，兩模量相交[14]。

2.3.2.1 不同加熱溫度對凝膠油流變特性的影響

本試驗分析了5%凝膠劑添加量時，不同加熱溫度對凝膠油流變特性的影響，頻率掃描結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，在線性黏彈區(qū)間內(nèi)，凝膠型油脂的儲能模量G′以及損耗模量G″隨著制備溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢。這說明溫度的升高有助于凝膠分子的分散，從而形成更好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[15]。此外，不同溫度下，儲能模量G′占據(jù)主導(dǎo)地位，明顯高于損耗模量G″，表明凝膠體系的固體彈性高于其黏性[16]。

圖4 加熱溫度對凝膠油流變特性的影響

2.3.2.2 攪拌速率對凝膠油流變特性的影響

本試驗研究了5%凝膠劑添加量、130 ℃加熱溫度條件下，不同攪拌速率對凝膠油流變特性的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5中可看出，轉(zhuǎn)速在0～500 r/min范圍內(nèi)，隨著攪拌速率的增大，G′、G″逐漸增大；轉(zhuǎn)速在500～600 r/min范圍內(nèi)時，G′、G″的變化不明顯；而當(dāng)轉(zhuǎn)速大于600 r/min時，G′、G″則隨著轉(zhuǎn)速的增大而減小。較高的轉(zhuǎn)速使得凝膠結(jié)構(gòu)的定向排列受到一定限制，體系中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不斷破碎，這阻礙了體系形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。表明在一定范圍內(nèi)，剪切速率增加會促進凝膠的形成，然而較高的剪切作用會限制相鄰結(jié)構(gòu)的交聯(lián)作用[17]。

圖5 攪拌速率對凝膠油流變特性的影響

2.3.2.3 不同凝膠劑添加量對凝膠型油脂流變特性的影響

由圖6可知，隨著凝膠劑的增加，凝膠油的黏彈性逐漸增加，且當(dāng)添加量≥5%時，G′、G″均呈較好的線性增加，說明添加量在5%及以上時，凝膠體系均勻性較好，而低于5%時，體系的凝膠狀態(tài)較弱。

圖6 不同凝膠劑濃度對凝膠油流變特性影響

此外，不同添加量對凝膠的屈服應(yīng)力也有影響，結(jié)果見表2。凝膠劑添加量為3%時，屈服應(yīng)變σy只有2.92，而為5%時，σ增加到4.02，隨著添加量的進一步增加，屈服應(yīng)力也在增加，添加量為10%時，屈服應(yīng)力σy達到7.84。綜合考慮，選擇10%為宜。由此亦可看出，隨著凝膠劑含量的增加，凝膠油的機械強度也在逐漸增加，此研究與Jadhav等[9]較為一致。

表2 不同濃度的凝膠型油脂特性

由表2可知，凝膠型油脂的滑動熔點(SMP)與凝膠劑的添加量亦呈現(xiàn)一定的關(guān)系：當(dāng)添加量達到10%時，其SMP值達到110 ℃；添加量較低時(3%)，其對應(yīng)的SMP值也較低。故可以通過控制凝膠劑添加量來制備不同熔點的凝膠型油脂。Blake等[18]的研究也證實了這一點。

2.3.2.4 儲藏時間對凝膠油流變特性影響

凝膠型油脂廣泛應(yīng)用于即食或者有一定貨架期的產(chǎn)品中，這就要求凝膠型油脂性狀在存儲和運輸過程中應(yīng)保持其應(yīng)有的理化特性。然而，很多凝膠體系，如聚合凝膠，在放置一段時間后很容易發(fā)生形態(tài)變化——老化一段時間的凝膠與新制備的凝膠表現(xiàn)出不同的流變特性。

表3顯示了老化時間對凝膠油制備效果的影響。結(jié)果表明在2周內(nèi)，凝膠油樣品的黏彈性有所增加，老化2周以后的凝膠油的G′、G″基本不再變化，屈服應(yīng)變也有類似的變化趨勢，這表明其硬度和韌性不再發(fā)生改變。此外，2周以后的凝膠油樣品的物理特性趨于平穩(wěn)，這表明其凝膠體系均一、穩(wěn)定性較好。

表3 不同老化時間對凝膠型油脂性狀影響

3 結(jié)論

本研究使用混合溶劑正己烷、乙醚作為萃取介質(zhì)，有效地去除了反應(yīng)副產(chǎn)物及殘留的底物，得到較高純度的甘露醇辛酸酯(>90%)。采用HPLC-MS、NMR確定目標產(chǎn)物為1,6-二辛酸甘露醇酯。將甘露醇辛酸二酯添加到不同植物油中，當(dāng)添加量為0.8%～1.0%時植物即可呈現(xiàn)較好的凝膠狀態(tài)。不同添加量、不同加工條件對凝膠油的機械特性有顯著影響，且在一定的儲藏時間內(nèi)，凝膠油的加工性能趨于穩(wěn)定。

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The Enzymatic Synthesis and Determination of Mannitol Dioctanoate and Its Application

Zhang Xiaohui1Meng Qingran1Zhang Lianfu1,2

(State Key Laboratory of Food Science and Technology;School of Food Sci. & Tech.,Jiangnan University1, Wuxi 214122)(National Engineering Research Center for Functional Food2, Wuxi 214122)

Lipases were catalyzed to synthesize mannitol dioctanoate, HPLC-MS was used to determine products, and mixed medium n-hexane: diethyl ether (7∶3) to extract and purify targeted products to reach the purity of over 90%. The product was identified as 1, 6-di-O-octanomannitol by HPLC-MS, and NMR analysis. Also, we tried to add it into vegetable oil to investigate processing features of gel oil with the minimum addition in different vegetable oil under different processing conditions. In structured vegetable oil preparation, 0.8%～1.8%(m/m) addition of product can form gelation. The prepared gel oil had the stable machining features under the conditions: 10%(m/m)addition of product, the stirring speed of 500 r/min, the heating temperature of 125 ℃.

mannitol dioctanoate, enzymatic synthesis, purification, structured oil, rheological measurements

教育部博士點基金(SRFDP 20130093110008)

2015-11-08

張曉慧，女，1990年出生，碩士，食品科學(xué)與工程

張連富，男，1967年出生，教授，功能性食品研究

TS22

A

1003-0174(2017)05-0057-05