陳雅靜 趙路蘋 華欲飛 陳業(yè)明

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室；江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122)

植物種子油體的提取及其性質(zhì)的初步研究

陳雅靜 趙路蘋 華欲飛 陳業(yè)明

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室；江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122)

植物種子油體是一種天然的微膠囊，含有豐富的不飽和脂肪酸和磷脂、維生素E及植物甾醇等生物活性小分子。因此，在食品、化妝品和制藥等領(lǐng)域有很大的運用潛力。本研究選取8種植物種子(椰子、油菜籽、核桃仁、南瓜籽、花生、油茶籽、杏仁和紅花籽)，在尿素條件下提取不同種子油體，考察并比較不同種子油體的表觀、粒徑大小、pH穩(wěn)定性及蛋白組成，為植物種子油體的利用提供參考。研究表明，利用8 mol/L尿素可獲得高純度的油體，不同植物種子油體的顏色和風(fēng)味各不相同；顯微鏡(400×)下觀察到8種植物種子油體乳液分散較為均勻，其中除油菜油體太小觀察不到外，其他油體均呈球形；不同植物種子油體粒徑大小不同；pH對于8種植物種子油體乳液的分散穩(wěn)定性的影響各不相同；通過電泳表征和質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)8種植物種子油體蛋白分子質(zhì)量分布情況差別很大。

植物種子 油體 分散穩(wěn)定性 粒徑 油體蛋白

植物種子，特別是油料作物種子含有豐富的脂質(zhì)。一般通過壓榨或有機溶劑法得到液態(tài)油來作為食用油[1]。但實際上種子中的油脂主要以油體形式存在——天然的微膠囊，這些油體含有豐富的對人體有益的不飽和脂肪酸、磷脂、維生素E和植物甾醇等[2]。油體表面由一層磷脂-油體蛋白(對于油體的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性非常重要)的復(fù)合膜組成，這層膜是一種親水性帶負電荷的生物膜[3]。因此，可以通過水相提取法提取油體，并且水相提取的油體具有安全、環(huán)保、結(jié)構(gòu)完整和保留小分子功能性成分等優(yōu)點，可以在食品(如色拉醬、蛋黃醬和蛋糕卷的夾心)、藥品(如藥物的載體)和化妝品(如替代礦物油)等領(lǐng)域進行應(yīng)用[4-8]。

目前，關(guān)于植物種子油體的研究主要集中在植物生理方面，研究表明較純的植物種子油體能夠應(yīng)用在食品中[9-10]，因此植物種子油體在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究越來越多。但是現(xiàn)有的研究往往只針對某一種植物種子油體[10-12]，選擇的植物種類范圍較窄，對于油茶籽、南瓜籽等有特殊功效的植物種子油體的研究較少，限制了油體實際運用的選擇性。因此，本試驗選擇了8種不同植物種子(花生、紅花籽、核桃仁、油茶籽、杏仁、椰子、南瓜籽和油菜籽)進行研究，通過顯微鏡觀察、電泳表征和質(zhì)譜鑒定，分別考察油體的色澤、風(fēng)味、粒徑、分散穩(wěn)定性和油體內(nèi)源性蛋白的種類，旨在對比和明確不同植物種子油體的基本性質(zhì)，完善植物種子油體的理論信息，為植物種子油體在食品中的應(yīng)用提供更多的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生、油茶籽、油菜籽、紅花籽、核桃仁、杏仁、椰子、南瓜籽：杭州納趣農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，貯存于4 ℃冰箱中備用；尿素(分析純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍、巰基乙醇、三羧基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍G250：美國Sigma公司；標準蛋白：美國Bio-Rad公司。

Hitachi CR21G高速冷凍離心機：日本日立公司；ChemiDocXRS+凝膠成像儀、Mini-PROTE AN型垂直電泳儀：美國Bio-Rad公司；Zetasizer nano ZS納米粒度儀：英國馬爾文公司；UltraflexTM MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀：美國布魯克·道爾頓有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生漿的制備

分別稱取花生、核桃仁、杏仁、南瓜籽、油菜籽和油茶籽30 g，紅花籽50 g浸泡在去離子水(1∶9，m/m)中，在4 ℃冰箱放置18 h。向吸脹的種子中加入新鮮去離子水至總質(zhì)量分別為300 g(花生、核桃仁、杏仁、南瓜籽和油菜籽)、240 g(油茶籽)和250 g(紅花籽)，用組織搗碎機以18 000 r/min的速度磨漿60 s，用4層紗布過濾，濾液即為生漿。椰子不需去離子水浸泡，直接取50 g椰子肉加入去離子水至總重為250 g打漿，過濾得生漿。

1.2.2 植物種子油體的提取

水相提取的油體表面會吸附大量的油體外源性蛋白。為了減少這些外源性蛋白對于油體性質(zhì)的影響，常用的方法有尿素提取[13]和堿性提取，但堿性提取會在一定程度上改變所提取油體的成分和性質(zhì)[14]，尿素通過與蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基形成氫鍵從而破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，本研究利用尿素提取得到較為純凈的油體作為研究對象。生漿中加入尿素至濃度為8 mol/L，離心(20 ℃，15 000 r/min，15 min)。離心后分為3層，收集上浮物即為油體提取物(此法得到的油體純度較高，以下均簡稱為植物種子油體)，將其以1∶20(m/m)分散到8 mol/L的尿素溶液中，攪拌均勻，離心。重復(fù)上述操作1次，得到8種植物種子油體，分別以1∶5(m/m)分散于去離子水中，得到油體乳液，將油體乳液移入截留分子質(zhì)量為14 000 u的透析袋內(nèi)，置于去離子水的燒杯內(nèi)，在4 ℃層析柜內(nèi)透析。透析后的樣品立即進行后續(xù)試驗。

1.2.3 植物種子油體的顯微鏡觀察

為保證提取的油體能夠保持在種子中最原始的狀態(tài)，避免由于18 000 r/min的速度60 s磨漿造成油體結(jié)構(gòu)破壞，將浸泡過的種子10 g通過手工剁碎，加入15 g去離子水，過濾獲得生漿，離心(5 000r/min，5 min)，取上浮油體0.1 g分散在10 mL 30 mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶液中，稀釋成為1%(m/m)的油體乳液，振蕩均勻。滴1滴乳液在載玻片上，蓋好蓋玻片，在400×顯微鏡(10倍目鏡×40倍物鏡)下觀察植物種子油體。通過測量并計算顯微鏡照片中油體的粒徑范圍和平均粒徑。

1.2.4 油菜油體的粒徑測定

油菜油體以小油體居多，大油體數(shù)目極少，油體平均粒徑約為0.57 μm，在光學(xué)顯微鏡下難以觀察到[15]，因此采用Zetasizer nano ZS納米粒度儀測定油菜油體的粒徑，用30 mmol/L pH 9.0 Tris-HCl溶液稀釋成0.01%(m/m)的乳液，折光系數(shù)1.33，測定溫度25 ℃，平行測定2次。

1.2.5 油體乳液的pH穩(wěn)定性

取1.2.2中透析過的植物種子油體乳液2.0 g，加入98 g去離子水在磁力攪拌下混合均勻，得到2%植物種子油體乳液。用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)乳液pH為3.0、3.4、3.8、4.2、4.6、5.0、5.4、5.8、6.2、6.6和7.0。取不同pH下的乳液5 mL置于具塞試管中，室溫下放置2 h觀察其穩(wěn)定性。其中椰子油體乳液的操作需在30 ℃[16]。

1.2.6 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)

將1.2.2制備的植物種子油體與等體積的樣品溶解液(4% SDS)混合[17]。Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳參考Schagger[18]的方法，電泳前將樣品在沸水浴下煮沸5 min，并在10 000 r /min下離心5 min，取下層液體上樣。樣品在濃縮膠(4%)內(nèi)的設(shè)定電壓為30 mV，當指示劑溴酚藍進入分離膠(16%)后，將電壓調(diào)到100 mV，直到電泳結(jié)束。取出的電泳膠立即進行固定、染色和脫色步驟，用凝膠成像儀拍照并分析。

1.2.7 基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)

切割膠上的目標條帶，用超純水清洗膠粒，加入含30%乙腈(ACN)的100 mmol/L NH4HCO3溶液清洗脫色1 h，去上清，凍干。EP管加10 μL 100 mmol/L DTT和90 μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液，56 ℃下孵化30 min，去上清，凍干。加70 μL 100 mmol/L NH4HCO3和30 μL 200 mmol/L 碘乙酰胺(IAA)溶液，暗處放置20 min。去上清，EP管加100 mmol/L NH4HCO3溶液，室溫放置15 min，去上清，凍干。加5 μL 10 μg/mL胰蛋白酶(Trypsin)溶液，混勻后， 4 ℃放置1 h，使膠塊充分吸脹。再加入25 mmol/L NH4HCO3溶液，37 ℃下反應(yīng)20 h。吸出酶解液，轉(zhuǎn)移到新EP管，凍干，得到凍干干粉。原管加入10 μL含0.1%三氟乙酸(TFA)的60%ACN溶液。超聲15 min，吸出溶液于含凍干干粉的EP管中，在靶上依次點樣。

MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀配備有線性模式25 kVA和激光發(fā)射150(337 nm，50 Hz，N2激光)，利用此設(shè)備獲取肽質(zhì)量指紋譜。在正線性模式下得到每個樣品的光譜圖，并自動選擇和收集200個通過峰值強度接受標準的光譜圖。使用flex analysis數(shù)據(jù)獲取軟件，在自動模式下，使用胰蛋白酶自溶峰(m/z842.509和m/z2 211.104)內(nèi)在校正，并進行光譜加工和數(shù)據(jù)庫搜索。被選取肽的片段在PSD模式下進行MS/MS分析。利用Mascot搜索引擎下的 NCBInr數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種植物種子油體的外觀

觀察提取的8種植物種子油體外觀，發(fā)現(xiàn)不同植物種子油體顏色不同，主要是由于各類植物種子中所含的色素不同，植物種子里含有葉綠素、類胡蘿卜素、黃酮色素及花色苷，少部分則來自于提油體過程中植物種子內(nèi)還原糖類物質(zhì)與氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)合而生成的物質(zhì)。此外，在植物種子細胞內(nèi)，還有一種叫色原體的物質(zhì)，在空氣被氧化，而呈現(xiàn)出顏色[19]。其中椰子和花生油體色澤潔白，核桃、油茶籽和杏仁油體呈白色略帶黃色，紅花籽油體呈白色略帶棕色，油菜籽和南瓜籽油體分別呈黃色、綠色；不同植物種子油體具有其獨特的氣味，很可能是因為油體含有的揮發(fā)性風(fēng)味成分不同，其中椰子油體味道香甜，油菜油體有刺鼻的食用油味道，油茶油體有類似中草藥的苦味，紅花籽油體有稻谷的味道，核桃仁、杏仁、南瓜和花生油體只有淡淡的植物自身的味道。

2.2 8種植物種子油體的形態(tài)觀察及粒徑分析

在400×顯微鏡下觀察8種植物種子油體的形態(tài)，如圖2顯示，8種植物種子油體乳液分散較為均勻，除油菜外，其余7種植物種子油體形狀比較規(guī)則，呈球形；油菜油體很小，在顯微鏡下觀察不到。油體是直徑為0.5～2.5 μm的小球體，其大小因植物種類不同而不同，研究表明油脂蛋白的積累情況直接影響油體的粒徑大小[20]。

圖2 8種植物種子油體的顯微結(jié)構(gòu)(400×)

經(jīng)測量計算發(fā)現(xiàn)7種植物種子油體的粒徑分布情況差距較大，同一種子中既存在極大的油體，也存在極小的油體，油體大小差異很大。其中椰子油體直徑為0.8～5.3 μm，其中在0.8～2.3 μm之間的油體數(shù)量最多；核桃油體直徑為0.6～4.6 μm，其中在1.8～2.2 μm之間的油體數(shù)量最多；南瓜油體直徑為0.6～5.0 μm，其中在0.6～1.0 μm之間的油體數(shù)量最多；花生油體直徑為0.8～9.6 μm，其中在0.8～2.4 μm之間的油體數(shù)量最多；油茶油體直徑為0.6～5.0 μm，其中在1.0～1.4 μm之間的油體數(shù)量最多；杏仁油體的直徑在0.6～7.0 μm，其中在0.6～1.4 μm之間的油體數(shù)量最多；紅花油體直徑為0.7～7.9 μm，其中在0.7～2.5 μm之間的油體數(shù)量最多。通過納米粒度儀測得油菜油體的平均直徑為0.41 μm，與韋存虛等[15]報道的0.57 μm有差異，可能是由于油菜品種不同造成的。因此，可以大概對8種植物種子油體大小由小到大進行排序：油菜、杏仁、南瓜、油茶、椰子、核桃、花生、紅花。由此可看出，植物種類不同，油體大小會有很大差異；同種植物種子油體大小分布在一個范圍內(nèi)。不同植物種子間油體大小的差異很可能是因為植物中含油量和油體蛋白含量的比例不同[21]。

2.3 pH對8種植物種子油體乳液的穩(wěn)定性的影響

不同pH處理后不同植物種子油體乳液分散情況不同。椰子油體乳液在pH 4.6～7.0時比較穩(wěn)定，pH 3.0～4.2時極不穩(wěn)定；核桃油體乳液在pH 5.0～7.0比較穩(wěn)定，pH 3.0～5.0時極不穩(wěn)定；油菜油體乳液在pH 5.0～5.8時極不穩(wěn)定；南瓜油體乳液在pH 4.6～5.4時極不穩(wěn)定；花生油體乳液在pH 4.2～4.6時極不穩(wěn)定；油茶油體乳液在pH 5.0～5.4時極不穩(wěn)定；杏仁油體乳液在pH 3.8～5.4時極不穩(wěn)定；紅花油體乳液在pH 3.8～6.2時極不穩(wěn)定。在這些范圍外，油體乳液隨著pH變酸變堿逐漸變穩(wěn)定。植物種子油體乳液在不同pH作用下的分散情況，可以為油體作為乳化劑在飲料、咖啡伴侶等產(chǎn)品中的應(yīng)用提供參考，對于在實際生產(chǎn)中選擇合適的植物種子油體有重要的作用。如花生油體乳液在pH 4.2～4.6除外的環(huán)境下均呈現(xiàn)良好的分散狀態(tài)，在食品體系中適用范圍更大，而紅花油體只適用于pH>6.6的食品體系。

2.4 8種植物種子油體內(nèi)源性蛋白組成

通過Tricine-SDS-PAGE電泳表征8種植物種子油體內(nèi)源性蛋白組成，由圖3可以看出8種植物種子油體的相關(guān)蛋白組成各不相同。通過MALDI-TOF/TOF-MS對條帶1～57進行了鑒定，結(jié)果如表1所示。其中椰子油體中蛋白分子質(zhì)量為12～55 ku，共有7個條帶，有2條是油體蛋白(條帶2和3)；油菜油體中蛋白分子質(zhì)量為11～65 ku，共有21個條帶，有2條是油體固醇蛋白(條帶6和7)，1條是油體鈣蛋白(條帶10)，5條是油體蛋白(條帶12～16)；核桃油體中蛋白分子質(zhì)量為14～25 ku，共有7個條帶，有2條油體蛋白(條帶23和24)；南瓜油體中蛋白分子質(zhì)量為14～37 ku，共有9個條帶，沒有鑒定得到油體蛋白；花生油體中蛋白分子質(zhì)量為13～26 ku，共有5個條帶，有3條是油體蛋白(條帶33)；油茶油體中蛋白分子質(zhì)量為13～54 ku，共有8個條帶，沒有鑒定得到油體蛋白；杏仁油體中蛋白分子質(zhì)量為13～37 ku，共有16個條帶，沒有鑒定得到油體蛋白；紅花油體中蛋白分子質(zhì)量為13～27 ku，共有7個條帶，沒有鑒定得到油體蛋白。油茶籽、紅花籽、南瓜籽和杏仁均沒有鑒定出油體蛋白，很可能是由于數(shù)據(jù)庫(NCBI和UniProt)里還沒有相關(guān)油體蛋白的信息。但由于植物的油體蛋白的分子質(zhì)量一般在14～26 ku之間[22]，因此可以從圖3中初步得到各種植物種子油體的油體蛋白的種類。

如杏仁油體主要含有1種油體蛋白(條帶50)，紅花油體主要含有3種油體蛋白(條帶54、55和56)，依此類推。

注：M為Marker，1 椰子，2 油菜，3 核桃，4 南瓜，5 花生，6 油茶，7 杏仁，8 紅花。圖3 8種植物種子油體蛋白的Tricine-SDS-PAGE電泳分析

表1 蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究考察了8種植物種子油體的基本性質(zhì)。研究結(jié)果顯示，8種植物種子油體顏色、氣味等表觀特性各不相同，其中椰子和花生顏色潔白、氣味清新。有特殊顏色、氣味的油體在實際應(yīng)用時可以根據(jù)需求選擇。8種植物種子油體乳液分散均較為均勻，油體形狀比較規(guī)則，呈球形；植物種類不同，油體大小會有很大差異；同種植物種子油體大小集中分布在一個范圍內(nèi)。在不同pH下，植物種類不同，油體乳液分散穩(wěn)定性不同，會在不同pH范圍內(nèi)出現(xiàn)乳析現(xiàn)象，本試驗結(jié)果可以為8種植物種子油體在食品中的應(yīng)用提供參考，經(jīng)比較花生油體穩(wěn)定性最好，是食品中作為添加劑的良好選擇，植物種類不同，油體蛋白組成不同。

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Preliminary Study of Extraction and Properties of Plant Seed Oil Bodies

Chen Yajing Zhao Luping Hua Yufei Chen Yeming

(State Key Laboratory of Food Science and Technology; School of Food Science and Technology，Jiangnan University, Wuxi 214122)

Plant seed oil bodies, one kind of natural microcapsules, contain plentiful unsaturated fatty acids and bioactive small molecules, such as phospholipids, tocopherol and phytosterol. They have great potentials to be used in foods, cosmetics, pharmaceutical and other application. In this study, eight varieties of plant seeds (coconut, rapeseed, walnut kernel, pumpkin seed, peanut, camellia seed, almond and safflower seed) were selected to extract various seed oil bodies, investigate and compare appearance, particle size, pH stability and protein composition of these plant seed oil bodies under the urea conditions, which would provide the theoretical basis for the utilization of the plant seed oil bodies. The main results indicated that it could obtain highly purified oil bodies with 8 mol/L urea and each plant seed oil body had its unique characteristics in color and odor; eight plant seed oil bodies emulsions were uniformly dispersed and their shapes were spherical by microscope (400×), whereas rapeseed was excluded as its oil body was too small to observe; eight plant seed oil body had different particle sizes; dispersion stability of eight plant seed oil bodies emulsions showed different trends as a function of pH; distribution condition of protein molecular weights were different in these eight plant see oil bodies by electrophoresis characterization and mass spectrometry.

plant seeds,oil bodies, dispersion stability,particle size, oleosin

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(31301496)

2015-10-19

陳雅靜，女，1992年出生，碩士，植物蛋白

陳業(yè)明，男，1982年出生，副教授，植物蛋白

TS225.1

A

1003-0174(2017)05-0062-06