姬承東，李劍峰

(1.湖南高爾夫旅游職業(yè)學(xué)院，湖南 常德 415900； 2.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018)

高爾夫草坪蘑菇圈真菌拮抗木霉菌株的篩選及其抑菌作用

姬承東1，李劍峰2

(1.湖南高爾夫旅游職業(yè)學(xué)院，湖南 常德 415900； 2.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018)

草坪蘑菇圈是一種在高爾夫草坪上普遍發(fā)生的嚴(yán)重病害，經(jīng)常造成草坪草的嚴(yán)重衰退甚至死亡。木霉 (Trichoderma)菌對蘑菇圈真菌有良好的抑制作用。從貴陽樂灣國際高爾夫球場草坪出現(xiàn)的蘑菇子實(shí)體中分離出當(dāng)?shù)赜写硇缘恼婢?506，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為環(huán)柄菇屬菌株(Lepiotaspp.)。并從曾發(fā)生過蘑菇圈病害，但第2年未發(fā)生蘑菇圈的草坪土壤中分離和篩選出典型拮抗木霉菌8株，其中加納木霉GCPL175(Trichodermaghanense)和木霉菌株GGFL12(Trichoderma.sp.)的抑菌能力最強(qiáng)，其發(fā)酵液的無菌濾液對1506抑菌率分別達(dá)到61.23%，73.13%，顯著高出其他菌株95.75%，1178.50%(P<0.05)，但供試木霉菌株的幾丁質(zhì)酶活性與其對環(huán)柄菇屬菌株1506的抑菌率無明顯相關(guān)。

高爾夫草坪；蘑菇圈病害；拮抗真菌；抑菌能力；木霉

草坪蘑菇圈是一種在高爾夫草坪上普遍發(fā)生的病害，造成草坪草衰退甚至死亡[1]，屬于高爾夫草坪養(yǎng)護(hù)中的難點(diǎn)問題?，F(xiàn)多以化學(xué)藥物熏蒸或噴施來防治[2]，效果顯著但長期大量使用存在一定環(huán)境安全風(fēng)險。目前尚缺乏針對高爾夫球場草坪蘑菇圈的專用生防菌劑。木霉屬(Trichoderma)菌株是目前真菌病害和細(xì)菌病害應(yīng)用較多的生防菌種，郎八一等[3]通過篩選，獲得對小麥全蝕、番茄早疫、稻疫等真菌病原具有拮抗活性的木霉菌株。張海軍等[4]發(fā)現(xiàn)，綠色木霉GY20對棉花枯萎病病原真菌具有良好的抑菌活性。近年來有研究指出，木霉菌能奪取或阻斷平菇菌絲體所需的養(yǎng)分，并釋放專性毒素抑制或破壞病原菌絲及子實(shí)體的形成[5]，而董昌金等[6]也指出，木霉對香菇菌絲體有相似的作用。以上研究預(yù)示著木霉菌株對草坪蘑菇圈可能會產(chǎn)生防效，并產(chǎn)生高活性纖維素酶快速降解表層植物殘?jiān)?，減少草坪病害發(fā)生，提高草坪草抗病性。而利用木霉進(jìn)行草坪蘑菇圈的防治與化學(xué)藥物防治相比，有價格低廉用量少，防效長、無污染、防治兼?zhèn)涞膬?yōu)點(diǎn)，有巨大的應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)效益。以引起草坪蘑菇圈病害的環(huán)柄菇屬菌為防抑對象，對多株木霉菌株進(jìn)行抑菌圈試驗(yàn)和生長對峙試驗(yàn)，為草坪蘑菇圈病害專用生物菌劑的研究提供菌種資源和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離

2014年7～8月，于貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)東南部的樂灣國際高爾夫球場草坪選取5處形態(tài)相似的典型蘑菇圈樣地進(jìn)行標(biāo)記。采樣地位于貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)東南部，地理位置N 25°59′32″，E 109°04′09″，該區(qū)域平均海拔1 242 m，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，并有明顯的高原性氣候的特點(diǎn)。年平均降水量1 180～1 271 mm，年均溫15℃。在所需采樣地上采集蘑菇子實(shí)體，分離出代表性供試蘑菇圈真菌1506，經(jīng)貴州師范學(xué)院食用真菌實(shí)驗(yàn)室鑒定為環(huán)柄菇屬菌Lepiotasp.，菌株在實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)基的配制

孟加拉紅培養(yǎng)基參照劉政等[7]的方法配制，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷素二氫鉀1 g，瓊脂15 g，硫酸錳0.5 g，1/300的孟加拉紅10 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為 7.0。取氯霉素0.1 g，用0.22 μm膜單獨(dú)過濾滅菌后添加。

PDA瓊脂平板培養(yǎng)基參照劉紫英等[8]的方法配制，葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 土壤木霉菌株的分離及拮抗菌株的篩選

于2015年8月，在標(biāo)記原蘑菇圈發(fā)生地選擇未再次發(fā)生蘑菇圈的樣地采集土壤樣品。采集前揭起并移除草皮，去除雜物后挖取0～15 cm的土壤剖面，分別取0～5、5～10、和10～15 cm土層土樣，去除植物殘?bào)w過篩后，將每層土壤充分混合，將土壤裝入無菌鋁盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，于8 h內(nèi)以平板稀釋法分離真菌菌株。

取土壤樣品1 g置入裝有50 mL無菌水的無菌錐形瓶，以漩渦振蕩器混勻3 min，配制10-1～10-5的系列梯度濃度土壤稀釋液。取各稀釋度溶液0.2 mL均勻涂抹到9 cm孟加拉紅培養(yǎng)平板上，25℃恒溫培養(yǎng)48～96 h,期間觀察菌落生長狀況。選取類似木霉菌株的單菌落在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。純化后在100倍顯微鏡下觀察菌絲和產(chǎn)孢形態(tài)并拍照，根據(jù)真菌鑒定手冊[9]并參考《木霉分類與鑒定》[10]進(jìn)行鑒定。

木霉菌株與蘑菇圈真菌1506的平板對峙培養(yǎng)：參照吳曉金等[11]和張海軍等[14]的方法，將初篩木霉菌株接種PDA瓊脂平板28℃活化培養(yǎng)。同時將供試的蘑菇圈真菌1506接入空白 PDA瓊脂平板，28℃培養(yǎng)48 h后，以4 mm直徑的無菌打孔器在長滿木霉的平板上取下5 mm直徑的菌餅，將菌餅放置于培養(yǎng)皿中距菌落5 cm處，28℃培養(yǎng)并持續(xù)觀察菌落及菌絲體生長狀況，每處理3次重復(fù)。以對真菌菌落的生長有明顯抑制能力的菌株為拮抗菌株。

1.4 木霉發(fā)酵液對蘑菇圈真菌1506菌落生長的抑制作用

參照吳曉金等[11]的方法，將木霉菌株接入PDA液體培養(yǎng)基，控溫?fù)u床內(nèi)28℃，120 r/min培養(yǎng)5 d后，在無菌臺先以0.45 μm無菌濾布過濾，再在無菌0.22 μm過濾器過濾。濾液與滅菌后尚未凝固的雙倍濃度PDA固體培養(yǎng)基等體積混合，在9 cm平皿中制成瓊脂平板，對照以無菌水代替濾液。待凝固后立即在平板中心接入5 mm直徑的1506菌餅，每處理3次重復(fù)，生化培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，2 d后測定1506菌株對照組的菌落直徑D和處理組菌落直徑d。

抑菌率=(D-d)/(D-5)×100%

式中：D為對照菌落直徑；d為處理組菌落直徑；5為菌餅直徑。

1.5 木霉菌株揮發(fā)性物質(zhì)對蘑菇圈真菌1506菌落生長的抑制作用

參照吳小平等[11]的方法，將各待測木霉菌株與蘑菇圈真菌1506分別點(diǎn)接在不同9 cm PDA平板上，28℃避光培養(yǎng)6 h。在超凈工作臺內(nèi)取下平皿蓋，將接有木霉菌株和1506菌株的平皿開口對扣，以石蠟封口膜對邊緣進(jìn)行密封，以確保木霉揮發(fā)性物質(zhì)無泄露，以空白PDA代替接有木霉菌株的平皿作為對照，根據(jù)蘑菇圈真菌1506的菌落大小比較木霉菌的抑菌能力，每處理3次重復(fù)。

1.6 木霉幾丁質(zhì)酶活力的測定

幾丁質(zhì)酶測定液體培養(yǎng)基參照關(guān)麗杰等[12]的方法配制：磷酸二氫鉀1 g，氯化鈣0.2 g，2%幾丁質(zhì)膠體100 mL，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為5.6±0.1。

將待測木霉菌株接入培養(yǎng)基，120 r/min，28℃避光培養(yǎng)10 d后參照吳曉金等[11]的方法，以水楊酸分光光度法(DNS法)測定菌株發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶活力。在10 mL離心管中添加木霉發(fā)酵液2 mL，3 000 r/min離心5 min，取上清液0.3 mL與同體積2%的幾丁質(zhì)膠體，40℃恒溫水浴1 h；加入0.3 mL DNS沸水浴10 min，(以預(yù)先沸水浴20 min的木霉發(fā)酵液作為酶失活對照),再加入3 mL 無菌蒸餾水，振蕩后4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL測定D540 nm。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(Duncan法，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高爾夫草坪蘑菇圈發(fā)生地土壤中的拮抗木霉菌株

從曾發(fā)生過蘑菇圈，但次年無蘑菇圈形成的高爾夫草坪土壤中分離出大量真菌，其中木霉屬(Trichodermasp.)菌18株，占總真菌的26.7%。通過生長對峙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中44.4%的木霉菌株，對病原菌Lepiotasp.1506有明顯的侵染能力，木霉菌絲到達(dá)的區(qū)域，病原菌菌絲體不再生長，形成明顯的對峙線。而木霉菌絲與病原菌株相接后，病原菌的菌絲體由灰白色逐漸轉(zhuǎn)為黃褐色，顏色逐步加深，并在3～7 d枯萎死亡。進(jìn)一步通過菌落形態(tài)的顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)對病原菌絲體有纏繞和溶解作用，其中篩選出的代表性菌株為GCPL175(T.atroviride)、GCPL29(T.atroviride)、GCEL122(T.atroviride)、GCPN05(T.piluliferum)和GGFL103(T.polysporumv)、GGFL12(T.polysporum)、GGFL14(T.deliquescens)和GGCL08(T.deliquescens)等，其菌株名稱及形態(tài)特征見表1。研究表明，在發(fā)生過蘑菇圈病害，但次年再未出現(xiàn)的蘑菇圈中存在大量能夠抑制和拮抗病原菌的木霉菌株，這些菌株一方面可能來源于土壤本身，因病原菌的大量繁殖而獲得養(yǎng)分，重寄生于蘑菇圈真菌并大量繁殖，使病原菌處于被壓制和拮抗下，從而使蘑菇圈在次年不能發(fā)生。

表1 蘑菇圈發(fā)生地土壤中的代表性木霉菌株Table 1 Trichoderma strains isolated from soil in fairy ring

2.2 木霉菌代謝物對環(huán)柄菇屬菌株1506的抑制作用

不同木霉菌株的發(fā)酵代謝物對環(huán)柄菇菌1506的菌落生長均有抑制，但菌株間差異較大。其中GCPL175和GGFL12的代謝物對1506的抑菌率高達(dá)61.23%和73.13%(表2)。其中GGFL12對1506的抑菌率分別顯著高出GCEL122和GGCL08菌株1.635和11.78倍，差異顯著(P<0.05)。供試菌株中GGCL08對病原菌的抑制能力最弱，僅為GGFL12的7.82%，差異顯著(P<0.05)。表明即使沒有活體菌絲的存在，經(jīng)過濾滅菌的木霉代謝物對蘑菇圈真菌同樣有良好的抑制效果。

表2 不同木霉菌株發(fā)酵代謝物對蘑菇圈真菌 1506菌落的抑制作用Table 2 Inhibition effect of metabolites from differentTrichoderma strains on mushroom strain 1506

注：所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 不同木霉菌株的揮發(fā)物對蘑菇圈真菌1506菌落生長的影響

木霉菌株GCPL175和GGFL12的揮發(fā)性物質(zhì)對環(huán)柄菇菌1506的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率分別為29.87%，22.51%，差異顯著(P<0.05)。GCEL122和GGCL08菌株的抑菌作用較弱，抑菌率僅為4.76%～2.59%，與對照并無顯著差異(表3)。這一結(jié)果與不同木霉菌發(fā)酵代謝物對病原菌的抑制能力差異相似，表明揮發(fā)物質(zhì)的抑菌能力可作為木霉菌株抑制蘑菇圈真菌效果的速測指標(biāo)之一。但同時也發(fā)現(xiàn)，木霉揮發(fā)物質(zhì)對病原的抑制能力均顯著弱于發(fā)酵代謝物(P<0.05)，這可能與揮發(fā)性物質(zhì)由木霉菌落擴(kuò)散到病原菌菌落過程中的濃度衰減有關(guān)，也可能是由于除揮發(fā)性物質(zhì)外，還有其他產(chǎn)物對蘑菇圈真菌有抑制作用，具體原因有待進(jìn)一步分析。

表3 不同木霉菌株揮發(fā)物質(zhì)對環(huán)柄菇菌 1506的抑菌能力Table 3 Inhibition effect of volatiles from differentTrichoderma strains on mushroom strain 1506

2.4 不同木霉菌株的幾丁質(zhì)酶活性

從發(fā)生過蘑菇圈的草坪土壤中分離出的木霉菌株間幾丁質(zhì)酶活性差異較大，在發(fā)酵10 d時，GCPL175的幾丁質(zhì)酶活性最高，顯著高出其他菌株60.8%～186.9%(P<0.05)?；钚宰畹偷臑镚GCL12，僅為其他菌株的24.1%～69.2%(P<0.05)。而GCEL122和GGCL08的幾丁質(zhì)酶活性均為中等(圖1)。通過對比表2和3可見，木霉菌株10 d時的幾丁質(zhì)酶活性與木霉對1506的抑制能力無明顯相關(guān)。

圖1 不同木霉菌株的幾丁質(zhì)酶活性Fig.1 Chitinase activity of tested Trichoderma strains on 10th day

3 討論與結(jié)論

1)研究發(fā)現(xiàn)，曾發(fā)生過蘑菇圈，但次年無蘑菇圈形成的高爾夫草坪樣地的土壤中存在大量能夠抑制和拮抗病原菌的木霉屬菌株。這類菌株包括深綠木霉(Trichodermaatroviride)，洋大戟木霉(Trichodermapiluliferum)，多胞木霉(Trichodermapolysporum)和綠木霉(Trichodermadeliquescens)共8株代表性菌株，其中GCPL175(Trichoderma.atroviride)和GGFL12(Trichodermapolysporum)對病原菌的拮抗能力最強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用價值。吳曉金等[11]和陳凱[13]等指出，從食用菌病害中分離出的木霉菌可用于代替農(nóng)藥防治植物病原真菌。而此次研究中分離出的木霉菌株則意味著可用于防治草坪蘑菇圈病害。這些木霉菌株一方面可能來源于土壤本身，因病原菌的大量繁殖而獲得養(yǎng)分，重寄生于病原菌并大量繁殖形成優(yōu)勢群落，使病原菌處于被壓制和拮抗下，從而使蘑菇圈在次年不能發(fā)生，其中的生物學(xué)原理和發(fā)生過程可作為草坪蘑菇圈病害研究的方向，值得深入探討。而從曾發(fā)生過蘑菇圈，但次年無蘑菇圈重復(fù)發(fā)作的草坪樣地土壤中獲取蘑菇圈病害拮抗菌株也將是一個成功率較高的拮抗菌獲得途徑。

2)研究也發(fā)現(xiàn)，木霉菌株對蘑菇圈真菌1506的抑制作用首先表現(xiàn)為木霉菌絲體對菌絲體的纏繞、溶解，這與吳小平[14]等的研究結(jié)果一致。其次是其發(fā)酵代謝物和揮發(fā)性物質(zhì)對病原菌的抑制，其中幾丁質(zhì)酶是木霉分泌的用于降解病原菌細(xì)胞壁的胞外水解酶，通常被認(rèn)為能拮抗或抑制其他真菌[13]。研究中菌株的幾丁質(zhì)酶活性與其抑菌能力間并未發(fā)現(xiàn)有明顯的對應(yīng)關(guān)系，這與楊合同等[15]和吳曉金等[11]的結(jié)果一致，即木霉對食用菌或其他真菌的侵染能力與木霉幾丁質(zhì)酶活性間沒有數(shù)量上的相關(guān)性。吳小平等[11]的研究結(jié)果也指出，幾丁質(zhì)酶活性與木霉對食用菌的抑制作用并無必然聯(lián)系。這一方面說明幾丁質(zhì)酶的活性測定在篩選抑制蘑菇圈真菌木霉菌株的過程中可能不具有代表性，另一方面也表明木霉對蘑菇圈病害的抑制可能是一個多機(jī)制共同作用的結(jié)果，其具體機(jī)制還有待深入研究探討。

3)除發(fā)現(xiàn)木霉菌活體對蘑菇圈真菌的直接抑制外，研究也證實(shí)即使沒有活體菌絲的存在，木霉代謝物同樣對蘑菇圈真菌有良好的抑制作用，這預(yù)示木霉發(fā)酵也具有較高的抑菌活性，而經(jīng)過濾的木霉活體的濾液對環(huán)境和土壤更加安全，具有良好的開發(fā)前景，但如何長期保持其抑菌活性將作為重要的環(huán)節(jié)進(jìn)行考慮。

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Isolation and screening of antagonisticTrichodermastrains against fairy ring on golf turf

JI Cheng-dong1,LI Jian-feng2

(1.HunanGolfandTourismCollege，Changde415900,China； 2.GuizhouNormalCollege,Guiyang550018,China)

The fairy ring widely occurs in golf turf and causes turfgrass degradation or even death.Fungi fromTrichodermaperform the promising effect on the control of fairy ring.In this study,8 typicalTrichodermastrains were isolated from the fairy ring occurred turf soil to control the pathogenic bacteriaLepiotaspp.1506 from sporophore of mushroom in Happy Valley International Golf Club (Guiyang).The result indicated that 2 strains (Trichodermaghanense,GCP L175 andTrichodermasp.,GGFL 12) performed the best and the inhibition rate reached 61.23% and 73.49% respectively,which were significantly higher than the other strains(P<0.05).The activity of chitinase inTrichodermastrains did not show relationship with inhibition rate toLepiotaspp.1506.

golf turf；fairy ring；antagonistic fungi；mycostatic activity；Trichoderma

2017-04-07；

2017-05-03

奧林高爾夫教育與研究基金(AL2015001)資助

姬承東(1979-)，男，甘肅金昌人，講師，碩士，研究方向?yàn)楦郀柗蚯驁霾萜吼B(yǎng)護(hù)管理。 E-mail：jichengdong@126.com 李劍峰為通訊作者。

S 688.4

A

1009-5500(2017)03-0081-05