李嬋君，李柱梅，秦喜玲，董素靜，王彥超

(鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，鄭州450006)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中磺胺類及喹諾酮類藥物殘留量

李嬋君，李柱梅，秦喜玲，董素靜，王彥超

(鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，鄭州450006)

水產(chǎn)品樣品(5.00 g)經(jīng)乙腈-甲酸(99+1)混合液20 mL提取，無水乙醇除水，濃縮并加正己烷2 mL脫脂。所得溶液進行液相色譜分離。以ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱為分離柱，以不同體積比的甲醇和0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液的混合液為流動相進行梯度洗脫。質(zhì)譜分析中，采用電噴霧正離子源多反應監(jiān)測模式檢測。采用內(nèi)標法定量。所涉11種藥物的線性范圍均為5～200μg·L－1，方法的測定下限(10S/N)在0.07～0.20μg·kg－1之間。在1.0，4.0，20.0μg·kg－1等3個濃度水平進行加標回收試驗，回收率在80.3%～119%之間，測定值的相對標準偏差(n=6)在1.3%～12%之間。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;磺胺類;喹諾酮類;水產(chǎn)品

喹諾酮類和磺胺類藥物為常見合成抗菌劑，在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用十分普遍，但是由于存在著藥物濫用、誤用及不遵守休藥期規(guī)定等現(xiàn)象，造成很多動物源性食品中殘存各種藥物及藥物的代謝物，從而對人的身體健康構(gòu)成威脅或直接造成損害。測定此類藥物的方法目前有酶聯(lián)免疫法［1］、薄層色譜法［2］、液相色譜法［3-8］和液相色譜-質(zhì)譜法［9-12］等。

本工作在農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了試驗條件，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中磺胺類和喹諾酮類11種抗生素含量的方法。以2種氘代磺胺試劑(氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶、氘代磺胺間二甲氧嘧啶)和3種氘代喹諾酮試劑(氘代諾氟沙星、氘代恩諾沙星、氘代環(huán)丙沙星)作內(nèi)標，采用標準加入法進行定量分析，為水產(chǎn)品中藥物殘留檢測提供了新思路。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S型超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;SIGMA 3K15型高速冷凍離心機;BUCHI R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;Milli-Q Advantage A10型純水機。

諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星標準儲備溶液: 1.000 g·L－1，分別稱取諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星(純度不小于98%)10 mg于不同的10 mL容量瓶中，加甲酸0.2 mL，用甲醇溶解并稀釋至刻度。避光－18℃下保存，逐級稀釋備用。

磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶標準儲備溶液:1.000 g·L－1，分別稱取磺胺二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲異噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶(純度不小于98%)10 mg于不同的10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。避光－18℃下保存，逐級稀釋備用。

磺胺喹噁啉標準儲備溶液:1.000 g·L－1，稱取磺胺喹噁啉(純度不小于98%)10 mg于10 mL容量瓶中，加入氨水20μL，用甲醇溶解并稀釋至刻度。避光－18℃下保存，逐級稀釋備用。

氘代諾氟沙星、氘代恩諾沙星、氘代環(huán)丙沙星內(nèi)標儲備溶液:0.500 g·L－1，分別稱取氘代諾氟沙星、氘代恩諾沙星、氘代環(huán)丙沙星(純度不小于98%)5 mg于不同的10 mL容量瓶中，加甲酸0.2 mL，用甲醇溶解并稀釋至刻度。避光－18℃下保存，逐級稀釋備用。

氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶、氘代磺胺間二甲氧嘧啶內(nèi)標儲備溶液:0.500 g·L－1，分別稱取氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶、氘代磺胺間二甲氧嘧啶(純度不小于98%)5 mg于不同的10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。避光－18℃下保存，逐級稀釋備用。

混合內(nèi)標溶液:1 mg·L－1，將0.5 g·L－1各內(nèi)標儲備溶液混合稀釋配制而成。

乙腈、正己烷、甲酸為色譜純;試驗用水為一級純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7μm);柱溫40℃;流量0.3 mL·min－1;進樣量5μL。流動相:A為甲醇，B為0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸溶液。梯度洗脫程序:0～0.5 min時，A為5%;0.5～5 min時，A由5%升至95%;5.01 min時，A由95%跳轉(zhuǎn)至5%，保持2 min。

2)質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子掃描，離子源溫度150℃;多反應監(jiān)測(MRM)模式;毛細管電壓1.0 kV;脫溶劑溫度500℃，脫溶劑氣流量1 000 L·h－1。其余質(zhì)譜參數(shù)見表1，其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1 (續(xù))

1.3 試驗方法

稱取試樣5.00 g于50 mL離心管中，加入1 mg·L－1混合內(nèi)標溶液50μL，漩渦混合30 s，避光放置10 min。再加入乙腈-甲酸(99+1)混合液20 mL，渦流混合1 min后再超聲波提取10 min。以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液于50 mL梨形瓶中，殘渣中加入乙腈-甲酸(99+1)混合液20 mL，重復提取一次，合并兩次提取液，于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2～3 mL，加入無水乙醇10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。加20%(體積分數(shù))甲醇溶液1.0 mL漩渦超聲溶解殘留物，再加入正己烷2.0 mL漩渦混合30 s，轉(zhuǎn)入5 mL具塞離心管中，然后以4 000 r· min－1轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上層液，取下清液，過0.2 μm濾膜，按儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇

磺胺類化合物在酸性條件下溶解度較大，使用酸化乙腈提取，可提高提取效率。

樣品中含有水分，在樣品提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時，會出現(xiàn)很難蒸干的情況，加入無水硫酸鈉可除去樣品中水分，但影響喹諾酮類藥物提取率;可在旋蒸至2～3 mL時，加入無水乙醇10 mL，使樣品提取液蒸至近干，且喹諾酮類提取效率穩(wěn)定，多次試驗重復性較好。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

在正離子模式下，11種化合物及5種內(nèi)標均可獲得較高的［M+H］+母離子，通過調(diào)節(jié)儀器的毛管電壓、錐孔電壓等參數(shù)，使目標物質(zhì)的響應信號最高。流動相中A分別為乙腈、甲醇，B分別為含0.1%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨溶液、含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、0.1%甲酸溶液，以不同比例的A、B作為流動相。結(jié)果發(fā)現(xiàn):A為甲醇時，可提高目標物靈敏度，且峰形更好;B為0.1%甲酸溶液時，得到同樣離子化效果。試驗選用甲醇和0.1%甲酸溶液作為流動相。各化合物離子流圖見圖1。

圖1 選擇離子流色譜圖Fig.1 SIC chromatograms

2.3 基質(zhì)效應

水產(chǎn)品基質(zhì)復雜，用液相色譜-質(zhì)譜法測定基質(zhì)效應顯著，特別是磺胺類藥物基質(zhì)抑制效應較強，減少基質(zhì)效應影響的方法一般有加入同位素標記的目標物、基質(zhì)配制標準溶液、更多的凈化步驟或進樣前稀釋等［8］。

試驗采用內(nèi)標法，在此基礎(chǔ)上用試劑配制標準溶液(方法1)和基質(zhì)配制標準溶液(方法2)，向空白樣品加入標準品后按試驗方法進行測定(方法3，簡稱標準加入法);進行加標試驗，低添加，采用3種方法繪制標準曲線，所添加量在線性范圍內(nèi)，每個添加進行3次平行試驗，6批次重復性試驗。用方法1定量:添加質(zhì)量分數(shù)為4.0μg·kg－1時，無法定量;質(zhì)量分數(shù)為10.0μg·kg－1時，沙星類均可定量且回收率為91.0%～115%，磺胺類回收率為20%～55%，且重復性不好。采用方法2定量:添加質(zhì)量分數(shù)為1.0μg·kg－1時，回收率在44%～62%之間，且重復性不好;采用加入內(nèi)標物，標準加入法定量時，可以準確定量微量添加，添加質(zhì)量分數(shù)為0.20μg·kg－1，最終計算實際添加質(zhì)量分數(shù)在0.162～0.234μg·kg－1內(nèi)，回收率在81.5%～118%之間，相對標準偏差(RSD)為3.4%～12%。試驗選用標準加入法。

采用標準加入法內(nèi)標法定量能在線性范圍內(nèi)準確定量，適合微量添加，測定結(jié)果穩(wěn)定。在樣品前處理過程中，待測物會有不同程度的損失，特別是對于含量較低的樣品，這種損失特別明顯，因此采用前兩種方法定量時，含量較低的樣品，不能定量或定量不準確;采用標準加入法加入內(nèi)標物，和待測樣品經(jīng)過同樣的前處理過程，可進行樣品微量分析且定量更準確，標準曲線的線性范圍更具有實用性。

2.4 標準曲線與測定下限

稱取空白樣品6份各5.00 g，分別加入不同體積的1 mg·L－111種化合物的標準溶液及1 mg· L－15種內(nèi)標溶液50μL，配制成質(zhì)量濃度分別為5，10，20，50，100，200μg·L－1的混合標準溶液。

磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲異噁唑以氘代磺胺間二甲氧嘧啶為內(nèi)標;磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺嘧啶以氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標;諾氟沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標;恩諾沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標;環(huán)丙沙星以氘代環(huán)丙沙星內(nèi)標;用內(nèi)標法繪制標準曲線，結(jié)果表明:11種化合物的線性范圍為5～200μg·L－1，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。

按10倍信噪比計算各化合物的測定下限(10S/N)，其結(jié)果見表2。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和測定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and lower limits of determination

2.5 樣品分析

抽取市售鯉魚、草魚、鯽魚、黃魚、鱖魚各4條，共20個樣品，按試驗方法進行測定，未檢出目標物。在樣品中加入11種化合物的混合標準溶液，添加水平為1.0，4.0，20.0μg·kg－1，每個加標樣品平行測定6次，精密度和回收試驗結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表3 (續(xù))

本工作采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定磺胺類和喹諾酮類共11種抗生素的含量，以標準加入法進行定量分析，減小基質(zhì)干擾，提高了檢測準確度，方法具有較高的靈敏度、精密度和較低的定量限，線性范圍寬，在實際樣品檢測中分析速率快，穩(wěn)定性好，結(jié)果準確可靠。

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LC-MS/MS Determination of Residual Amounts of Sulfonamides and Quinolones in Aquatic Products

LI Chanjun，LI Zhumei，QIN Xiling，DONG Sujing，WANG Yanchao
(Testing Center for Quality of Agricultural Produsts of Zhengzhou，Zhengzhou 450006，China)

The sample of aquatic products(5.00 g)was extracted with 20 mL of a mixture of acetonitrile and formic acid(99+1).The extract was dehydrated with absolute ethanol.The extract was then concentrated and 2 mL of nhexane was added to remove fat.LC separation was performed by using ACQUITY UPLC BEH HILIC chromatographic column as stationary phase，and mixtures of methanol and 0.1%(φ)formic acid solution with various ratios as mobile phase in gradient elution.ESI+and multi-reaction-monitoring were adopted in MS/MS.Internal standard method was used for quantification.Linearity ranges of the 11 drugs were found in the same range of5－200μg·L－1，with lower limits of determination(10S/N)in the range of0.07－0.20μg·kg－1.Tests for recovery were made by standard addition method at3 concentration levels of1.0，4.0，20.0μg·kg－1，giving values of recovery and RSD's(n=6)in the ranges of80.3%－119%and 1.3%－12%respectively.

LC-MS/MS;sulfonamides;quinolones;aquatic products

O657.63

A

1001-4020(2017)05-0527-05

10.11973/lhjy-hx201705007

2016-05-11

李嬋君(1978－)，女，河南新密人，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測工作，chanjunli@163.com