王睿,余陳歡,方杰,曹暢

(1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007;2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,杭州 310007)

電針延緩HepG2裸鼠荷瘤生長趨勢及對PCNA表達(dá)影響

王睿1,余陳歡2,方杰2,曹暢1

(1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007;2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,杭州 310007)

目的觀察電針干預(yù)對HepG2裸鼠荷瘤生長趨勢及PCNA表達(dá)的影響。方法將32只裸鼠隨機(jī)分為電針組、電刺激組、模型組與空白組,每組8只。采用HepG2建立皮下荷瘤裸鼠模型。電針組采用雙下肢足三里十三陰交穴進(jìn)行電針干預(yù),電刺激組取相同穴位進(jìn)行直接電流刺激。觀測荷瘤體積變化、瘤重比和腫瘤生長抑制率,并檢測荷瘤組織PCNA的表達(dá)水平。結(jié)果電針組、電刺激組和模型組干預(yù)前后荷瘤體積比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);電針組、電刺激組干預(yù)后荷瘤體積與模型組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但電針組荷瘤體積生長趨勢較緩。各組干預(yù)前后裸鼠體重比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。電針組干預(yù)后瘤重比與電刺激組和模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但電刺激組干預(yù)后瘤重比與模型組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。電針組干預(yù)后腫瘤生長抑制率與電刺激組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。電針組和電刺激組干預(yù)后PCNA表達(dá)水平與模型組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但電針組干預(yù)后PCNA表達(dá)水平與電刺激組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論電針干預(yù)在一定程度上可延緩HepG2荷瘤生長趨勢。

電針;電刺激;HepG2荷瘤;PCNA;裸鼠

目前我國惡性腫瘤的疾病負(fù)擔(dān)日益嚴(yán)重,發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢[1-2],并給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)壓力[3]。隨著2006年世界衛(wèi)生組織提出腫瘤是一種慢性的可控性疾病[4],“帶瘤生存”的理念逐漸被廣泛接受[5-6]。經(jīng)過有效的抗腫瘤治療后,病情相對穩(wěn)定,但不再接受或耐受放化療和手術(shù)的癌癥患者和老年患者,都是針灸發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)的切入點(diǎn)和優(yōu)勢所在[7-8]。本研究運(yùn)用 PCNA作為可觀評價指標(biāo),探討電針對HepG2裸鼠荷瘤的生長是否有正向調(diào)控作用,為將針灸運(yùn)用到臨床“帶瘤生存”提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級BALB/C(nu/nu)裸鼠32只,雌雄各半,體重16～20g,4～5周齡。由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心負(fù)責(zé)調(diào)劑[動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016],常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將裸鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期,對所有裸鼠稱重,使用剪趾方法編號。按體重的順序排列,采用隨機(jī)數(shù)字法分為電針組、電刺激組、模型組和空白組4組,每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

DMEM粉、RPMI1640培養(yǎng)液(Sigma中國),蘇木素染液、伊紅染液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),PCNA組化試劑盒(谷歌生物),組化試劑盒 DAB顯色劑(DAKO)。

1.2.2 主要儀器

RM2016病理切片機(jī)、KD-P組織攤片機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備),Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康),DL-5M高速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司),GT1001組化筆(Gene tech)。

1.3 動物模型制備

首先將HepG2細(xì)胞置于含10%PBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)和傳代,選擇對數(shù)生長期細(xì)胞,使用RPMI1640培養(yǎng)液配制為2×107/mL細(xì)胞。分別在電針組、電刺激組和模型組裸鼠右前肢腋窩下,接種濃度為2×107/mL的 HepG2細(xì)胞懸液0.2mL(含活細(xì)胞5×106/0.2mL)。接種細(xì)胞后每日定時觀察裸鼠細(xì)胞接種部位的成瘤情況[9]。所有裸鼠均在皮下種植腫瘤細(xì)胞后1星期即可觸及瘤塊生長。

1.4 干預(yù)方法

電針組取雙側(cè)下肢足三里十三陰交,穴位定位及操作依據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]。采用小鼠固定器十雙腿膠布固定的方法進(jìn)行捆綁,電針操作選用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.18mm×10mm美容用毫針進(jìn)行針刺,然后接華佗牌電針儀(型號 SDZ-Ⅱ),電針儀頻率選擇2/100 Hz疏密波,電流強(qiáng)度從0.1 mA開始逐漸加強(qiáng),根據(jù)裸鼠耐受情況,以身體開始扭動和嘶叫為度。

電刺激組使用相同方式的固定,采用電極直接刺激雙側(cè)足三里和三陰交位,電流強(qiáng)度、頻率等同電針組。

模型組和空白組均使用相同方式的固定,不予其他特殊處理。

各組均每日干預(yù)1次,每次干預(yù)30min,連續(xù)治療10次。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 荷瘤體積變化

裸鼠接種腫瘤細(xì)胞后密切觀察荷瘤生長情況。等裸鼠荷瘤肉眼可見后,于干預(yù)開始第2、5、8天與實(shí)驗(yàn)結(jié)束第2天使用電子游標(biāo)卡尺測量荷瘤的長徑(a)、短徑(b),分別計(jì)算腫瘤體積(V)、相對腫瘤體積(RTV)和相對腫瘤增殖率(T/C)[11]。

1.5.2 瘤重比和腫瘤生長抑制率

實(shí)驗(yàn)結(jié)束第2天將裸鼠稱重后,頸椎脫臼處死各組裸鼠,完整剝離腫瘤,去除血污、脂肪等非腫瘤組織,稱取瘤體重量,計(jì)算瘤重比和腫瘤生長抑制率[12]。

1.5.3 荷瘤組織的PNCA免疫組化

細(xì)胞增殖能力的評價采用荷瘤組織的 PNCA免疫組化檢測。在每組內(nèi)隨機(jī)挑選3個切片,每張切片隨機(jī)挑選3個200倍視野進(jìn)行拍照,合計(jì)9個視野。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD值)[13]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,如符合正態(tài)分布,采用方差分析(one-way ANOVA);如不符合正態(tài)分布,采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對裸鼠荷瘤體積變化的影響

由表1可見,干預(yù)前后各組荷瘤體積比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后計(jì)算RTV值,模型組為(2.61±0.61),電針組為(2.28±1.11),電刺激組為(3.42±1.63);計(jì)算T/C(%)值,以模型組為100%,電針組為(146±93)%,電刺激組為(89±42)%,各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。從干預(yù)前到干預(yù)后,各時間點(diǎn)荷瘤體積繪制成的折線趨勢圖(見圖2)可大致看出電針組裸鼠荷瘤生長速度較其余兩組相對緩慢。

表1 各組各時間段裸鼠瘤體積比較 (±s,mm3)

表1 各組各時間段裸鼠瘤體積比較 (±s,mm3)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

?

圖1 各組各時間點(diǎn)荷瘤體積折線趨勢圖

2.2 電針對荷瘤裸鼠瘤重比和腫瘤生長抑制率的影響

表2 各組平均瘤重、瘤重比和腫瘤生長抑制率比較(n=8)(±s)

表2 各組平均瘤重、瘤重比和腫瘤生長抑制率比較(n=8)(±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05;與電刺激組比較2)P＜0.05

?

由表2及圖2可見,各組干預(yù)前后裸鼠體重比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)后計(jì)算瘤重比,電針組優(yōu)于電刺激組和模型組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但電刺激組和模型組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);計(jì)算腫瘤生長抑制率后顯示,電針組腫瘤生長抑制率與電刺激組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 各組干預(yù)前后裸鼠體重比較

2.3 荷瘤組織PCNA表達(dá)比較

由圖3可見,紅圈所示棕黃色為PCNA陽性表達(dá)的細(xì)胞,與模型組比較,電針組與電刺激組均對裸鼠腫瘤組織PCNA表達(dá)有一定的下調(diào)作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但電針組與電刺激組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組荷瘤PCNA免疫組化IOD值比較 (±s)

表3 各組荷瘤PCNA免疫組化IOD值比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05

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圖3 荷瘤組織PCNA表達(dá)(×200)

3 討論

帶瘤生存的目的是經(jīng)有效治療后,腫瘤病灶可處于相對靜止?fàn)顟B(tài),人體與腫瘤“長期共存”。運(yùn)用針灸的優(yōu)勢不在于直接殺傷腫瘤細(xì)胞,而是通過作用于腫瘤生長的內(nèi)在環(huán)境,糾正機(jī)體失衡狀態(tài),提高整體免疫功能,達(dá)到控瘤生存目的[14-16]。補(bǔ)其不足,瀉其有余,恢復(fù)陰平陽秘的狀態(tài),是中醫(yī)學(xué)控瘤的基本原則。尤其中晚期和老年惡性腫瘤患者正處于正邪俱傷或正氣已虛、不耐攻伐的階段,為實(shí)現(xiàn)帶瘤生存,更需重視脾胃正氣的培補(bǔ)[17-18]?！肚Ы鹨矸健?“腹中積聚,皆針胞門?！薄夺樉募滓医?jīng)》:“胞中有大疝瘕積聚……補(bǔ)尺澤、太溪、手陽明寸口?！鄙衔木枋隽酸樉耐ㄟ^扶正驅(qū)邪和疏通經(jīng)絡(luò)的作用達(dá)到治瘤目的。針灸立足于對整體功能的調(diào)節(jié),不產(chǎn)生毒副反應(yīng),搭配其他治療方法,能起到減毒增效的作用,使其在古往今來腫瘤攻克中占有一席之地[19-20]。

針灸作為“中醫(yī)基礎(chǔ)理論”指導(dǎo)下開展應(yīng)用的學(xué)科,使用足三里十三陰交表里經(jīng)配穴法,以扶正固本、培補(bǔ)脾胃和調(diào)和陰陽為治療原則。足三里是足陽明胃經(jīng)的下合穴,是健脾和胃、補(bǔ)益后天之要穴,可調(diào)節(jié)脾胃的運(yùn)化功能。三陰交是足太陰脾經(jīng)的腧穴,主治脾胃虛弱,有健脾益氣、溫中補(bǔ)虛之功效?！鹅`樞·根結(jié)》:“用針之要,在于知調(diào)陰和陽?！标U明了針灸治療疾病具有調(diào)和陰陽的作用。足陽明胃經(jīng)的足三里和足太陰脾經(jīng)的三陰交穴配伍,能發(fā)揮陰陽經(jīng)腧穴間的協(xié)同作用,調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡。既往研究證實(shí),針灸可通過改善腫瘤免疫功能[21-22]或者調(diào)整生物節(jié)律[23],發(fā)揮抗腫瘤和改善患者生存質(zhì)量的作用,還具有經(jīng)濟(jì)、安全和操作簡便等優(yōu)勢。因此,針灸對腫瘤調(diào)控的臨床價值是可以作為帶瘤生存期的維持手段,長期運(yùn)用于臨床,不會給患者家庭帶來過重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[24-27]。

本研究設(shè)置電刺激組作為對照,運(yùn)用同樣的電針儀和刺激強(qiáng)度,把電極直接貼敷在相同穴位的皮膚上進(jìn)行干預(yù),目的是盡可能排除電流刺激本身對荷瘤裸鼠作用的影響,可更精確地觀測腧穴針刺效應(yīng)[28-29]。并運(yùn)用增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)評價腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài),其是在細(xì)胞周期 S期廣泛表達(dá)的一種核蛋白,陽性表達(dá)說明細(xì)胞正處于增殖期[30-33]。綜合分析瘤重比和干預(yù)前到干預(yù)后荷瘤體積增長趨勢等結(jié)果,并考慮到電針組PCNA呈下調(diào)表達(dá),說明電針可以通過相關(guān)通路影響到腫瘤細(xì)胞的增殖,初步認(rèn)為電針具有一定的延緩荷瘤生長趨勢作用。但目前僅能證明在HegG2癌細(xì)胞株上,還需要選擇不同的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行研究。并且本研究觀測得到的生長趨勢有延緩變化的結(jié)果,僅體現(xiàn)在實(shí)施干預(yù)的這一段時間里,在將來的研究中,需對針灸后效應(yīng)和電針對荷瘤裸鼠生存時間的影響進(jìn)行深入探討。本研究后續(xù)還將對電針組與模型組間差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行篩選工作,運(yùn)用基因芯片技術(shù)更好地探索電針控瘤機(jī)制。

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Electroacupuncture Delaying Tumor Growth and its Effect on PCNA Expression in HepG2 Nude Mice

WANG Rui1, YU Chen-huan2, FANG J ie2, CAO Chang1. 1.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China;2.Zhejiang Academy of Medical Science,Hangzhou 310007,China

ObjectiveTo explore the effect of electroacupuncture intervention on tumor growth and PCNA expression in HepG2 nude mice.MethodsThirty-two nude mice were randomized to electroacupuncture,electrostimulation, model and blank control groups,8 mice each. A nude mouse model of subcutaneous tumor was made with HepG2. The electroacupuncture group

electroacupuncture at points Zusanli and Sanyinjiao on bilateral lower limbs and the electrostimulation group, direct electrical stimulation of the same points. The tumor volume, the tumor/weight ratio and the tumor growth inhibition rate were observed. PCNA expression in the tumor tissue was determined.ResultsThere was no statistically significant pre-/post-intervention difference in the tumor volume in the electroacupuncture, electrostimulation and model groups (P＞0.05). There was no statistically significant post-intervention difference in the tumor volume between the electroacupuncture or electrostimulation group and the model group (P＞0.05), but tumor growth tended to slow in the electroacupuncture group. There was no statistically significant pre-/post-intervention difference in the nude mouse weight in every group (P＞0.05). There was a statistically significant post-intervention difference in the tumor/weight ratio between the electroacupuncture group and the electrostimulation or model group (P＜0.05), but no statistically significant post-intervention difference in the tumor/weight ratio between the electrostimulation and model groups (P＞0.05). There was a statistically significantpost-intervention difference in the tumor growth inhibition rate between the electroacupuncture and electrostimulation groups (P＜0.05). There was a statistically significant post-intervention difference in the PCNA expression level between the electroacupuncture or electrostimulation group and the model group (P＜0.05), no statistically significant post-intervention difference in the PCNA expression level between the electroacupuncture and electrostimulation groups (P＞0.05).ConclusionElectroacupuncture can delay HepG2 tumor growth to a certain extent.

Electroacupuncture; Electrostimulation; HepG2 tumor; PCNA; Nude mice

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.07.0852

1005-0957(2017)07-0852-05

2017-03-12

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015ZA161);浙江省院所專項(xiàng)(2015D3006)

王睿(1987—),男,主治醫(yī)師,博士,Email:k444www@163.com

余陳歡(1982—),男,副研究員,博士,Email:yuchenhuan2002@163.com