劉 佳， 汪 洋， 呂 爽， 全雪麗， 李翔國， 吳松權(quán)*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué) 長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室:吉林 延吉 133002)

不同蒸制方法對人參愈傷組織中皂苷含量的影響

劉 佳1,2， 汪 洋1， 呂 爽1， 全雪麗1， 李翔國1， 吳松權(quán)1,2*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué) 長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室:吉林 延吉 133002)

以人參愈傷組織為試材，采用高效液相色譜法，研究不同蒸制溫度與時間對9種人參皂苷Rg1,Re,Rf，Rb1,Rc,Rb2,Rd,Rg3,Rh1含量的影響。結(jié)果表明：與對照組相比，人參皂苷Rg1,Re,Rf,Rb1,Rc,Rb2,Rd的含量在不同蒸制處理中均顯著降低，但檢測到對照組中幾乎不存在的Rg3和Rh1，并在隨后處理中呈現(xiàn)不同程度的增加，且均于115 ℃、2.0 h時出現(xiàn)峰值。表明可以通過適當(dāng)?shù)恼糁茥l件控制獲取人參皂苷Rg3和Rh1。

人參；愈傷組織；人參皂苷；蒸制方法；高效液相色譜

人參(PanaxginsengC.A.Meyer),五加科人參屬多年生藥用草本植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，素有“百草之王”之美譽。人參在歷代本草中均有記載，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，其味甘且微苦、性溫，具有大補元氣、安神、生津止渴等功效[1-3]。人參的大多數(shù)藥理作用歸功于其次生代謝產(chǎn)物，人參皂苷是其中重要的生物活性物質(zhì)之一[4]。人參皂苷屬于三萜類皂苷，根據(jù)其糖苷配基結(jié)構(gòu)的不同，被分為達瑪烷型和齊墩果酸型人參皂苷[5]，而達瑪烷型人參皂苷根據(jù)其糖苷配基基團的不同又被分成原人參二醇型(PPD型，主要包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3)和原人參三醇型(PPT型，主要包括Re、Rf、Rg1、Rh1)[6]。其中，人參皂苷Rg3、Rh1等在原人參中含量極低，通常經(jīng)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方能檢測到，為稀有人參皂苷[7]。研究認為Rg3、Rh1具有顯著的抗腫瘤、抗癌等作用[8-9]。

紅參是人參的最常見炮制品之一，即生人參經(jīng)蒸制、烘干后的炮制品[10]。在蒸制過程中，人參部分皂苷類成分降解，同時合成具生理活性的新的次生物質(zhì)。有研究表明，人參皂苷Rg3是蒸制成紅參的過程中生成的次生皂苷[11]。且紅參中Rg3和Rh1等在體內(nèi)吸收率高，有較佳的生理功能[12-13]，導(dǎo)致紅參在藥理活性方面與人參不同，其中抗腫瘤等活性尤為顯著[14]。與植株栽培相比，愈傷組織培養(yǎng)具有操作簡單、生長快、效率高、成本低等特點[15]。通過愈傷組織培養(yǎng)獲得藥用植物的次生代謝產(chǎn)物已被認為是一種行之有效的方法，Jiang等[16]研究表明，通過愈傷組織可獲得7種主要人參皂苷，包括原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd和原人參三醇型皂苷Re、Rf、Rg1。使用不同蒸制處理加工人參已被廣泛研究，但在人參愈傷組織中的應(yīng)用研究仍未見報道。本文以人參愈傷組織為試材，探究不同蒸制溫度、蒸制時間對人參愈傷組織中上述7種主要人參皂苷和2種稀有人參皂(Rg3、Rh1)含量的變化，為利用人參愈傷組織生產(chǎn)Rg3、Rh1等稀有人參皂苷奠定初步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1) 植物材料 人參植株采自吉林省汪清縣，經(jīng)由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室石鐵源教授鑒定為人參PanaxginsengC.A. Meyer。

2) 藥品與試劑 人參皂苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈和甲醇購于Fisher公司；HPLC分析用水為三重蒸餾水；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

3) 主要儀器 MJ-78A高壓滅菌鍋(上海施都凱儀公司)；BAO-250A鼓風(fēng)干燥箱(上海施都凱公司)；C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，美國Theromo scientific公司)；LC-10ATVP Plus高效液相系統(tǒng)(日本島津公司)，包括SIL-10A自動進樣器、CTO-10ASVP Plus柱溫箱、LC-10ADVP二元高壓梯度泵、SPD-10AVP Plus紫外可見雙波長檢測器；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海豫康公司)；DLSB-5/20低溫冷卻循環(huán)泵(上海豫康公司)；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康公司)；OSB-2100恒溫水浴鍋(上海愛朗公司)；CR22GⅢ高速離心機(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 人參愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

人參愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)參照劉佳等[17]的方法。人參愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基為1%瓊脂，3%蔗糖和1.5 mg/L二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS培養(yǎng)基，pH值5.8。培養(yǎng)條件為25 ℃暗培養(yǎng)。

1.2.2 樣品制備與人參皂苷的提取

選取培養(yǎng)3周的新鮮人參愈傷組織，將其分別置于105、115和125 ℃下蒸制1、1.5和2 h，未做處理的人參愈傷組織為對照組，隨后于50 ℃的干燥箱內(nèi)烘干至恒重后，用研缽研磨成粉末。人參皂苷的提取主要參照《中國藥典》2010年版[18]和韓宵等人的方法[19]。精密稱取0.3 g樣品，加入70 mL MeOH-H2O (2∶1,v/v)，置于恒溫水浴鍋中回流提取3 h，提取2次，再加入水飽和正丁醇萃取4次，濃縮揮干，并用色譜級的甲醇溶解(每0.3 g加3 mL)，用0.45 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜分析。每個樣品重復(fù)3次。

1.2.3 色譜條件

采用高效液相色譜(HPLC)分離人參皂苷，流動相A為水，B為乙腈，流速為1.0 mL/min，二元梯度洗脫(表1)；進樣體積為10 μL；檢測波長203 nm；柱溫25 ℃。對照組及樣品(115 ℃ 2.0 h)色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫

1-人參皂苷Rg1；2-人參皂苷Re；3-人參皂苷Rf；4-人參皂苷Rb1；5-人參皂苷Rc；6-人參皂苷Rb2；7-人參皂苷Rh1；8-人參皂苷Rd；9-人參皂苷Rg3

圖1 混合標準品(A)、對照組(B)、115 ℃ 2 h(C)的HPLC圖譜

Fig.1 HPLC chromatograms of the standard mixture (A), control group (B), and 115 ℃ 2 h (C)

1.2.4 人參皂苷標準曲線的建立

配制不同濃度的標準液，其中，主要人參皂苷(Rg1,Re,Rf,Rb1,Rc,Rd,Rb2)濃度梯度為0.02,0.05,0.08,0.10,0.20 mg/mL，稀有人參皂苷(Rg3,Rh1)濃度梯度為0.01,0.02,0.04,0.06,0.08 mg/mL。隨后將各個濃度的標準液進行高效液相色譜分析，每個樣品3次重復(fù)。以標準液濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制各個人參皂苷的標準曲線(表2)。

表2 人參皂苷標準曲線

1.2.5 穩(wěn)定性、精密度及重復(fù)性試驗

1) 穩(wěn)定性試驗 精密吸取混合標準品適量，分別于3,6,9,12 h進行HPLC檢測。按2.3步驟色譜條件測定，結(jié)果顯示混合標準品成分在12 h內(nèi)無明顯變化，峰面積標準差(RSD)均<2.1%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2) 精密度試驗 精密吸取同一供試樣品(對照組)，按2.3步驟色譜條件，重復(fù)進樣6次。結(jié)果顯示供試樣品溶液各人參皂苷類成分峰面積標準差(RSD)均<1.2%，表明儀器精密度良好。

3) 重復(fù)性試驗 取同一供試樣品(115 ℃,2.0 h)，稀釋6份，按2.3步驟色譜條件進樣后，計算供試樣品溶液各人參皂苷類成分含量。結(jié)果顯示供試樣品溶液各人參皂苷類成分含量的RSD均<0.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蒸制方法對PPD、PPT型人參皂苷和總皂苷含量的影響

不同蒸制方法對人參愈傷組織中PPD、PPT型人參皂苷和總皂苷含量的影響如表3所示。人參愈傷組織中PPD、PPT型人參皂苷和總皂苷含量均隨蒸制時間與蒸制溫度的增加而急劇減少，并于125 ℃、2.0 h時出現(xiàn)最低值，此時總皂苷和PPD、PPT型人參皂苷含量分別為1.554、1.123、0.431 mg/g，分別相對于對照組降低了88%、85%、91%。對于PPD、PPT型人參皂苷含量計算結(jié)果表明，PPD型人參皂苷含量在蒸制前后均遠高于PPT型。

表3 不同蒸制方法對人參愈傷組織中PPD、PPT 型人參皂苷和總皂苷含量的影響

注： a：Rg1+Re+Rf+Rb1+Rc+Rb2+Rd;b：Rb1+Rc+Rb2+Rd;c：Rg1+Re+Rf

2.2 不同蒸制方法對人參愈傷組織中9種皂苷類成分含量的影響

利用HPLC法測定不同蒸制方法對人參愈傷組織中9種皂苷類成分含量的影響(表4)。人參皂苷Rg1,Re,Rf, Rb1,Rb2,Rd的含量均隨蒸制溫度與時間的增加而顯著降低，且均在125 ℃、2.0 h處理中呈現(xiàn)最低值；人參皂苷Rc的含量則在105 ℃和115 ℃處理中略有提升，但仍在125 ℃處理中顯著下降。在對照組中未檢測到人參皂苷Rg3與Rh1在隨后的蒸制處理中出現(xiàn)并表現(xiàn)出不同程度的增加，且均在115 ℃、2.0 h處理時出現(xiàn)峰值，此時含量分別為0.445和0.450 mg/g。

表4 不同蒸制方法對人參愈傷組織中9種皂苷類成分含量的影響

注：“-” 表示未檢測到。

3 討論與結(jié)論

近年來學(xué)者對人參蒸制的研究日益增多，多集中于蒸制時皂苷類成分含量、結(jié)構(gòu)的變化以及蒸制后產(chǎn)生的部分微量次級皂苷的定性、鑒別[10-13]，尚未見人參愈傷組織蒸制處理的報道。相對于植株栽培，愈傷組織培養(yǎng)具有操作簡單、生長快、效率高、成本低等特點[15]。本文以人參愈傷組織為試材，探究不同蒸制溫度、蒸制時間對人參愈傷組織中9種人參皂苷類成分以及總皂苷含量的變化。結(jié)果表明，人參愈傷組織中PPD、PPT型人參皂苷和總皂苷含量均隨蒸制時間與蒸制溫度的增加而急劇減少。武雙等[20]研究不同蒸制法對三七主根中皂苷的影響時，總皂苷含量的變化呈現(xiàn)了類似的趨勢，并于125 ℃、4.0 h的炮制品中出現(xiàn)最低值。推測在蒸制過程中，高溫高壓使主要人參皂苷發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，從而生成稀有人參皂苷。有趣的是，在武雙等[20]研究中，125 ℃、4.0 h的炮制品的總皂苷質(zhì)量為38.01 mg，質(zhì)量分數(shù)12.67%，相對于對照組(44.58 mg，14.86%)僅降低了15%左右。這與本實驗結(jié)果具有較大差異，可能由于試驗所用材料的不同所致，愈傷組織是未分化的原始細胞團，相對于植株沒有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，可能降低了轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)阻礙，使人參皂苷單體更易相互轉(zhuǎn)化。

在對人參愈傷組織中9種人參皂苷成分的研究中發(fā)現(xiàn)，Rg1, Re, Rf, Rb1, Rb2, Rd的含量均隨蒸制溫度與時間的增加而顯著降低；人參皂苷Rc的含量則在105 ℃與115 ℃處理中略有提升，但仍在125 ℃處理中顯著下降。高越等[21]報道了不同加熱時間對人參皂苷單體含量的影響，發(fā)現(xiàn)Rg1,Re和Rb2加熱后含量降低。鄭重等[14]研究認為，人參皂苷Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc的20位糖基極不穩(wěn)定，易在蒸制過程中水解生成原人參二醇、原人參三醇或其他的次生苷。值得注意的是，人參皂苷Rg3出現(xiàn)于105 ℃、1.5 h處理中，略晚于Rh1(105 ℃、1.0 h)。類似地，張穎等[22]也報道了不同蒸制工藝對紅參中人參皂苷類成分的影響，并發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh1與Rg3分別出現(xiàn)于80 ℃、2 h與100 ℃、4 h處理中。推測可能由于人參皂苷Rg3的轉(zhuǎn)化過程相比于Rh1更為復(fù)雜(圖2)：在蒸制處理過程中，人參皂苷Rf可能直接降解為人參皂苷Rh1，人參皂苷Rg1與Re可降解原人參三醇并繼續(xù)轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh1；而人參皂苷Rb1, Rb2和Rc降解為人參皂苷Rd，并隨溫度與時間的增加，方可繼續(xù)降解為人參皂苷Rg3[23]。

圖2 推測的9種人參皂苷類成分的轉(zhuǎn)化

綜上所述，人參愈傷組織經(jīng)蒸制處理可產(chǎn)生Rg3與Rh1等稀有人參皂苷，并且其含量與蒸制溫度和時間密切相關(guān)。而進一步提高Rg3與Rh1的轉(zhuǎn)化效率，則需優(yōu)化蒸制方法。

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Effects of different steaming methods on ginsenoside contents in callus ofPanaxginseng

LIU Jia1,2WANG Yang1, LV Shuang1, QUAN Xueli1, LI Xiangguo1, WU Songquan1,2*

(1.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity;2.KeyLaboratoryofNaturalResourcesofChangbaiMountain&FunctionalMoleculesofMinistryofEducation,YanbianUniversity:Yanji,Jilin133002,China)

Callus of ginseng as the materials, the effects of different steaming methods on the contents of nine kinds of individual ginsenosides Rg1, Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3 and Rh1 were determined by HPLC. The results showed that the contents of Rg1, Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2 and Rd were significantly reduced under different steaming treatments compared to the control. Rg3 and Rh1 were not detected in the control, but increased by different degrees in the subsequent treatments and reached peaks at 115 ℃ 2.0 h. It indicated that Rg3 and Rh1 could be obtained by controlling conditions of steaming methods.

Panaxginseng; callus; ginsenosides; steaming methods; HPLC methods

2017-03-25 基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21462044)

劉佳(1993—)，女，吉林延吉人，在讀碩士，研究方向為植物生物技術(shù)。吳松權(quán)為通信作者，

E-mail: arswsq@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0041-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.007

R284

A