張騰騰， 張 涵， 李太元， 張 敏， 許廣波， 李艷茹

(延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

富鍺酵母蛋白粉對細菌生長及部分生物學特性的影響

張騰騰， 張 涵， 李太元， 張 敏， 許廣波， 李艷茹*

(延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

為了研究富鍺酵母蛋白粉對細菌生長及部分生物學特性的影響，選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的標準菌株作為受試菌種，進行富鍺酵母蛋白粉對細菌的增菌、耐鹽性、酸堿耐受性、溫度耐受性的影響以及其對嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸和抑菌效果的影響等試驗。結果表明：富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有增菌作用，其最適作用濃度分別為1、1、4、4 mg/mL。富鍺酵母蛋白粉能一定程度地提高細菌的耐酸堿能力、膽鹽耐受能力及溫度耐受能力，提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸量和其細菌素對大腸桿菌的抑菌效果。本試驗為富鍺酵母蛋白粉在飼料中的添加提供一定的理論基礎。

富鍺酵母蛋白粉；酵母蛋白粉；細菌；生長；生物學特性

微生物蛋白質又稱單細胞蛋白(single cell protein ,SCP),具有高蛋白質、多氨基酸、低脂等特點，并可以從廢物中產(chǎn)生[1]。酵母蛋白是干燥益生菌酵母除去多糖等其他成分富集而成的一種功能性蛋白，主要是菌體蛋白及酵母代謝產(chǎn)物，富含小肽、氨基酸、核苷酸、谷氨酸鹽和肌醇等養(yǎng)分[2]。有機鍺具有抗炎等藥理作用，并且在癌癥、關節(jié)炎和骨質疏松癥的治療方面有一定功效[3]。富鍺酵母蛋白粉為基本無毒食品，可作為食品功能基料廣泛應用于食品工業(yè)和保健領域中[4]。乳酸菌作為動物腸道的正常菌群，在維持動物腸道的微生態(tài)平衡和調節(jié)動物代謝方面發(fā)揮重要作用[5]。枯草芽孢桿菌在動物腸道內(nèi)具有抑制致病菌生長和促進有益菌生長的雙重功能[6]。大腸桿菌在正常情況下對健康有益，一旦增殖失控，或從腸道轉移到身體其他部位，就可能引發(fā)許多問題。金黃色葡萄球菌是臨床感染性疾病最常見的病原菌，可引起皮膚軟組織、下呼吸道及血液系統(tǒng)等多種部位的感染，尤其是醫(yī)院感染較常見的病原菌[7]。本試驗把4種細菌添加到含富鍺酵母蛋白粉的培養(yǎng)基中，研究富鍺酵母蛋白粉對細菌生長及特性的影響，為進一步開發(fā)研究富鍺酵母產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種來源

大腸桿菌(Escherichiacoli編號：1.2385)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis編號：63510)；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus編號：1.1854)；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus編號：1.0089)。均購自中國科學院微生物研究所。

1.2藥品與試劑

富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉(由延邊大學農(nóng)學院動物營養(yǎng)實驗室提供)；普通肉湯培養(yǎng)基(購自青島高科園海博生物技術有限公司)；MRS肉湯培養(yǎng)基，瓊脂粉，LB肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術有限責任公司)。

1.3 菌懸液制備

挑取復活在固體培養(yǎng)基上的菌落于液體培養(yǎng)基(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌使用LB肉湯，嗜酸乳桿菌使用MRS肉湯，下同)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，用生理鹽水稀釋菌懸液，使其OD值為0.7±0.1[8]，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 富鍺酵母蛋白粉對細菌增殖的影響

用普通肉湯把富鍺酵母和酵母蛋白粉分別配成質量濃度為0、0.1%～1.0%的溶液，使其總體積為1 mL(下同)。每管添加菌懸液20 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，嗜酸乳桿菌作厭氧培養(yǎng)(下同)。利用稀釋涂布平板法對細菌進行計數(shù)(下同)。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉的增殖和最適作用濃度。

1.5 酵母蛋白粉對細菌耐膽鹽能力的影響

用最適濃度的富鍺酵母蛋白粉肉湯(標記為F)配制膽鹽濃度分別為0、0.1%～0.5%的溶液，另做酵母蛋白粉對照組(標記為J)和肉湯對照組(標記為L)。每管添加菌懸液20 μL，37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，并計數(shù)。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母對細菌耐膽鹽能力的影響。

1.6 富鍺酵母蛋白粉對細菌酸堿耐受性的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對照組和肉湯對照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組6管，并分別用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調整培養(yǎng)基的pH值至2、4、6、7、9、10，每管添加菌懸液20 μL，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，并計數(shù)。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對細菌酸堿耐受性的影響。

1.7 富鍺酵母蛋白粉對細菌生長曲線的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對照組和肉湯對照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組20 mL，并調整pH值至最適，分別添加菌懸液400 μL，37℃恒溫培養(yǎng)。枯草桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌每隔2 h、嗜酸乳桿菌每隔3 h取1 mL菌液，計數(shù)。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對細菌生長曲線的影響。

1.8 富鍺酵母蛋白粉對細菌溫度耐受性的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對照和肉湯對照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組10管，每管添加菌懸液20 μL，分別置于40、60、80 ℃ 3個梯度的水浴中，均處理10、20、30 min，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，并計數(shù)。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對細菌溫度耐受性的影響。

1.9 富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對照組和肉湯對照組3組肉湯培養(yǎng)基，每組100 mL，分別添加菌懸液2 mL，混勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔3 h取5 mL菌液測pH值。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響。

1.10 富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌細菌素抑菌效果的影響

配富鍺酵母蛋白粉、酵母蛋白粉對照組和肉湯對照組3組肉湯培養(yǎng)基，每管體積為10 mL，每管加嗜酸乳桿菌菌懸液200 μL，混勻后37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，3 000 r/min離心5 min，取上清液。利用牛津杯法，測3組細菌素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑。重復3次，取平均值，分析富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌細菌素抑菌效果的影響。

2 結果與分析

2.1 富鍺酵母蛋白粉濃度對細菌增殖的影響

由圖1可知，富鍺酵母蛋白粉有促進細菌生長的作用，其作用效果要比酵母蛋白粉好(除嗜酸乳桿菌外)，富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的最適作用濃度分別為1,1,4,4 mg/mL，而酵母蛋白粉的最適濃度分別為5,3,2,2 mg/mL。

圖1 蛋白粉濃度對細菌的影響Fig.1 The effects of protein powder concentration on bacteria

2.2 富鍺酵母蛋白粉對細菌耐膽鹽作用的影響

富鍺酵母蛋白粉降低了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的膽鹽耐受能力；提高了枯草芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的膽鹽耐受能力(圖2)。

圖2 蛋白粉對細菌膽鹽耐受能力的影響Fig.2 The effects of protein powder on the salt tolerance of bacteria

2.3 富鍺酵母蛋白粉對細菌酸堿耐受性的影響

富鍺酵母蛋白粉提高了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和嗜酸乳桿菌的耐酸堿能力，且富鍺酵母蛋白粉比酵母蛋白粉對細菌耐酸能力提高幅度大(圖3)，尤其是pH值為6時。

圖3 蛋白粉對細菌酸堿耐受能力的影響Fig.3 The effects of protein powder on acid and alkali tolerance of bacteria

2.4 富鍺酵母蛋白粉對細菌生長曲線的影響

由圖4可知，富鍺酵母蛋白粉延長了金黃色葡萄球菌對數(shù)期(由8～14 h至4～20 h)，縮短了金黃色葡萄球菌的適應期(由0～8 h至0～4 h)；縮短了大腸桿菌的適應期(由0～10 h至0～4 h)，延長了其對數(shù)生長期；延長了枯草桿菌的適應期(由0～14 h至0～18 h)，但是提高了其對數(shù)期的生長速度；縮短了嗜酸乳桿菌的適應期(由0～15 h至0～12 h)，但提高了對數(shù)生長期的生長速度(圖5)。

圖4 蛋白粉對細菌生長曲線的影響 圖5 蛋白粉對嗜酸乳桿菌生長曲線的影響Fig.4 The effects of protein powder on bacterial growth curve Fig.5 The effects of protein powder on L. acidophilus growth curve

2.5 富鍺酵母蛋白粉對細菌溫度耐受性的影響

由圖6可知，富鍺酵母蛋白粉不同程度地提高了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和嗜酸乳桿菌的溫度耐受性。但在40 ℃ 30 min時，蛋白粉的添加降低了大腸桿菌的溫度耐受性。對嗜酸乳桿菌而言，富鍺酵母組對溫度耐受性的提高幅度大于酵母組。

圖6 蛋白粉對細菌溫度耐受能力的影響Fig.6 The effects of protein powder on temperature tolerance of bacteria

2.6 富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響

隨著時間的延長，菌液pH值逐漸下降。在42～48 h時，各組pH值趨于穩(wěn)定，且酵母組的pH

值<富鍺酵母組的pH值<對照組的pH值(圖7)。這說明富鍺酵母蛋白粉提高了嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力，但提高幅度低于酵母蛋白粉。

圖7 蛋白粉對嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸的影響Fig.7 The effects of protein powder on acid production of L. acidophilus

2.7 富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌細菌素抑菌效果的影響

由圖8可知，富鍺酵母組乳酸菌素對大腸桿菌的抑菌直徑均大于對照組，但小于酵母組，說明富鍺酵母蛋白粉提高了乳酸菌素對大腸桿菌的抑制作用，但其幅度不如酵母蛋白粉；富鍺酵母蛋白粉對乳酸菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用幾乎沒有影響。

圖8 蛋白粉對嗜酸乳桿菌細菌素抑菌效果的影響

3 討論與結論

微生物蛋白為細菌提供營養(yǎng)物質，對細菌的生長繁殖起著重要的影響。富鍺酵母是集酵母的高營養(yǎng)、有機鍺的免疫調節(jié)和抗腫瘤功能于一身的高附加值功能食品[4]。本次試驗發(fā)現(xiàn)富鍺酵母蛋白粉能促進細菌生長，縮短菌株生長周期和提高菌體增殖速度。但高劑量時對受試菌的促生長作用降低甚至起抑制作用。蘇琦表明抗菌肽可以在細胞膜上形成穿膜孔道，使膜快速去極化，引起細菌死亡[9]。高劑量富鍺酵母蛋白粉的抑制機制是否與其肽的含量有關，還需進一步研究。

膽鹽隨肝膽汁排至小腸，影響腸道膽鹽濃度[10]。動物實驗及臨床證實膽鹽有抑制細菌生長的作用[11]。本次試驗發(fā)現(xiàn)富鍺酵母蛋白粉提高了嗜酸乳桿菌和枯草桿菌的膽鹽耐受能力。Smet I D等人指出，膽鹽能夠以分子的形式通過被動擴散進入細胞，然后在細胞質中釋放氫離子使細胞內(nèi)酸化，從而引起細菌的死亡。細菌可以利用ATP所生成的H+—三磷酸腺苷來驅逐質子以調節(jié)細胞質的pH值，從而減輕膽鹽的毒害作用[12]。由此可以推測富鍺酵母蛋白粉可能為細菌提供了大量的ATP來源，從而提高了細菌的膽鹽耐受力。

隨著攝入食物的變化，胃腸道內(nèi)的pH值也隨之發(fā)生變化，胃酸的分泌造成胃內(nèi)酸性環(huán)境，影響細菌的生長。本次試驗表明,富鍺酵母蛋白粉可以不同程度的提高細菌的酸堿耐受能力。田會芹表明,pH值的改變會引起細胞膜電荷變化，進而影響細菌對營養(yǎng)物質的吸收[13]。因此,可以猜測富鍺酵母蛋白粉可能保護了細菌細胞膜電荷的變化，從而提高了細菌的酸堿耐受性。

溫度對細菌生長繁殖有較大影響，過高的溫度可以殺死細菌。環(huán)境溫度會影響活菌制劑的生產(chǎn)、運輸、保存及使用。該試驗結果顯示,富鍺酵母蛋白粉提高了細菌的溫度耐受性。菌體蛋白質(包括酶類)因加熱而發(fā)生變性或凝固，活性消失、代謝發(fā)生障礙，因而導致細菌死亡。由此推測蛋白粉可能補充了蛋白質，從而提高了細菌的溫度耐受性。

乳酸菌產(chǎn)酸功能是一個很重要的指標，酸可使胃內(nèi)蛋白酶原激活，同時酸具有強的殺菌作用[14]。乳酸菌產(chǎn)生的有機酸可以降低其他雜菌細胞間質的pH值破壞其滲透壓，以及破壞雜菌的細胞膜進入細胞內(nèi)干擾其活動從而產(chǎn)生抑菌作用[15]。本次試驗發(fā)現(xiàn)富鍺酵母蛋白粉可以一定程度的提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力及其對大腸桿菌的抑制作用。其抑菌機制可能是提高了產(chǎn)酸量從而抑制了大腸桿菌的生長。

富鍺酵母蛋白粉對嗜酸乳桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有增菌作用，其最適作用濃度分別為1、1、4、4mg/mL。富鍺酵母蛋白粉能一定程度的提高細菌的耐酸堿能力、膽鹽耐受能力及溫度耐受能力，提高嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸量和其[][]

細菌素對大腸桿菌的抑菌效果。畜禽可以通過食用添加富鍺酵母蛋白粉的飼料，提高腸道對營養(yǎng)物質的吸收能力，從而提高飼料利用率，提高畜禽的產(chǎn)量。本試驗為富鍺酵母蛋白粉在飼料中的添加提供一定的理論基礎。

[1] Nalage D N,Khedkar G D,Kalyankar A D,et al.Single Cell Proteins[J].Encyclopedia of Food & Health,2016:790-794.

[2] 邢新建,王永杰,孫麗紅,等.酵母蛋白粉與血漿蛋白粉在乳仔豬日糧中應用效果的研究[J].中國畜牧雜志,2012,48(17):45-47.

[3] Lee J H,Kim K W,Yoon M Y,et al.Anti-inflammatory effect of germanium-concentrated yeast against paw oedema is related to the inhibition of arachidonic acid release and prostaglandin E production in RBL 2H3 cells[J].Auton Autacoid Pharmacol,2005,25(4):129-134.

[4] 郭鑭,張海悅.富鍺酵母蛋白粉的研究[J].中國釀造,2008(12):49-51.

[5] 王文梅,許麗.乳酸菌體外和體內(nèi)降解膽固醇的機理及其應用[J].動物營養(yǎng)學報,2014,26(2):295-303.

[6] 王利賓,孫利娜.枯草芽孢桿菌作用機制及其在養(yǎng)殖業(yè)中的應用研究進展[J].飼料博覽,2015(1):35-38.

[7] 李秀,印璞,段窮.金黃色葡萄球菌的感染現(xiàn)狀及耐藥性分析[J].中國實驗診斷學,2014(12):2035-2036.

[8] 孟俊龍,馮翠萍,常明昌,等.香菇多糖抑菌作用的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2012,32(3):261-264.

[9] 蘇琦,孫燕,李治.抗菌肽對細菌胞內(nèi)殺傷作用的分子機制[J].中國生物制品學雜志,2010,23(3):325-328.

[10] 鞏利昌,馬宏鵬,周玉婷,等.膽鹽制備工藝的研究/探討[J].青?？萍?2014(4):86-87.

[11] 劉建強.膽汁酸對肝硬化大鼠腸道細菌過度生長、細菌移位及內(nèi)毒素血癥的作用[D].廣州：第一軍醫(yī)大學;南方醫(yī)科大學,2005.

[12] Smet I,Hoorde L,Woestyne M,et al.Significance of bile salt hydrolytic activities of lactobacilli[J].J.Appl Bacteriol,1995,79(3):292-301.

[13] 田會芹,李賢,傅松哲,等.溫度及pH值對殺鮭氣單胞菌生長的影響研究[J].海洋科學,2015,39(7):7-12.

[14] 郭志杰,李杰,李鑫,等.豬源乳酸菌的分離、篩選、鑒定及產(chǎn)酸性能的研究[J].飼料工業(yè),2010,31(20):45-48.

[15] Li D,Yang F,Wang Y,et al.Isolation and identification of lactic acid bacteria with antibacterial activity from alfalfa silage[J].Feed Industry,2016，37(19)：40-44.

Effect of germanium-enriched yeast protein powder on the growth and biological characteristic of intestinal bacteria

ZHANG Tengteng, ZHANG Han, LI Taiyuan, ZHANG Min, XU Guangbo, LI Yanru*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In order to study the effect of germanium-enriched protein powder on the growth and biological characteristic of intestinal bacterial, the standard strains ofEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,BacillussubtilisandLactobacillusacidophiluswere selected as tested bacteria strains. We evaluated the effects of germanium-enriched yeast protein powder on the growth, salt tolerance, acid-base tolerance, temperature tolerance of the tested bacteria stains, and checked the effects on the acid production and bacteriostasis ofL.acidophilus. The results showed that the germanium-enriched yeast protein powder stimulated the growth ofL.acidophilus,B.subtilis,S.aureus,E.coli, and the most suitable concentrations of germanium powder were 1, 1, 4 and 4 mg/mL, respectively. The germanium-enriched yeast protein powder could improve the ability of acid-resistance and alkali-resistance, bile salt tolerance and temperature tolerance of the tested bacteria, and increase the acid production ofL.acidophilusand the bacteriostasis effect of bacteriocin onE.coli. The results provide a theoretical basis for the application of the germanium-enriched yeast protein powder in feed additives.

Germanium-enriched yeast protein powder; yeast protein powder; bacteria; growth; biochemical characteristics

2017-03-27 基金項目：吉林省科技廳重點項目(20110236)

張騰騰(1991—)，女，河南永城人，在讀碩士，研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學，李艷茹為通信作者，

E-mail：hmwang@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)02-0060-05

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.02.010

TQ936

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