晏子俊， 李萬(wàn)玉， 李 瑤， 胡雪原， 何 丹，張景勍

（重慶醫(yī)科大學(xué) 重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016）

天門冬酰胺酶納米囊的藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究

晏子俊， 李萬(wàn)玉， 李 瑤， 胡雪原， 何 丹，張景勍*

（重慶醫(yī)科大學(xué) 重慶藥物高校工程研究中心，重慶 400016）

作者研究了載天門冬酰胺酶 （Asparaginase，AN）自組裝透明質(zhì)酸-聚乙二醇（Hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol），HA-g-PEG）/γ-環(huán)糊精（γ-cyclodextrin，γ-CD）納米囊（HA-g-PEG/γ-CD nanocapsules loaded with AN，AHRPs）在雄性SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性?？疾炝薃HRPs的透射電鏡、粒徑、Zeta電位、包封率，并分別測(cè)定大鼠靜脈給予AHRPs和游離AN后，不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿樣品中AN的活性。采用DAS 2.1.1軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，對(duì)AHRPs和游離AN進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。經(jīng)計(jì)算，AHRPs的平均粒徑為（410.30±3.20）nm，Zeta電位為（-31.40±1.65）mV，平均包封率為（42.80±4.37）%。AHRPs和游離AN的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC（0～48h）分別為（104.01±1.68）U/（mL·h）和（46.38±1.98）U/（mL·h），AUC（0～∞）分別為（131.03± 19.67）U/（mL·h）和（51.44±3.01）U/（mL·h），t1/2分別為（4.31±1.53）h和（1.86±0.38）h。與游離AN比較，AHRPs的AUC（0～48h）、AUC（0～∞）和t1/2分別提高了2.24、2.55和2.32倍。AUC（0～48h）、AUC（0～∞）和Cmax的90%可置信區(qū)間分別為77.1%～78.7%、76.7%～78.3%、98.9%～100.5%。AHRPs延長(zhǎng)了AN在大鼠體內(nèi)的生物半衰期，提高了AN在大鼠體內(nèi)的生物利用度，且AHRPs與游離AN不具有生物等效性。

天門冬酰胺酶；納米囊；藥代動(dòng)力學(xué)；生物等效性

天門冬酰胺是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的必需氨基酸。某些腫瘤細(xì)胞（如淋巴白血病細(xì)胞等）缺乏天門冬酰胺合成酶而不能合天成門冬酰胺，須依賴宿主供給。給予天門冬酰胺酶（Asparaginase，AN）后，AN通過(guò)降解患者體內(nèi)的天門冬酰胺而抑制腫瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的正常合成，從而使腫瘤細(xì)胞死亡，而正常細(xì)胞有能力進(jìn)行自身合成而不受影響[1-2]。但AN在臨床應(yīng)用上存在著生物半衰期短、易被降解、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[3]，限制了AN在臨床上的應(yīng)用。 因此，延長(zhǎng)AN的生物半衰期、增加AN的穩(wěn)定性和提高AN的生物利用度已成為AN研究熱點(diǎn)。近來(lái)，文獻(xiàn)[4-5]中報(bào)道的自組裝納米囊是一種新型的藥物載體，其空心結(jié)構(gòu)可封裝酶、小分子藥物、基因等，它具有生物膜的相似性，能提高封裝藥物的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)被封裝藥物的生物半衰期，提高封裝藥物的生物利用度以及降低毒副作用等特點(diǎn)。

本文中依據(jù)上述思路，將透明質(zhì)酸-聚乙二醇（Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）與γ-環(huán)糊精（γ-cyclodextrin，γ-CD）采用自組裝方法制得載帶AN的HA-g-PEG/γ-CD納米囊（HA-g-PEG/γ-CD nanocapsules loaded with AN，AHRPs），并考察了AHRPs的透射電鏡、粒徑、Zeta電位、包封率以及AHRPs在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料、試劑 AN（225 IU/mg，純度≥96.0%，批號(hào)：312PLASP11）：購(gòu)自以色列Prospec公司；HA（純度：＞99.0%，相對(duì)分子質(zhì)量：12 000，批號(hào)：20131027）：購(gòu)自曲阜市廣龍生物制品廠；γ-CD（純度：＞98.0%，相對(duì)分子質(zhì)量：1297.12，批號(hào)：C0014）：購(gòu)自都萊生物技術(shù)有限公司；PEG（相對(duì)分子質(zhì)量：2 000，規(guī)格：250 g）：購(gòu)自Sigma-aldrich公司；HA-g-PEG（批號(hào)：20141012；20141016；20141021）：作者所在實(shí)驗(yàn)室提供；Tris-HCl緩沖液 （50 mmol/L，pH 7.3），作者所在實(shí)驗(yàn)室自配；其它試劑均為分析純。1.1.2 主要儀器與動(dòng)物 Milli-Q型超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠制造；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂(lè)儀器有限公司產(chǎn)品；Zetasizer Nano zs90型激光粒度電位儀：英國(guó)馬爾文公司產(chǎn)品；UV-7504 PC型紫外分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品。

清潔級(jí)健康SD大鼠，雄性，體重（250±20）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 （許可證號(hào)：SCXK-（渝）2014-0001）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 AHRPs的制備 將適量溶有AN的HA-g-PEG溶液緩慢滴加至γ-CD飽和溶液中，一定溫度下磁力攪拌 2 h后，即得 AHRPs[6-8]（批號(hào)：20141013；20141017；20141022）。

1.2.2 AHRPs的透射電鏡 取AHRPs適量，用Tris-HCl緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，在透射電鏡下觀察AHRPs的形態(tài)。

1.2.3 AHRPs粒徑和Zeta電位的測(cè)定 使用馬爾文粒度儀檢測(cè)AHRPs的粒徑和Zeta電位。方法如下：取AHRPs溶液適量，加入Tris-HCl緩沖液稀釋一定的倍數(shù)后，測(cè)定AHRPs的粒徑和Zeta電位。

1.2.4 AHRPs包封率的測(cè)定 按照葡聚糖凝膠法[9]測(cè)定AHRPs的包封率。方法如下：制備過(guò)柱后的AHRPs，在595 nm波長(zhǎng)下，測(cè)得吸光度A1。同法處理，測(cè)得未過(guò)柱的AHRPs的吸光度A2。由測(cè)得的吸收值A(chǔ)1和A2計(jì)算出1mL AHRPs混懸液中制劑所含AN的質(zhì)量M1和AHRPs混懸液中AN總質(zhì)量M2，包封率按照如下公式計(jì)算：

上式中，M1為AHRPs混懸液中制劑所含AN的質(zhì)量，M2為AHRPs混懸液中AN總質(zhì)量。

1.2.5 AN活性的測(cè)定 主要參照馬斯本-利斯通法[6，10]測(cè)定AN的活性，并進(jìn)行改進(jìn)即實(shí)驗(yàn)前樣品預(yù)熱2min。

1.2.6 藥代動(dòng)力學(xué)

1）動(dòng)物的飼養(yǎng)。雄性SD大鼠購(gòu)買后飼養(yǎng)7 d以上用于實(shí)驗(yàn)，環(huán)境溫度為（25.0±2.0）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，自由飲水和進(jìn)食。

2）動(dòng)物的分組和給藥。將12只雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只。分別尾靜脈注射給予AHRPs和游離AN，劑量均為2.0 kU/kg。給藥前禁食24 h。

3）樣品的采集和處理[11-12]。分別在給藥后0.08、0.17、0.25、0.50、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、48 h眼底靜脈叢取血。采血置于肝素化后的試管，以3 000 r/min離心10 min后分離血漿樣品，按“1.2.5 AN活性的測(cè)定”項(xiàng)下方法進(jìn)行活性測(cè)定，計(jì)算血漿樣品中AN的活性，進(jìn)行AHRPs的藥動(dòng)學(xué)研究。

4）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法。根據(jù)所測(cè)結(jié)果，繪制平均血藥濃度-時(shí)間曲線。用DAS 2.1.1軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.7 生物等效性的評(píng)價(jià) 將AHRPs和游離AN的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)AUC（0～48h）、AUC（0～∞）及Cmax進(jìn)行方差分析，再采用雙向單側(cè)t檢驗(yàn) （顯著性水平P=0.05），90%可信限考察，Tmax采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Wilcoxon檢驗(yàn)。評(píng)價(jià)AHRPs和游離AN是否具有生物等效性（α=0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 AHRPs在透射電鏡下的形態(tài)

透射電鏡下觀察到AHRPs呈均勻分布的圓形或橢圓形，如圖1所示。

2.2 AHRPs的粒徑和Zeta電位

馬爾文激光粒度電位儀測(cè)得AHRPs的平均粒徑為（410.30±3.20）nm，Zeta電位為（-31.40±1.65）mV。

圖1 AHRPs的透射電鏡圖Fig.1 Transm ission electron m icroscopy image of AHRPs

2.3 AHRPs的包封率

測(cè)得3批AHRPs的包封率分別為：38.75%，42.20%和47.44%。用excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。經(jīng)計(jì)算，AHRPs的包封率為（42.80±4.37）%（n=3）。

2.4 藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，平均血藥濃度為縱坐標(biāo)，建立了AN在大鼠體內(nèi)AHRPs和游離AN的藥-時(shí)曲線（見(jiàn)圖2），圖2（a）為取血時(shí)間點(diǎn)下的藥-時(shí)曲線，圖2（b）為相等時(shí)間間隔下的藥-時(shí)曲線。AHRPs和游離AN在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖2 大鼠靜脈給予AHRPs和游離AN后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（±s，n=6）Fig.2 M ean concentration-time curves of AHRPs and free AN w ith intravenous adm inistration

如圖2所示，大鼠靜脈注射游離AN后，AN失活較快，6 h時(shí)幾乎完全失活，8 h時(shí)完全失活。而AHRPs靜注給藥后，AN失活較慢，6 h時(shí)仍有較高活性，12 h時(shí)才完全失活。結(jié)果表明，AHRPs延長(zhǎng)了AN在大鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間，提高了AN在大鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性。

表1 SD大鼠靜脈注射AHRPs和游離AN后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Table 1 M ain pharmacokinetic parameters after the injection of AHRPs and free AN into rats

表1 SD大鼠靜脈注射AHRPs和游離AN后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=6）Table 1 M ain pharmacokinetic parameters after the injection of AHRPs and free AN into rats

參數(shù)A H R P s A N A U C(0～48h)/ ( U /（m L · h）) 4 6 . 3 8 ± 1 . 9 8 A U C(0～∞)/ ( U /（m L · h）) 1 0 4 . 0 1 ± 1 . 6 8 1 3 1 . 0 3 ± 1 9 . 6 7 5 1 . 4 4 ± 3 . 0 1 Cmax/ ( U / m L ) 2 6 . 3 1 ± 0 . 3 5 2 6 . 0 6 ± 0 . 8 8 t1/2/ h 4 . 3 1 ± 1 . 5 3 1 . 8 6 ± 0 . 3 8

由表1參數(shù)可以看出：（1）AHRPs的半衰期t1/2為 （4.31±1.53）h，游離AN的為 （1.86±0.38）h，AHRPs的t1/2為游離AN的2.32倍，說(shuō)明AHRPs消除較慢，能有效延長(zhǎng)AN在大鼠體內(nèi)生物半衰期。（2）AHRPs的AUC（0～48h）為（104.01±1.68）U/（mL·h），是游離AN的2.24倍，說(shuō)明AHRPs顯著提高了游離AN的生物利用度。

2.5 生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，AHRPs與游離AN的AUC（0～48h）、AUC（0～∞）和Cmax3個(gè)參數(shù)的90%可置信區(qū)間均不在生物等效性標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間范圍內(nèi)，因此AHRPs與游離AN生物等效性不合格。另外，對(duì)Tmax進(jìn)行非參數(shù)法檢驗(yàn)，結(jié)果顯示AHRPs和游離AN的Tmax具有顯著性差異（P＜0.05）。按照生物等效性的判定標(biāo)準(zhǔn)，AHRPs與游離AN不具有生物等效性，即AHRPs的藥效學(xué)標(biāo)準(zhǔn)明顯比游離AN的高。

表2 大鼠靜注（2 kU/kg，i.v.）AHRPs和游離AN后，生物等效性的比較Table 2 Bioequivalence com parison of AHRPs and free AN via oral（at the identical dose of 50mg/kg of JM）and intravenous（at the dose of 2 kU/kg of AN）routs，respectively，n=6 per group

3 結(jié)語(yǔ)

AN在臨床應(yīng)用上存在生物半衰期短、穩(wěn)定性差和毒副作用等缺點(diǎn)。目前，針對(duì)AN的缺點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行了下列研究：聚乙二醇對(duì)AN進(jìn)行物理包埋或修飾[15-16]；制備納米結(jié)構(gòu)AN脂肪酸生物共軛體[17]；將AN共價(jià)結(jié)合固定化于絲素納米顆粒[18]；將AN制備成前體脂質(zhì)體[19-20]等。但以上對(duì)AN的改善方法都不能使AN發(fā)揮其最優(yōu)的催化活性，且大都會(huì)存在較低的生物相容性、較差的穩(wěn)定性及AN易脫落等缺點(diǎn)。

作者首次采用自組裝法成功制備了AHRPs，并對(duì)AHRPs在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性進(jìn)行了研究，以期能提高AN在大鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)AN的生物半衰期，并提高其生物利用度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將AN制成AHRPs，使AN的靜注生物利用度提高了2.24倍，半衰期t1/2延長(zhǎng)了2.32倍。說(shuō)明AHRPs提高了AN在體內(nèi)的生物利用度和穩(wěn)定性，并延長(zhǎng)了AN在體內(nèi)的生物半衰期。可能的原因是：該納米囊材料具有生物相似性，能有效提高AN的吸收：空心納米囊結(jié)構(gòu)，能阻擋抗胰蛋白水解酶及抗原與AN的接觸，因此在一定程度上能增強(qiáng)AN的穩(wěn)定性。且根據(jù)生物等效性判斷標(biāo)準(zhǔn)，AHRPs與游離AN生物等效性不合格，即AHRPs的藥效學(xué)標(biāo)準(zhǔn)明顯比游離AN的高。本文中首次制備AHRPs，且對(duì)其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性進(jìn)行了研究，故具有一定的前瞻性，也為AN在臨床上的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Pharmacokinetics and Bioequiavailability of Asparaginase Nanocapsules

YAN Zijun， LIWanyu， LIYao， HU Xueyuan， HE Dan， ZHANG Jingqing*
（Engineering Research Center in University，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

To study the pharmacokinetics and bioequivalence of asparaginase hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol）/γ-cyclodextrin nanocapsules（AHRPs）in SD rats.We observed the image of AHRPs under the transm ission electron m icroscopy.Size，Zeta potential，entrapment efficiency were detected.The AN activity was assayed after the intravenous injection of AHRPsand free AN into rats.The pharmacokinetic parameterswere calculated by software DAS 2.1.1，then the bioequivalence was judged.The average particle size was（410.30±3.20）nm，Zeta potential was（-31.40±1.65）mV，average entrapment efficiency was（42.80±4.37）%.AUC（0～48h）of AHRPs andfree AN was（104.01±1.68）U/（m L·h）and（46.38±1.98）U/（m L·h），AUC（0-∞）was（131.03±19.67）U/（m L·h）and（51.44±3.01）U/（m L·h），t1/2was（4.31±1.53）h and（1.86±0.38）h，respectively. Compared w ith free AN，AUC（0～48h），AUC（0-∞）and t1/2of AHRPswere increased 2.24，2.55 and 2.32 times，respectively.The 90%confidential intervals of AUC（0～48h），AUC（0-∞）and Cmaxof tested formulation were 77.1%～78.7%，76.7%～78.3%，98.9%～100.5%，respectively.AHRPs can improve the bioavailability and extend the biological half-life of AN in rats.AHRPs and free AN are not bioequivalent.

asparaginase，nanocapsules，pharmacokinetics，bioequiavailability

Q 556；R 392-33

A

1673—1689（2017）05—0461—05

2015-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30973645）；重慶市首批高等優(yōu)秀人才資助計(jì)劃（X10058）；重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CYS16133）。

*通信作者：張景勍（1973—），女，重慶人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事藥物新劑型與新技術(shù)研究工作。

E-mail：zjqrae01@163.com

晏子俊，李萬(wàn)玉，李瑤，等.天門冬酰胺酶納米囊的藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（05）：461-465.