朱利娟，胡 蝶， 儲亞琴，臧 嘉， 余 濤， 鄔敏辰*

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

多酶偶聯(lián)催化制備手性化合物（S）-環(huán)氧苯乙烷

朱利娟1，胡 蝶2， 儲亞琴3，臧 嘉2， 余 濤1， 鄔敏辰*3

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

在水/有機兩相中將羰基還原酶SyS1、葡萄糖1-脫氫酶SyGDH和鹵代醇脫鹵酶C SyHheC偶聯(lián)催化α-溴代苯乙酮以高效制備（S）-環(huán)氧苯乙烷（SO）。第1步反應(yīng)催化α-溴代苯乙酮不對稱還原為（S）-2-溴-1-苯基乙醇（（S）-BPE）及NADPH的原位再生，其優(yōu)化的反應(yīng)條件：100mmol/L磷酸鉀緩沖液 （pH 8.0）/正己烷 （V∶V=4∶6）、40mmol/Lα-溴代苯乙酮、80mmol/ LD-葡萄糖、0.2mmol/L NADP+和70mg/mL E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體（共表達SyGDH和SyS1），終體積1.0 mL，35℃反應(yīng)8 h。第2步反應(yīng)催化（S）-BPE脫鹵閉環(huán)為（S）-SO，其反應(yīng)條件：在上述反應(yīng)體系中加入磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）和0.3 U SyHheC，終體積2.0 mL，35℃反應(yīng)30 min。通過連續(xù)2步酶催化反應(yīng)，終產(chǎn)物（S）-SO的摩爾產(chǎn)率為99%、對映體過量值＞99%。

多酶偶聯(lián)；（S）-環(huán)氧苯乙烷；水/有機兩相；不對稱還原；脫鹵閉環(huán)

對映純環(huán)氧化物是一類高附加值的手性合成子或砌塊，被廣泛應(yīng)用于藥物、精細化學(xué)品、農(nóng)藥和功能性材料等的合成[1]。如（S）-環(huán)氧苯乙烷（styrene oxide，SO）可用于合成α1-、β2-和β3-腎上腺素能受體激動劑[2]、抗癌藥物左咪唑[3]、抗艾滋病藥物（-）-hyperolactone C和殺蟲劑硫磷嗪等[4-5]。（R）-或（S）-SO的制備有化學(xué)法和生物法，每種方法又分為合成法和拆分法?；瘜W(xué)合成或拆分法需使用較昂貴的金屬催化劑，且存在摩爾產(chǎn)率和對映體過量（enantiomeric excess，e.e.）值低以及環(huán)境污染大等缺陷，從而限制了其工業(yè)化應(yīng)用[2，6]。迄今為止，已有較多采用生物拆分法制備（S）-SO的報道，但從外消旋體（R，S）-SO中獲得某種對映異構(gòu)體的最大或理論摩爾產(chǎn)率僅為50%[5]。近年來，采用生物合成法制備手性環(huán)氧化物已成為研究熱點。Schrittwieser等[7]將短乳桿菌 （Lactobacillus brevis）醇脫氫酶LBADH偶聯(lián)分支桿菌 （Mycobacterium sp.GP1）鹵代醇脫鹵酶HheB催化α-氯代苯乙酮制備（S）-SO，其產(chǎn)率為84%、e.e.值＞99%。在現(xiàn)有報道中多以α-氯代苯乙酮為底物制備（S）-SO[8-9]，而以α-溴代苯乙酮為底物的報道極少，其原因主要是后者在水中易分解[10]。另外，α-溴代與α-氯代苯乙醇相比，溴基團比氯基團更易被氨基或其它親核試劑取代，也更易形成環(huán)氧化物[11]。故采用α-溴代苯乙酮為底物更具挑戰(zhàn)性和應(yīng)用價值。本研究中擬采用水/有機兩相取代純水相，探討多酶偶聯(lián)催化α-溴代苯乙酮制備（S）-SO的可行性。

作者所在實驗室分別人工合成了SyS1、SyGDH和SyHheC基因Sys1、Sygdh和SyhheC，并將它們在大腸桿菌中進行了表達[12-13]。為了高效制備（S）-SO，本研究中設(shè)計一種在水/有機兩相體系中多酶偶聯(lián)催化的方案（見圖1）。在第1步反應(yīng)中，SyS1催化α-溴代苯乙酮不對稱還原為 （S）-BPE，并借助SyGDH實現(xiàn)NADPH的原位再生。在第2步反應(yīng)中，SyHheC催化（S）-BPE脫鹵閉環(huán)為（S）-SO。同時，對影響（S）-BPE和（S）-SO摩爾產(chǎn)率的主要因素（如溫度、有機溶劑、pH值、底物濃度和濕菌體劑量等）進行優(yōu)化。

圖1 多酶偶聯(lián)催化α-溴代苯乙酮制備（S）-SO流程Fig.1 Flow chart of multi-enzyme cascade catalysis for the preparation of （S） -SO from α -bromoacetophenone

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

共表達SyGDH和SyS1（SyGDH/SyS1）的E.coli/ Sygdh-Sys1菌株及單表達SyHheC的E.coli/SyhheC菌株，由作者所在實驗室構(gòu)建和保藏。LB培養(yǎng)基（w/ v）：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和 10 g/L NaCl（固體培養(yǎng)基添加18 g/L瓊脂粉），pH 7.2。

1.2 主要試劑和儀器

NADPH和NADP+，購自上海源葉公司；4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE），購自北京百靈威公司；α-溴代苯乙酮、（R）-和 （S）-BPE，購自上海安耐吉公司；（R，S）-和（S）-SO，購自上海薩恩公司；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。GC-2010氣相色譜儀，日本Shimadzu公司產(chǎn)品；手性氣相色譜柱（CP-Chirasil-DEX CB，25 m×0.25 mm×0.25μm），美國Agilent公司產(chǎn)品。

1.3 SyGDH/SyS1和SyHheC的表達

將E.coli/Sygdh-Sys1和E.coli/SyhheC菌株分別接種于含終質(zhì)量濃度為100μg/mL氨芐青霉素和卡那霉素的2 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜；再分別以2mL/dL轉(zhuǎn)接入30mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約為0.8時，加入IPTG至終摩爾濃度0.6mmol/L，26℃誘導(dǎo)表達12 h。離心收集菌體，用6mL磷酸鉀緩沖液 （20mmol/L，pH 7.5）懸浮，冰浴超聲波破細胞，上清液作為SyGDH/SyS1和SyHheC酶液。

1.4 分析方法

1.4.1 酶活性的測定 SyS1活性測定參照文獻[13]并略作修改。酶催化反應(yīng)體系：100mmol/L磷酸鉀緩沖液 （pH 7.0）、2 mmol/L COBE、0.2 mmol/L NADPH及適量SyGDH/SyS1酶液，終體積220μL，35℃反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀測定OD340降低值。SyGDH活性測定參照文獻[12]。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘氧化1μmol NADPH（SyS1）或還原1μmol NADP+（SyGDH）所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

SyHheC活性測定參照文獻[15]并略作修改。在1.5 mL EP管A和B中各加入20μL 200 mmol/L（R，S）-SO溶液、330μL 100mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 8.0）和50μL 600 mmol/L NaNO2，35℃預(yù)熱5min；在A和B管中分別加入100μL SyHheC酶液和磷酸鉀緩沖液，35℃反應(yīng)10min；立即各加入50μL 50 mmol/L對硝基芐基吡啶，80℃保溫10 min；迅速冷卻至室溫，各加入500μL體積分數(shù)50%三乙胺顯色，用酶標(biāo)儀測定OD595值。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解1μmol（R，S）-SO所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

1.4.2 溫度對SyS1催化效率的影響 在20～50℃下，按1.4.1方法測定SyS1活性，最高反應(yīng)速率以相對酶活性100%計。將SyGDH/SyS1酶液置于25、35℃和40℃下處理6 h，每隔1 h取樣，按1.4.1方法測定SyS1殘余活性，未處理酶液的酶活性以100%計。當(dāng)殘余酶活性大于80%，即定義為熱穩(wěn)定。

1.4.3 酶對有機溶劑的耐受性 將SyGDH/SyS1和SyHheC酶液分別與各種有機溶劑按等體積混合，35℃、150 r/min處理1 h，離心取下層水相，按1.4.1方法測定殘余酶活性，未處理酶液的酶活性以100%計。當(dāng)殘余酶活性在80%以上，表明有機溶劑對酶活性影響不顯著。

1.4.4 氣相色譜分析 酶催化反應(yīng)液加入等體積乙酸丁酯（含1 mL/L正己醇作內(nèi)標(biāo)），混勻，8 000 r/ min離心，吸取600μL上層有機相，無水硫酸鎂干燥，過0.22μm有機膜。樣品分析采用GC-2010氣相色譜儀、CP-Chirasil-DEX CB手性氣相色譜柱和氫火焰離子檢測器（FID）。參數(shù)設(shè)置：進樣口和檢測器溫度均為220℃；色譜柱溫度自100℃以10℃/ min升溫至200℃；載氣為氮氣，流量3.0 mL/min，分流比1∶39。（R）-和（S）-SO、α-溴代苯乙酮、（S）-和（R）-BPE的保留時間分別為3.536、3.631、7.415、8.608min和8.728min。

其中，S和R分別代表（S）-和（R）-BPE或（S）-和（R）-SO的最終摩爾濃度，B0代表α-溴代苯乙酮的初始摩爾濃度。

1.5 多酶偶聯(lián)催化制備（S）-環(huán)氧苯乙烷

1.5.1 不對稱還原反應(yīng)的初始條件 100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）/正己烷（v/v=4∶6）、20mmol/L α-溴代苯乙酮、80 mmol/LD-葡萄糖、0.2 mmol/L NADP+和60mg/mL E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體（共表達SyGDH和SyS1），終體積1.0mL，35℃、150 r/min反應(yīng)10 h。

1.5.2 不對稱還原反應(yīng)條件的優(yōu)化 基于α-溴代苯乙酮不對稱還原反應(yīng)的初始條件，采用單因素試驗擬對主要因素 （pH值、底物濃度、E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體劑量和反應(yīng)時間）進行優(yōu)化。酶催化反應(yīng)液按1.4.4方法分析，以（S）-BPE摩爾產(chǎn)率為指標(biāo)。

1.5.3 脫鹵閉環(huán)反應(yīng)的條件 在上述優(yōu)化的反應(yīng)體系中添加磷酸鉀緩沖液 （pH 8.0）和0.3 U SyHheC，終體積2.0 mL，35℃反應(yīng)40min。酶催化反應(yīng)液按1.4.4方法分析，以（S）-SO摩爾產(chǎn)率為指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對多酶偶聯(lián)催化效率的影響

溫度對酶催化反應(yīng)具有雙重作用，溫度升高可加快酶催化反應(yīng)速率，但溫度過高又會引起酶蛋白變性失活。因此，在某一溫度下多酶偶聯(lián)催化效率的高低取決于各種酶在該溫度下催化反應(yīng)速率和熱穩(wěn)定性的綜合平衡因素。按1.4.2方法分析了溫度對SyS1催化效率的影響（見圖2）。由圖2（a）可見，SyS1在35～45℃范圍內(nèi)具有較高的催化反應(yīng)速率。由圖2（b）可見，SyS1在35℃及其以下較穩(wěn)定（殘余酶活性＞80%）。另據(jù)報道，SyGDH和SyHheC的催化反應(yīng)速率分別在30～50℃和35～50℃范圍內(nèi)較高，且兩種酶均在55℃及其以下（熱處理1 h）穩(wěn)定[12-13]。綜合考慮SyS1、SyGDH和SyHheC的催化反應(yīng)速率和熱穩(wěn)定性，選擇在35℃進行多酶偶聯(lián)催化，包括α-溴代苯乙酮不對稱還原及（S）-BPE脫鹵閉環(huán)。

圖2 溫度對SyS1催化效率的影響Fig.2 Effect of temperatures on the catalytic efficiencyofSyS1

2.2 水/有機兩相中有機溶劑的選擇

據(jù)文獻報道，與α-氯代苯乙酮不同，α-溴代苯乙酮在純水相中不穩(wěn)定，能自發(fā)產(chǎn)生1-苯基-1，2-二醇和苯基乙醇等副產(chǎn)物[10]，故在純水相中催化α-溴代苯乙酮不對稱還原所獲產(chǎn)物的純度低。因此，選擇合適的有機溶劑組成水/有機兩相，是提高底物穩(wěn)定性和產(chǎn)物純度的關(guān)鍵。本研究中選取乙酸乙酯等6種常見的非極性有機溶劑與SyGDH/SyS1或SyHheC酶液等體積混合，分析有機溶劑對酶活性的影響（見圖3）。由圖3可見：乙酸乙酯、乙酸丁酯和甲基叔丁醚顯著能使SyS1變性失活 （殘余酶活性＜20%）；正辛烷使SyHheC的殘余酶活性＜30%；正已烷和環(huán)己烷對SyS1和SyHheC活性的影響較小；SyGDH對6種有機溶劑均有較強的耐受性 （殘余酶活性＞70%）。綜合考慮不同有機溶劑對3種酶的影響程度，選擇正己烷組成水/有機兩相（酶活性＞80%）作為多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)的有機相。

不同配比的水/有機兩相對產(chǎn)物的回收率和酶的催化效率都有一定的影響。提高有機溶劑的比例，可以提高底物的穩(wěn)定性和產(chǎn)物的回收率，但高濃度的有機溶劑對細胞有毒害作用，影響酶活性從而導(dǎo)致產(chǎn)率下降[12]。實驗結(jié)果表明當(dāng)緩沖液/正己烷體積比在4∶6以下，產(chǎn)物的摩爾產(chǎn)率均＞95%。綜合考慮產(chǎn)物的回收率和酶的催化效率（為第2步脫鹵閉環(huán)反應(yīng)奠定基礎(chǔ)），因而選擇緩沖液/正己烷的體積配比為4∶6。

圖3 各種有機溶劑對酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of organic solvents on the enzyme stabilities

2.3 不對稱還原反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 底物濃度的影響 在35℃、緩沖液/正己烷體積比為4∶6的條件下，考察了不同初始摩爾濃度（10～60mmol/L）的底物α-溴代苯乙酮對不對稱還原反應(yīng)的影響（見圖4），結(jié)果表明，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?0 mmol/L以下，（S）-BPE摩爾產(chǎn)率均能達到95%以上（e.e.值＞99%）；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0 mmol/L時，摩爾產(chǎn)率下降較快，一方面可能是底物對酶的抑制作用，另一方面也可能是酶的催化中心達到飽和狀態(tài)。最終催化反應(yīng)底物的初始濃度定為40mmol/L。

2.3.2 pH值的影響 反應(yīng)體系的pH值通過影響酶活性中心氨基酸的解離狀態(tài)，從而影響酶活性及催化效率。在上述條件（底物濃度40mmol/L，35℃，緩沖液/正己烷體積比為4∶6）下，考察了不同pH（100 mmol/L，4.0～12.0）對反應(yīng)的影響（見圖5）。結(jié)果表明，在pH＜6.0和＞9.0時，（S）-BPE摩爾產(chǎn)率降低較快；在pH 6.0～9.0，摩爾產(chǎn)率＞95%，e.e.值＞99%且保持不變。同時根據(jù)文獻[13]研究，SyHheC參與的第二步脫鹵閉環(huán)反應(yīng)的最適pH范圍是8.0～10.0，最終選定催化反應(yīng)的pH為8.0。

圖4 底物摩爾濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig. 4 Effect of substrate concentrationson the asymmetric reduction reaction

2.3.3 濕菌體劑量的影響 在上述優(yōu)化的條件（底物濃度40mmol/L，35℃，緩沖液/正己烷體積比為4∶6，pH 8.0）下，考察不同質(zhì)量濃度（50～100 mg/mL）的E.coli/Sygdh-Sys1濕菌體對反應(yīng)的影響 （見圖6），結(jié)果表明，菌體質(zhì)量濃度在50～70 mg/mL時，（S）-BPE摩爾產(chǎn)率隨菌體質(zhì)量濃度的增大而增大；在70mg/mL時，摩爾產(chǎn)率達到最大值99.1%。當(dāng)菌體質(zhì)量濃度大于70mg/mL時，產(chǎn)率反而下降，原因可能是在一定范圍內(nèi)，催化體系中結(jié)合底物的酶分子活性位點隨菌體濃度的增大而增大，但菌體濃度過多增大了反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力使得底物分子與酶分子不能充分接觸而降低催化效率，綜合考慮選定濕菌體劑量為70mg/mL。

2.4 多酶偶聯(lián)催化體系的反應(yīng)進程

在底物α-溴代苯乙酮摩爾濃度40 mmol/L、35℃、緩沖液/正己烷體積比為4∶6、pH 8.0、E.coli/ Sygdh-Sys1濕菌體質(zhì)量濃度為70mg/mL的條件下，第1步不對稱還原反應(yīng)的進程如圖7（a）所示，中間產(chǎn)物（S）-BPE在反應(yīng)2 h內(nèi)生成的速度較快；2～8 h內(nèi)放緩，可能是隨著反應(yīng)的進行酶活性不斷下降，且產(chǎn)物的積累對酶活性也有一定的抑制作用。8 h時摩爾產(chǎn)率達到99.1%，e.e.值＞99%。隨后，SyHheC催化中間產(chǎn)物 （S）-BPE進行脫鹵閉環(huán)合成終產(chǎn)物（S）-SO，第2步脫鹵閉環(huán)反應(yīng)進程如圖7（b）所示，在20min內(nèi)（S）-SO迅速積累，30min時（S）-SO的摩爾產(chǎn)率可達99%且e.e.值一直保持在99%以上。

圖6 菌體質(zhì)量濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of cell concentrations on the asymmetric reduction reaction

圖7 多酶偶聯(lián)催化體系的反應(yīng)進程Fig.7 Reactioncourses of the multi-enzyme cascade catalysis

3 結(jié)語

本文作者在SyGDH催化葡萄糖提供輔酶循環(huán)的基礎(chǔ)上，于水/有機兩相中將SyS1和SyHheC偶聯(lián)催化α-溴代苯乙酮合成重要的手性藥物中間體（S）-SO，并對其第1步不對稱還原反應(yīng)的條件進行了優(yōu)化，較Ren等[11]報道的底物濃度提高2.4倍、時間縮短6 h。研究表明在優(yōu)化的催化反應(yīng)條件下反應(yīng)8 h后，添加0.3 U SyHheC，35℃反應(yīng)30min后可得到終產(chǎn)物（S）-SO的摩爾產(chǎn)率達99%且e.e.值＞99%。實驗結(jié)果說明所設(shè)計的水/有機兩相中多酶偶聯(lián)催化的體系可以將前手性酮轉(zhuǎn)化為光學(xué)純的藥物中間體，具有原料經(jīng)濟，過程方便易行，產(chǎn)物摩爾產(chǎn)率大、高e.e.值等優(yōu)點，具有很大的應(yīng)用價值，本研究也為多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)體系合成手性藥物中間體奠定了良好的基礎(chǔ)。另外，多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)體系中第1步不對稱還原反應(yīng)的催化時間（8 h）是第2步脫鹵閉環(huán)反應(yīng)（30 min）的16倍，下一步可以考慮通過理性改造SyS1以解除第1步限速反應(yīng)，達到提高（S）-SO生產(chǎn)效率的目的。

[1]CHOIW J.Biotechnologicalproduction of enantiopureepoxidesby enzymatic kinetic resolution[J].Applied M icrobiology and Biotechnology，2009，84（2）：239-247.

[2]HAMADA T，TORIIT，IZAWA K，et al.Practical synthesis of optically active styrene oxides via reductive transformation of 2-chloroacetophenonesw ith chiral rhodium catalysts[J].Organic Letters，2002，4（24）：4373-4376.

[3]MOERTELC G，F(xiàn)LEM ING TR，MACDONALD JS，etal.Levamisole and fluorouracil for adjuvant therapy of resected colon carcinoma[J].The New England Journal of M edicine，1990，322（6）：352-358.

[4]HODGSON DM，MAN S.Synthesisof the anti-HIV agent（-）-hyperolactone C by using oxonium ylide formation rearrangement [J].Chem istry：A European Journal，2011，17（35）：9731-9737.

[5]WU S，LIA，CHIN Y S，et al.Enantioselective hydrolysis of racemic and meso-epoxides w ith recombinant Escherichia coli expressing epoxide hydrolase from Sphingomonas sp.HXN-200：preparation of epoxides and vicinal diols in high ee and high concentration[J].ACSCatalysis，2013，3（4）：752-759.

[6]KLUNDER J M，KO S Y，SHARPLESS K B.Asymmetric epoxidation of allyl alcohol：efficient routes to homochiral β-adrenergic blocking agents[J].Journal of Organic Chem istry，1986，51（19）：3710-3712.

[7]SCHRITTWIESER J H，LAVANDERA I，SEISSER B，et al.Shifting the equilibrium of a biocatalytic cascade synthesis to enantiopureepoxidesusing anion exchangers[J].Tetrahedron：Asymmetry，2009，20（4）：483-488.

[8]SEISSER B，LAVANDERA I，F(xiàn)ABER K，etal.Stereo-complementary two-step cascades using a two-enzyme system leading to enantiopure epoxides[J].Advanced Synthesis&Catalysis，2007，349（8/9）：1399-1404.

[9]CHEN S Y，YANG C X，WU JP，et al.Multi-enzymatic biosynthesis of chiralβ-hydroxy nitriles through co-expression of oxidoreductase and halohydrin dehalogenase[J].Advanced Synthesis&Catalysis，2013，355（16）：3179-3190.

[10]ROCHA L C，F(xiàn)ERREIRA H V，PIMENTA E F，et al.Biotransformation ofα-bromoacetophenones by the marine fungus Aspergillus sydowii[J].M arine Biotechnology，2010，12（5）：552-557.

[11]REN J，DONG W Y，YU B Q，et al.Synthesis of optically activeα-bromohydrins via reduction ofα-bromoacetophenone analogues catalyzed by an isolated carbonyl reductase[J].Tetrahedron：Asymmetry，2012，23（6）：497-500.

[12]YU Tao，HU Die，WU M inchen，et al.Enzymatic characterization and coenzyme regeneration of a recombinant glucose 1-dehydrogenase[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（9）：910-916.（in Chinese）

[13]馮峰.鹵代醇脫鹵酶SyHheC的基因克隆、表達及應(yīng)用研究[D].無錫：江南大學(xué)，2014.

[14]宿宇寧.雙酶共表達重組菌不對稱還原制備光學(xué)純（R）-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[D].無錫：江南大學(xué)，2013.

[15]TANG Yanfa，XU Jianhe，YEQin.A spectrophotometric assay for determination ofepoxide concentration and epoxide hydrolase activity[J].Journal of Analytical Science，2002，18（2）：142-144.（in Chinese）

M ulti-Enzyme Cascade Catalysis for the Preparation of Chiral Com pound（S）-Styrene Oxide

ZHU Lijuan1， HU Die2， CHU Yaqin3， ZANG Jia2， YU Tao1， WUMinchen*3
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；3.WuxiMedical School，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

In an aqueous/organic two-phase，cascade catalysis was carried out for the efficient preparation of（S）-styrene oxide（SO）by a combination of carbonyl reductase（SyS1），glucose 1-dehydrogenase （SyGDH）and halohydrin dehalogenase C （SyHheC）.The firststep was to asymmetrically reduceα-bromoacetophenone into（S）-2-bromo-1-phenylethanol（（S）-BPE）and to regenerate NADPH in situ.The optim ized conditionswere 100mmol/L potassium phosphate buffer（pH 8.0）/n-hexane（v∶v=4∶6），40mmol/Lα-bromoacetophenone，80mmol/LD-glucose，0.2mmol/L NADP+and 70mg/m L wet E.coli/Sygdh-Sys1 cells（co-expressing both SyGDH and SyS1）in a volume of1.0m L at35℃for8 h.The second step was dehalogenation ring-closure of（S）-BPE into（S）-SO by adding potassium phosphate buffer（pH 8.0）and 0.3 U SyHheC into the above reactionsystem，in a volume of2.0m L，at35℃for 30m in.Through two stepsof enzyme catalysis，the final product（S）-SO was obtained w ith amolar yield of 99%and an enantiomeric excess valuemore than 99%.

multi-enzyme cascade，（S）-styrene oxide，aqueous/organic two-phase，asymmetric reduction，dehalogenation ring-closure

Q 814.9

A

1673—1689（2017）05—0473—06

2015-06-03

國家自然科學(xué)基金項目（31271811）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目（SJLX-0529）。

*通信作者：鄔敏辰（1962—），男，江蘇無錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。

E-mail：bioch@163.com

朱利娟，胡蝶，儲亞琴，等.多酶偶聯(lián)催化制備手性化合物（S）-環(huán)氧苯乙烷[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（05）：473-478.