慕亞南， 成小英

（江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

自然水體生物膜胞外聚合物的提取及優(yōu)化

慕亞南， 成小英*

（江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

以自然水體生物膜為研究對象，蛋白質(zhì)和多糖的提取量作為生物膜胞外聚合物（EPS）提取總量的衡量指標(biāo)，核酸含量用于表征細(xì)胞破裂程度，本文作者以高速離心法為對照，分別研究了加熱法、EDTA法、NaOH+NaCl法和超聲+CER法對自然水體生物膜胞外聚合物的提取效果，從而確定自然水體生物膜最適提取方法并對實驗條件進(jìn)行優(yōu)化。研究結(jié)果表明，NaOH+NaCl法因提取胞外聚合物總量高，核酸含量較少為最適提取方法。在NaOH濃度為2mol/L，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%，萃取2.5 h，分離轉(zhuǎn)速為7 000 g條件下，EPS提取量為157.57mg/L。

自然水體生物膜；胞外聚合物；提取

近年來，我國河流污染嚴(yán)重，導(dǎo)致河流生態(tài)系統(tǒng)退化和水質(zhì)惡化，其中重金屬污染占據(jù)了較大比重[1]。自然水體生物膜是河流中相對穩(wěn)定存在的微生物群落結(jié)構(gòu)[2]，對水體重金屬、有機物和營養(yǎng)物質(zhì)等的富集和遷移發(fā)揮著巨大作用[3]。大量研究表明，胞外聚合物 （EPS）對重金屬離子具有很強吸附能力，例如Liu等[4]研究EPS對Zn2+、Cu2+和Cr3+的去除效果，其去除率都達(dá)到95%以上；杜偉等[5]研究了EPS對Cu2+、Cr3+和Ni2+的吸附效果，結(jié)果表明EPS對3種重金屬離子的最大吸附容量分別為0.81、0.62、0.50mg/g EPS。國內(nèi)外對EPS吸附重金屬離子的吸附研究較多，但重金屬離子對EPS的組分、形態(tài)結(jié)構(gòu)等的影響有待進(jìn)一步研究，高效提取EPS是進(jìn)一步研究EPS作用和性質(zhì)的前提。

目前的EPS提取中，多以活性污泥為研究對象，陽離子交換樹脂法（CER）因其具有提取效率高、化學(xué)污染小、細(xì)胞破損量小以及操作方便的優(yōu)點得到普遍認(rèn)同[6-8]。自然水體生物膜是一種穩(wěn)定的、復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，微生物種類繁多，與活性污泥相比，其生長環(huán)境中營養(yǎng)程度較低，促使微生物分泌更多的EPS[9]，故提取EPS的方法不能完全參照活性污泥來進(jìn)行。曹勇等[10]對自然水體生物膜胞外聚合物提取方法進(jìn)行對比，結(jié)果表明NaOH法提取效果優(yōu)于清水法、超聲波法、K2HPO4法和EDTA法，但DNA含量占提取物總量的22.27%，細(xì)胞破裂程度較大。自然水體生物膜EPS的提取方法尚未統(tǒng)一，不同的提取方法和操作條件對EPS的提取效果有很大的影響[11-13]，為了最大程度提取EPS并盡可能減少細(xì)胞破裂和溶解，本研究選取高速離心法、加熱法、EDTA法、NaOH+NaCl法和超聲+CER法提取自然水體生物膜EPS并對提取效果進(jìn)行比較，進(jìn)而選取自然水體生物膜EPS最適提取方法并優(yōu)化其提取條件，以期提供一種有效的、全面的EPS提取方法，為EPS的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗選取生物膜由江南大學(xué)校內(nèi)小蠡湖中培養(yǎng)所得。培養(yǎng)期間水質(zhì)情況如表1所示（n=10）：

表1 生物膜生長期間河水水質(zhì)特征（±s）Table 1 W ater quality during the grow th of biofilm s

表1 生物膜生長期間河水水質(zhì)特征（±s）Table 1 W ater quality during the grow th of biofilm s

水溫/℃D O / ( m g / L ) p H C O DMn/ ( m g / L ) T N / ( m g / L ) T P / ( m g / L ) 1 9 . 4 2 ± 1 . 5 2葉綠素/ ( m g / m3) 6 . 5 6 ± 0 . 8 7 6 . 8 5 ± 0 . 5 6 8 . 1 3 ± 0 . 9 1 1 . 7 4 ± 0 . 7 9 0 . 0 5 ± 0 . 0 4 1 2 . 1 4 ± 2 . 7 5

1.2 實驗方法

1.2.1 生物膜的培養(yǎng) 采用載玻片 （25.4mm×76.2 mm×1mm）[14-16]作為自然水體中微生物掛膜的載體，改進(jìn)后的玻載生物膜培養(yǎng)裝置為實驗裝置，如圖1。載玻片用李魚等[17]的方法進(jìn)行預(yù)處理，之后將干凈的載玻片固定于玻載生物膜裝置上，垂直置于水面表層30 cm處進(jìn)行生物膜培養(yǎng)。取附著有成熟生物膜的載玻片，將生物膜刮入研缽中，加少量去離子水研磨，定容后將生物膜樣品放入磁力攪拌器中混勻，待用。

1.2.2 自然水體生物膜EPS提取方法篩選 以高速離心法[18]為對照，分別采用加熱法[19]、EDTA法[20]、 NaOH+NaCl法[21]和超聲+CER法[15]來提取自然水體生物膜胞外聚合物，其中包括了物理法、化學(xué)法和物理-化學(xué)法3大類提取方法。具體操作步驟如表2所示。

圖1 生物膜培養(yǎng)裝置Fig.1 Culturing device of biofilm s

表2 5種EPS提取方法的操作步驟Table 2 Procedures for five EPS extraction methods

1.3 分析方法

EPS的提取量用多糖與蛋白質(zhì)總和來表征，提取過程中細(xì)胞破壞程度用DNA含量來表征。其中多糖采用蒽酮法測定[28]，蛋白質(zhì)采用考馬斯亮蘭G-250法測定[29]，DNA含量采用二苯胺法[25]測定。

將冷凍干燥的EPS樣品與KBr按質(zhì)量比1∶100混合，壓制成薄片，采用傅里葉紅外光譜分析儀（Thermo IS10）進(jìn)行掃描測試其主要官能團，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種提取方法的結(jié)果比較和分析

多糖和蛋白質(zhì)是EPS的主要成分，以多糖和蛋白質(zhì)含量總和來反應(yīng)胞外聚合物提取方法的有效性，通過測定DNA的含量來比較各種提取方法對細(xì)胞的破裂程度，實驗結(jié)果為3次測定結(jié)果的平均值（見表3）。

表3 5種不同方法的EPS提取效果Table 3 Contents of EPS by five extraction methods

由表3可知，5種方法對EPS總量的提取效果：NaOH+NaCl法＞超聲+CER法＞加熱法＞EDTA法＞高速離心法；DNA質(zhì)量濃度：加熱法＞EDTA法＞超聲+ CER法＞NaOH+NaCl法＞高速離心法。不同的提取方法對EPS的提取效果有很大影響，高速離心法提取步驟溫和，無大量細(xì)胞自溶現(xiàn)象產(chǎn)生，結(jié)果能較好的反應(yīng)生物膜中EPS的相對組成，可作為對照用以評價各種提取方法對細(xì)胞的破裂程度[18]。相比于高速離心法，其他4種方法對EPS的提取效果都有一定程度的提高，說明自然生物膜EPS與細(xì)胞結(jié)合較為緊密，僅通過高速離心法不能有效地提取EPS，需要進(jìn)一步借助化學(xué)或物理-化學(xué)法來提高自然生物膜 EPS的溶解性。高速離心法、EDTA法和NaOH+NaCl法中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)皆超過50%，說明該生物膜EPS中蛋白質(zhì)為主要成分，這與已有報道中的研究結(jié)果一致[23]。

比較不同提取方法的提取效果及對生物膜細(xì)胞的破裂程度，NaOH+NaCl法和超聲+CER法提取效果較好且DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)都＜6%。但兩種提取方法中蛋白質(zhì)/多糖差異明顯，分別為4.37和0.88。一方面可能由于CER法提取EPS時，蛋白質(zhì)是最難被提取的物質(zhì)，因提取時間過短，致使蛋白質(zhì)未被提取完全[30-31]；另一方面表明NaOH的加入對于提取EPS中的蛋白質(zhì)有較好的效果。

與其他提取方法相比，加熱法和EDTA法提取的EPS中DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（＞15%），說明加熱法和EDTA法對細(xì)胞的破裂程度較大，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放，另外提取過程中甲醛和EDTA的存在對DNA質(zhì)量濃度的測定值有一定影響[32]。與其他方法提取效果相比，加熱法提取的EPS中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度偏低，可能是由于糖類物質(zhì)及核酸熱穩(wěn)定性相對較強，而蛋白質(zhì)在熱處理過程中則隨著作用時間的增加會部分凝固變性，質(zhì)量濃度降低[33]。EDTA法提取效率較低，僅高于對照組，這可能是由于EDTA在使EPS游離進(jìn)入液相的同時，與EPS的部分大分子相結(jié)合，使測量值偏低[34]。

綜上所述，NaOH+NaCl法提取EPS質(zhì)量濃度最高，且DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%以內(nèi)，表明該方法沒有引起嚴(yán)重的細(xì)胞裂解[35]。為獲取大量的EPS，選取NaOH+NaCl法作為自然水體生物膜胞外聚合物的提取方法。

2.2 NaOH+NaCl法提取胞外聚合物條件的優(yōu)化

操作條件的不同對EPS的提取效果有很大影響。以1 mo1/L NaOH，萃取3 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%NaCl，6 000 g 4℃條件下離心20 min為參考，探究不同的萃取劑濃度、萃取時間及離心力對NaOH+NaCl法提取自然水體生物膜EPS效果的影響，從而選出最適宜的萃取條件。

2.2.1 NaOH溶液濃度對EPS提取效果的影響 分別選取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mol/L的NaOH溶液作為萃取劑，萃取3 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85% NaCl，6 000 g、4℃條件下離心20min提取EPS。測定不同濃度的萃取劑對EPS提取效果的影響（見圖2）。

圖2 NaOH溶液濃度對EPS提取效果的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the extraction of EPS

由圖2可知，NaOH濃度極大的影響著EPS組分。隨著NaOH濃度增大，蛋白質(zhì)、多糖、DNA的質(zhì)量濃度均隨之增大，其中蛋白質(zhì)含量增幅最明顯。當(dāng)NaOH濃度大于2 mol/L后，DNA質(zhì)量濃度大幅增加，表明過高的NaOH濃度對生物膜的細(xì)胞破壞較為嚴(yán)重。因此，為降低細(xì)胞的破碎程度，選擇NaOH溶液摩爾濃度為2mol/L。

2.2.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對EPS提取效果的影響 以2 mol/L NaOH為萃取劑，萃取3 h，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55%、0.65%、0.75%、0.85%、0.95%、1.05%的NaCl溶液，6 000 g、4℃條件下離心20 min提取EPS，測定NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對EPS提取效果的影響（見圖3）。

圖3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對EPS提取效果的影響Fig.3 Effect of NaCl mass fraction on the extraction of EPS

由圖3可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對EPS的提取影響不大。NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.55%～0.95%時，DNA質(zhì)量濃度增加幅度不明顯，而大于0.95%時，DNA質(zhì)量濃度明顯增加。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%時，EPS總量達(dá)到最大，故最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取0.85%。

2.2.3 萃取時間對EPS提取效果的影響 選取2mol/LNaOH，分別萃取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%NaCl，6 000 g、4℃條件下離心20min提取EPS，測定不同萃取時間對EPS提取效果的影響（見圖4）。

圖4 萃取時間對EPS提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on the content of EPS

由圖4可知，在萃取時間≤2.5 h時，蛋白質(zhì)和多糖質(zhì)量濃度隨著時間的延長增大，DNA質(zhì)量濃度無明顯增加，當(dāng)萃取時間＞2.5 h時，DNA質(zhì)量濃度增幅明顯。因此，確定2.5 h為最佳適萃取時間。

2.2.4 離心力對EPS提取效果的影響 選取2mol/L NaOH，萃取3 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%NaCl，分別設(shè)定離心力為 4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、10 000 g，4℃條件下離心20 min提取EPS，測定不同離心力對EPS提取效果的影響（見圖5）。

由圖5可知，隨著離心力的增加，蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量濃度成緩慢上升趨勢，當(dāng)離心力達(dá)到7 000 g時，隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)和多糖增加趨于平緩，離心力的增加不再分離出更多的蛋白質(zhì)和多糖，但DNA質(zhì)量濃度與之前相比增加顯著。從細(xì)胞破碎小方面考慮，7 000 g為最適萃取離心力。

在 NaOH濃度為 2 mol/L，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%，萃取2.5 h，分離轉(zhuǎn)速為7 000 g條件下，NaOH+NaCl法提取效果最佳，EPS提取量為157.57mg/L。與文獻(xiàn)中提取條件不同的原因可能是生物膜生長環(huán)境（如微生物種類、營養(yǎng)水平和水溫等）的不同，致使EPS成分有所差異，提取操作條件也有所不同。與人工配水相比，自然水體中微生物種類繁多，主要有細(xì)菌、原生動物、真菌和藻類，分泌的EPS更為豐富；因自然水體中的營養(yǎng)物質(zhì)含量較低，當(dāng)微生物生長需求的不能被滿足時，微生物將優(yōu)先利用EPS中的多糖將作為能源物質(zhì)用以維持自身正常的生命活動，致使蛋白質(zhì)/多糖比值增大。與多糖相比，EPS中蛋白質(zhì)較難被提取，提高NaOH濃度有利于蛋白質(zhì)的提取，提高EPS的提取量。隨著NaOH濃度的增加，在較短的時間內(nèi)可使大部分EPS與微生物分離，萃取時間＞2.5 h時，DNA含量大幅增加，可能是NaOH直接作用于細(xì)胞壁所導(dǎo)致。經(jīng)過NaOH的萃取后，高速離心用以將胞外聚合物與細(xì)胞剝離來進(jìn)行EPS的提取，再不增大細(xì)胞裂解的前提下，離心力的增加有助于細(xì)胞的完全分離。

2.3 NaOH+NaCl法中NaCl作用探究

NaOH法對EPS提取具有效率高的特點，但對細(xì)胞破壞程度較大。目前，與NaOH法相組合的方法研究較多，如甲醛+NaOH法[25]、甲酰胺+NaOH法[36]等，甲醛、甲酰胺的加入用以固定細(xì)胞，降低NaOH對細(xì)胞的破壞。為探究NaOH+NaCl法中NaCl的作用，分別以NaOH和去離子水替代NaCl，即NaOH+ NaOH、NaOH+NaCl、NaOH+去離子水法來提取EPS。

由圖6可知，蛋白質(zhì)、多糖提取效果都符合NaOH+NaOH法＞NaOH+NaCl法＞NaOH+去離子水法；DNA質(zhì)量濃度則是NaOH+NaOH法＞NaOH+去離子水法＞NaOH+NaCl法。以NaOH代替NaCl時，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和DNA質(zhì)量濃度明顯增大，應(yīng)該是細(xì)胞發(fā)生溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外流所導(dǎo)致[37]。與加入NaOH相比，NaCl溶液和去離子水的加入對細(xì)胞破裂程度都有所緩解，加入NaCl溶液條件下細(xì)胞破裂程度最小。唐金花等[38]以去離子水、低濃度NaCl和緩沖溶液作為提取液進(jìn)行對比，結(jié)果表明低濃度NaCl溶液為提取液時細(xì)胞破裂程度最小；Fang等[39]在提取胞外有機物質(zhì)時，也加入NaCl用以維持滲透平衡和減少細(xì)胞自溶。綜上，NaOH法中加入的NaCl對細(xì)胞起到了一定的保護作用。

圖6 不同萃取劑的提取效果比較Fig.6 Effect of different extraction agents

2.4 胞外聚合物紅外光譜分析

對提取的溶解性胞外聚合物（S-EPS）和結(jié)合態(tài)胞外聚合物（B-EPS）樣品進(jìn)行紅外光譜圖分析（見圖7），表4列出了其主要官能團。由紅外光譜圖可知，S-EPS和B-EPS中含有多種官能團，其中多糖和蛋白質(zhì)是提取的EPS中兩大主要成分。S-EPS圖譜中多糖的特征峰較蛋白質(zhì)強且寬，這說明多糖與細(xì)胞結(jié)合較松散或處于細(xì)胞較外層，比蛋白質(zhì)更容易被提取[35]，要更完全的提取蛋白質(zhì)，還需借助化學(xué)法或物理-化學(xué)法；B-EPS圖譜中，蛋白質(zhì)峰明顯增強，表明NaOH的加入，有效的提取了生物膜中的蛋白質(zhì)。

圖7 紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of EPS

表4 EPS的紅外光譜圖的主要官能Table 4 M ain functional groups observed in the FTIR spectra of EPS

3 結(jié)語

自然水體生物膜廣泛存在于各類水體中，本文作者通過改進(jìn)的裝置培養(yǎng)自然水體生物膜，對比不同提取方法對自然水體生物膜EPS的提取效果。結(jié)果表明，NaOH+NaCl法＞超聲+CER法＞加熱法＞EDTA法＞高速離心法。NaOH+NaCl法提取的EPS總量分別是超聲+CER法、加熱法、EDTA法、高速離心法的1.77倍、1.85倍、2.84倍和5.75倍，同時細(xì)胞的破裂程度較小，是理想的EPS提取方法。通過對NaOH+NaCl法提取EPS進(jìn)行條件優(yōu)化并探究NaCl的作用，表明在NaOH濃度為2mol/L，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%，萃取2.5 h，分離轉(zhuǎn)速為7 000 g（4℃）條件下，EPS提取效果最佳，加入NaCl對細(xì)胞起到了一定的保護作用。NaOH+NaCl法提取的EPS紅外光譜分析可知，EPS中含有多種官能團，其中蛋白質(zhì)和多糖官能團出峰明顯，蛋白質(zhì)是自然水體生物膜的主要成分，多糖次之。

[1]CHEN Longsheng，CHEN Shijin，Xu Shuwen，et al.Environment significance and polluti on status of heavy metals in lake sediments of the m iddle and lower reaches of yangtze river[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2013，41（16）：7290-7293.（in Chinese）

[2]秦松巖.德國奧德河水中生物膜形態(tài)及其生物多樣性的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2008.

[3]LAWRENCE JR，DYNES JJ，KORBERD R，etal.Monitoring the fate of copper nanoparticles in river biofilms using scanning transm ission X-raym icroscopy（STXM）[J].Chem ical Geology，2012，329：18-25.

[4]LIU Y，LAM M C，F(xiàn)ANG H H P.Adsorption of heavymetals by EPS of activated sludge[J].W ater Science and Technology，2001，43（6）：59-66.

[5]DUWei，SUN Baosheng，LV Ying.Study on adsorption of Cu2+，Cr3+and Ni2+by EPS[J].China W ater&Wastewater，2007，23（13）：98-101.（in Chinese）

[6]DOM INGUEZ L，RODRIGUEZM，PRATSD.Effectof differentextractionmethods on bound EPS from MBR sludges.Part I：Influence of extractionmethods over three-dimensional EEM fluorescence spectroscopy fingerprint[J].Desalination，2010，261（1）：19-26.

[7]LONG Tengrui，LUO Taizhong，LONG Xiangyu，et al.Research on extraction of extracellular polymeric substances from activated sludgeby ultrasonic and cation resin[J].W ater&W astewater Engineering，2008，34（5）：34-39.（in Chinese）

[8]WANG Yi，ZHENG Shujian，PENG Dangcong.A review on extracellular polymeric substance in environmentalengineering[J]. Journal of Xi＇an University of Architecture＆Technology，2011，43（6）：854-858.（in Chinese）

[9]YAN Nengjie，XU Yanbin，DUAN Xiaojun，et al.A review on the extraction and propety analysis of extracellular polymeric substance[J].Science＆Technology Review，2009，27（0920）：106-110.（in Chinese）

[10]CAO Yong，WANG Bingling，ZHANG Yimeng，et al.Extraction of extracellular polymeric substances from biofilm and adsorptionmechanism ofheavymetals[J].Shang Hai Environmental Sciences，2013，32（4）：139-142.（in Chinese）

[11]D’ABZAC P，BORDAS F，VAN Hullebusch E，et al.Extraction of extracellular polymeric substances（EPS）from anaerobic granular sludges：comparison of chem ical and physical extraction protocols[J].App lied M icrobiology and Biotechnology，2010，85（5）：1589-1599.

[12]LIU H，F(xiàn)ANG H H P.Extraction of extracellular polymeric substances（EPS）of sludges[J].Journal of Biotechnology，2002，95（3）：249-256.

[13]CHO J，HERMANOWICZ S W，HUR J.Effects of experimental conditions on extraction yield of extracellular polymericsubstancesby cation exchange resin[J].The Scientific World Journal，2012.

[14]ZHANG Daoyong，ZHAO Yongsheng，PAN Xiangliang.The role of EPS in removing cadmium in sewage by A lgae-Bacteria biofilm[J].Research of Environmental Sciences，2004，17（5）：52-55.（in Chinese）

[15]WANG C，M IAO L，HOU J，et al.The effect of flow velocity on the distribution and composition of extracellular polymeric substances in biofilmsand the detachmentmechanism ofbiofilms[J].W ater Science＆Technology，2014，69（4）：825-832.

[16]STEWARTT J，TRABER J，KROLLA，etal.Characterization ofextracellular polymeric substances（EPS）from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection（LC-OCD-OND）[J].Environmental Science and Pollution Research，2013，20（5）：3214-3223.

[17]LIYu，ZHENG Na，DONG Dem ing，etal.Accumulation of Cd in the naturalsurface coatingsduring the development[J].Chinese Journal of Applied Chem istry，2004，21（1）：28-31.（in Chinese）

[18]LIJihong，SHAN Shiliang，LI liang，et al.Extraction of extracelluar polymeric substances from activated sludge in membrane bioreactor[J].Environmental Engineering，2013，31（3）：10-14.（in Chinese）

[19]FANG H H P，XU L C，CHAN K Y.Effects of toxicmetals and chem icals on biofilm and biocorrosion[J].W ater Research，2002，36（19）：4709-4716.

[20]BROWNM J，LESTER JN.Comparison of bacterialextracellularpolymerextractionmethods[J].App lied and Environmental M icrobiology，1980，40（2）：179-185.

[21]HU Xuewei，LIShu，RONG Ye，et al.Effect of Cu2+on biofilm and extracellular polymeric substance[J].CIESC Jorunal，2014，65（3）：1062-1067.（in Chinese）

[22]ZHU P，LONG G，NIJR，et al.Deposition kinetics of extracellular polymeric substances（EPS）on silica in monovalent and divalentsalts[J].Environmental Science&Technology，2009，43（15）：5699-5704.

[23]KANG Chunli，DONG Dem ing，LIZhonghua，etal.Extraction ofextracellular polymers from biofilms in naturalwater by EDTA solution[J].Journal of Northeast Normal University（Natural Science Edition），2003，35（2）：120-122.（in Chinese）

[24]SUN M，LIW W，MU Z X，etal.Selection of effectivemethods for extracting extracellular polymeric substances（EPSs）from Bacillusmegaterium TF10[J].Separation and Purification Technology，2012，95：216-221.

[25]SUN M，LIW W，YU H Q，etal.A novel integrated approach to quantitatively evaluate the efficiency of extracellular polymeric substances（EPS）extraction process[J].Applied M icrobiology and Biotechnology，2012，96（6）：1577-1585.

[26]HAN Wei，YUAN Linjiang，CAI Lu.Extracellular polymer ability of phosphorus accumulation and the relationship w ith the biologicalphosphorus removal[J].Journal of Safety and Environment，2012，12（5）：23-28.（in Chinese）

[27]LIU Xiang，HUANG Yingen，LIU Yan，et al.The comparison of effectiveness of differentmethods in extracting extracellular polymeric substances（EPS）from biofilm and activated sludge[J].Journal of Fudan University（Natural Science），2011，50（5）：556-562.（in Chinese）

[28]張治安，陳展宇.植物生理學(xué)試驗技術(shù)[M].長春：吉林大學(xué)出版社，2008.

[29]CEYHAN N，OZDEM IR G.Extracellular polysaccharides produced by cooling water tower biofilm bacteria and their possible degradation[J].Biofouling，2008，24（2）：129-135.

[30]FROLUND B，PALMGREN R，KEIDING K，et al.Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin[J].W ater Research，1996，30（8）：1749-1758.

[31]GE Liyun，DENG Huanhuan，GAO Hongwei，et al.Study on extraction of extracellular polymeric substances from activated sludge[J].Environmental Science and M anagement，2010，35（9）：47-50.（in Chinese）

[32]GAO Jingfeng，GUO Jianqiu，CHEN Ranni，etal.Comparison of the efficiency of five extracellular polymeric substances（EPS）extraction methods using three dimensional excitation and em ission matrix （EEM）fluorescence spectroscopy together w ith chemicalanalysis[J].Environmental Chem istry，2008，27（5）：662-668.（in Chinese）

[33]WANG Xuan，JIM in，WANG Jingfeng，et al.Study on the extraction of extracellular polymer from aerobic granular sludge[J]. China Water＆Wastewater，2005，21（8）：91-93.（in Chinese）

[34]SUN M，LIW W，YU H Q，etal.A novel integrated approach to quantitatively evaluate the efficiency of extracellular polymeric substances（EPS）extraction process[J].Applied M icrobiology and Biotechnology，2012，96（6）：1577-1585.

[35]YAN Jieneng，XU Yanbin，XU Da，etal.On the optim ization of extracted progress for theextracellular polymeric substance of aCr（Ⅵ）-removalpredominated strain（Brevibacillussp.）[J].Journal of Safety and Environment，2012（2）：13.（in Chinese）

[36]ADAV S S，LEE D J，TAY J H.Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule[J].W ater Research，2008，42（6）：1644-1650.

[37]WU Zhuoying，GUO Feng，YEChengsong，etal.Comparison of extractionmethods forextracellular polymeric substances from a drinkingwaterbiofilm-form ing bacteria[J].Environmental Chem istry，2012，31（4）：539-543.（in Chinese）

[38]TANG Jinhua，XU Guoren，XIAO Jing，et al.Optim ization of extraction condition of extracellular polymeric substances from activated sludge[J].Journal of Anhui Agricultural Sciences，2012，40（6）：3505-3507.（in Chinese）

[39]QU F，LIANG H，HE J，etal.Characterization of dissolved extracellularorganicmatter（dEOM）and bound extracellularorganic matter（bEOM）of M icrocystis aeruginosa and their impacts on UFmembrane fouling[J].W ater Research，2012，46（9）：2881-2890.

Extraction of Extracellular Polymers from Natural Biofilm s

MU Yanan， CHENG Xiaoying*
（School of Environment and Civil Engineering，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Using the contentof protein and polysaccharide and the contentof nucleic acid separately as indicators of total extracellular polymeric substances（EPS）and cell autolysis，five different extraction methods，including thermal，EDTA，NaOH+NaCl，ultrasonic+CER and high speed centrifugation（control）treatments，for EPS from naturalbiofilmswere studied.Resultsshowed that NaOH+NaCl treatment was the most effective for EPS extraction w ith less nucleic acid contam ination.The optimal extraction conditionswere 2mol/L NaOH，0.85%NaCl，extraction time 2.5 h and centrifugal force 7 000 g.W ith these parameters，the extraction content of EPS was 157.57mg/L.

naturalbiofilms，extracellularpolymeric substances，extraction

X 172

A

1673—1689（2017）05—0499—08

2015-06-08

國家“十二五”科技支撐計劃重大項目（2012ZX07101-013-04）。

*通信作者：成小英（1977—），女，江蘇無錫人，理學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事湖泊生態(tài)工程研究。

E-mail：chengxiaoysytu@163.com

慕亞南，成小英.自然水體生物膜胞外聚合物的提取及優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（05）：499-506.