孫龍，孫洪計(jì)，張瑞東，汪渙，晏鵬，張方，吳榮，吳孝兵

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳保護(hù)生物學(xué)教研室，蕪湖，241000）

甲狀腺激素受體在揚(yáng)子鱷卵巢中的免疫組織化學(xué)定位和不同繁殖時(shí)期的m RNA表達(dá)水平變化檢測(cè)

孫龍，孫洪計(jì)，張瑞東，汪渙，晏鵬，張方，吳榮，吳孝兵*

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳保護(hù)生物學(xué)教研室，蕪湖，241000）

目的研究揚(yáng)子鱷甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和在卵巢組織中的定位，分析成年揚(yáng)子鱷在不同繁殖活動(dòng)期卵巢組織中甲狀腺激素受體的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。方法通過(guò)Clustal W軟件對(duì)揚(yáng)子鱷和其它脊椎動(dòng)物TRs氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)TRα和TRβ mRNA在不同繁殖時(shí)期卵巢組織中的表達(dá)水平差異；應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對(duì)揚(yáng)子鱷卵巢卵泡中TR進(jìn)行組織定位。結(jié)果系統(tǒng)發(fā)育分析顯示揚(yáng)子鱷與鳥(niǎo)類(lèi)親緣關(guān)系較近；揚(yáng)子鱷卵巢中TR的mRNA表達(dá)水平在繁殖期最高，在繁殖前期和繁殖后期相對(duì)較低；免疫組織化學(xué)染色顯示，TR陽(yáng)性反應(yīng)主要位于卵泡的顆粒層細(xì)胞、卵泡膜、卵母細(xì)胞質(zhì)和卵母細(xì)胞核中，其中顆粒層細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)最明顯。結(jié)論TR基因的進(jìn)化時(shí)間較早，因此序列保守性較高； TRα和TRβ對(duì)揚(yáng)子鱷卵泡發(fā)育成熟具有重要作用；顆粒層細(xì)胞是TRs的功能作用主要位點(diǎn)。

揚(yáng)子鱷；甲狀腺激素受體；卵巢

在脊椎動(dòng)物中，甲狀腺激素有三碘甲狀腺原氨酸（T3）和甲狀腺素（T4）兩種，T3是甲狀腺激素活性最強(qiáng)的形式，由非甲狀腺組織中的T4外環(huán)脫碘產(chǎn)生[1]。甲狀腺激素THs影響脊椎動(dòng)物多個(gè)方面，如生殖、生長(zhǎng)、分化和新陳代謝等[2]。甲狀腺激素的生物效應(yīng)是由甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）介導(dǎo)的[3,4]，TR是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，以配體依賴的方式調(diào)節(jié)T3靶基因的活性，即TR是甲狀腺激素發(fā)揮作用的重要橋梁。甲狀腺激素先與甲狀腺激素受體結(jié)合形成激素受體復(fù)合物，再捆綁到靶基因中的甲狀腺激素應(yīng)答元件上，從而達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用[5]。在缺少配體時(shí)，TR結(jié)合特異DNA序列，通過(guò)和共抑制子相互作用主動(dòng)抑制轉(zhuǎn)錄。配體的結(jié)合導(dǎo)致TR結(jié)構(gòu)改變，釋放共抑制子并招募共激活子而激活轉(zhuǎn)錄。

在多種脊椎動(dòng)物（魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi))中均克隆和分離到2種甲狀腺激素受體基因：TRα和TRβ。TRα和TRβ亞型又因選擇性剪接或轉(zhuǎn)錄起始位置的不同而產(chǎn)生若干變體。TRα和TRβ常存在于同一種細(xì)胞中，擁有同樣的蛋白節(jié)段。研究發(fā)現(xiàn)TR mRNA在哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)顆粒細(xì)胞中有表達(dá)[6-9]，同時(shí)在人的成熟卵子和胚泡時(shí)期亦有表達(dá)[10]。

甲狀腺激素對(duì)于脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)的影響發(fā)生在其受體水平，即受體分布及功能的組織特異性，主要通過(guò)TRβ介導(dǎo)調(diào)控[11,12]。TRα的主要功能是調(diào)節(jié)機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，維持甲狀腺功能。TRβ可增加機(jī)體對(duì)T3的敏感性，維持甲狀腺激素（TH）對(duì)促甲狀腺激素（TSH）的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。目前關(guān)于甲狀腺激素受體對(duì)爬行類(lèi)鱷目生殖作用的研究知之甚少，本研究分離克隆了揚(yáng)子鱷甲狀腺激素受體基因TRα和TRβcDNA的部分序列，通過(guò)翻譯轉(zhuǎn)變?yōu)榘被嵝蛄?，并?gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探討了揚(yáng)子鱷甲狀腺激素受體基因的親緣進(jìn)化關(guān)系；通過(guò)qRT-PCR方法初步探討了甲狀腺激素受體兩種不同亞型在成年揚(yáng)子鱷不同繁殖時(shí)期（繁殖前期、繁殖期和繁殖后期）的表達(dá)差異；通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)TR蛋白進(jìn)行定位研究，獲知甲狀腺激素受體基因在卵巢組織中的表達(dá)位點(diǎn)和功能作用區(qū)域。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

通過(guò)尾靜脈注射戊巴比妥鈉的方法，待揚(yáng)子鱷麻醉后解剖，解剖取本實(shí)驗(yàn)所需要的卵巢組織樣品，同時(shí)將其他內(nèi)臟組織一并取回用于其他實(shí)驗(yàn)研究。從2014年至2016年共收集到6條成年雌鱷卵巢樣品，根據(jù)揚(yáng)子鱷繁殖時(shí)期的不同，卵巢樣品可分為繁殖前期（1～3月）、繁殖期（5～7月）、繁殖后期（9～11月）3個(gè)階段，每個(gè)階段兩個(gè)樣品。卵巢組織和其它內(nèi)臟組織樣品均來(lái)源于安徽省揚(yáng)子鱷繁殖研究中心。本實(shí)驗(yàn)收集的卵巢樣品包括定量實(shí)驗(yàn)樣品和免疫組織化學(xué)樣品，其中定量實(shí)驗(yàn)樣品保存在去RNA酶保存液中，免疫組織化學(xué)樣品放入4%多聚甲醛中固定。實(shí)驗(yàn)樣品從采集地運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室的過(guò)程中通過(guò)低溫冰盒保存的，到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后定量實(shí)驗(yàn)樣品保存在-80℃，免疫組織化學(xué)樣品放在4℃冰箱保存。

2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

使用RNAprep pure Tissue kit 試劑盒（TIANGEN，北京）對(duì)各個(gè)時(shí)期的卵巢組織進(jìn)行總RNA提取，實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)。通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)在A260/A280（1.8-2.0）對(duì)所提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA通過(guò)Prime ScriptTMRT Reagent Kit試劑盒（TaKaRa，大連），操作流程嚴(yán)格遵守使用說(shuō)明書(shū)，并將所得到的cDNA保存在-20℃。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)近源物種密河鱷的TR文獻(xiàn)引物和GenBank上已有的揚(yáng)子鱷TR序列共設(shè)計(jì)出兩對(duì)Q-PCR引物，L8作為內(nèi)參基因（表1）。定量PCR反應(yīng)體系按照SYBR Prem ix Ex Taq試劑盒（TaKaRa,大連）操作說(shuō)明進(jìn)行，使用BioRad IQ5 real-time PCR儀進(jìn)行上機(jī)運(yùn)行。TRα反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，隨后95 ℃ 15 s，63 ℃ 30 s，72℃ 30s 40個(gè)循環(huán)，72℃ 10s 47個(gè)循環(huán)；TRβ反應(yīng)程序：95 ℃ 5 m in，隨后95 ℃30 s，54 ℃ 45 s，72℃ 50s 40個(gè)循環(huán)，72℃ 10s 47個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品至少進(jìn)行3次重復(fù)（n≥3），最后對(duì)所有樣品進(jìn)行融解曲線的擴(kuò)增分析。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算，其數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（±se）。統(tǒng)計(jì)分析采用One-way方差分析并進(jìn)行Duncan多重比較。

4 TRs基因序列分析

本研究參考密河鱷文獻(xiàn)中的引物（表1），對(duì)揚(yáng)子鱷TR cDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序所得的核苷酸序列通過(guò)人工拼接完成，使用Primer 5.0翻譯為對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，用Blastx搜索相關(guān)脊椎動(dòng)物（魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、哺乳類(lèi)）同源蛋白序列。用Clustal W比對(duì)不同物種的TR序列，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用的物種及TR序列登錄號(hào)信息如下：Homo sapiens 智人（TRα: NP_955366.1, TRβ： NP_000452.2），Pelophylaxnigromaculatus黑斑側(cè)褶蛙（TRα: AGT55994.1，TRβ: AGT55995.1），Xenopuslaevis非洲爪蟾（TRα: NP_001081595.1，TRβ：NP_001090182.1），Daniorerio斑馬魚(yú)（TRα：NP_571471.1，TRβ：NP_571415.1）， Cynoglossussemilaevis半滑石鰨（TRα：NP_001281144.1，TRβ：NP_001284509.1）， Alligator mississippiensis密河鱷（TRα： NP_001274207.1， TRβ: NP_001274240.1，Gallus gallus 原雞（TRα： NP_990644.1， TRβ: NP_990778.2），Capra hircus 山羊（TRα：XP_013827781.1，TRβ：XP_005698984.1），Rattusnorvegicus褐家鼠（TRα：NP_001017960.1，TRβ: NP_036804.2）， Sturnus vulgaris紫翅椋鳥(niǎo)（TRα：XP_014740999.1，TRβ： XP_014742749.1），Pelodiscussinensis中華鱉（TRα： XP_014426128.1，TRβ：XP_006134382.1），Python bivittatus緬甸蟒蛇（TRα：XP_007420744.1， TRβ: XP_007421744.1）。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

5 免疫組織化學(xué)染色

樣品組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，酒精脫水，最后進(jìn)行石蠟包埋。石蠟組織通過(guò)萊卡RM 2245切片機(jī)切成5μm切片。切片經(jīng)過(guò)脫蠟和水化、PBS沖洗、微波抗原修復(fù)、H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性等一系列處理后，在4℃進(jìn)行一抗孵育過(guò)夜。一抗為兔多克隆抗體（TRα，bs-6222R，博奧森；TRβ，bs-11440R，博奧森）（均為1:250稀釋?zhuān)Ｔ赑BS中漂洗后用1:100稀釋的羊抗兔IgG多克隆抗體（濃縮型SABC-POD試劑盒，SA2002，博士德）孵育30 min，待二胺聯(lián)苯胺（DAB）呈色后蘇木精復(fù)染，最后用中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗，切片通過(guò)Olympus BX61顯微鏡觀察拍片。

結(jié) 果

1 揚(yáng)子鱷TR基因在進(jìn)化上與其它脊椎動(dòng)物對(duì)應(yīng)基因具有高度保守性

TRα和TRβcDNA序列克隆部分片段長(zhǎng)度分別為855bp和453bp。這兩段序列為T(mén)R的編碼區(qū)部分序列，應(yīng)用軟件翻譯為對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，并基于氨基酸序列分別構(gòu)建了同源基因TRα與TRβ的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖 1）。在TRα發(fā)育樹(shù)中，揚(yáng)子鱷與密河鱷緊密聚為一枝，序列同源性高，然后再與鳥(niǎo)類(lèi)聚為一枝，這與很多分子生物學(xué)研究結(jié)果相一致。在TRβ發(fā)育樹(shù)中，揚(yáng)子鱷同樣先與密河鱷聚為一枝，再與鳥(niǎo)類(lèi)聚為一枝。其它所有哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)均聚為一簇。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/）Blastx搜索發(fā)現(xiàn)，TRα基因序列與密河鱷（Alligator mississippiensis）的同源性高達(dá)99%，這與系統(tǒng)樹(shù)結(jié)果相一致。其次與灣鱷（Crocodilusporosus）和食魚(yú)鱷（Gavialisgangeticus）同源性也高達(dá)98%，與西部錦龜（Chrysemyspictabellii）同源性在92%。TRβ基因序列與密河鱷的同源性也高達(dá)99%，與綠頭鴨（Anasplatyrhynchos）、朱鹮（Nipponia Nippon）等鳥(niǎo)類(lèi)同源性高達(dá)95%。TR與人類(lèi)（Homo sapiens）、非洲爪蟾（Xenopuslaevis）和斑馬魚(yú)（Daniorerio）也都有較高的序列同源性。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，揚(yáng)子鱷與密河鱷TR基因進(jìn)化關(guān)系最近，其次是與鳥(niǎo)類(lèi)的進(jìn)化關(guān)系最近；序列同源性大小比較結(jié)果也驗(yàn)證了揚(yáng)子鱷TR基因在進(jìn)化上具有較高的保守性。由于揚(yáng)子鱷TR基因與密河鱷同源性極高，因此本研究揚(yáng)子鱷TR基因序列克隆參考密河鱷文獻(xiàn)引物（表1）。

圖1 TR氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 The NJ phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequence of TR.

2 揚(yáng)子鱷卵巢中TR m RNA表達(dá)水平在繁殖期高于非繁殖期

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)揚(yáng)子鱷TR mRNA在不同繁殖時(shí)期卵巢組織中相對(duì)表達(dá)水平顯示，TR基因在卵巢組織中不同繁殖時(shí)期均有表達(dá)，同時(shí)在不同繁殖時(shí)期之間表達(dá)水平也存在顯著性差異，其中繁殖期表達(dá)水平最高；在同一繁殖期內(nèi)，TRβ mRNA的表達(dá)水平均高于TRα mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)TRα和TRβ mRNA表達(dá)水平之間也存在顯著性差異；TRα mRNA在卵巢組織中不同繁殖期的表達(dá)水平動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)與TRβ mRNA表達(dá)水平變化趨勢(shì)相一致，即TRs從繁殖前期到繁殖期過(guò)程呈上升趨勢(shì)，從繁殖期到繁殖后期過(guò)程呈下降趨勢(shì)（圖2）。

3 TR在揚(yáng)子鱷卵泡顆粒細(xì)胞中陽(yáng)性反應(yīng)較其它部位顯著

TRα和TRβ在卵巢卵泡中的陽(yáng)性表達(dá)位點(diǎn)幾乎相同，二者主要分布在次級(jí)卵泡的卵泡膜（theca follicle，TF）、顆粒細(xì)胞（granular cell，GC）、卵母細(xì)胞質(zhì)（oocyte cytoplasm，OC）、卵母細(xì)胞核（oocyte nuclear，ON）等部位（圖 3）。其中在卵泡的顆粒細(xì)胞中陽(yáng)性較強(qiáng)，在卵泡膜、卵母細(xì)胞胞質(zhì)、核膜陽(yáng)性反應(yīng)較弱；在顆粒層細(xì)胞中，TRα的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比TRβ的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目少。

圖2 TRα和TRβ mRNA在不同繁殖期揚(yáng)子鱷卵巢中表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)分析。a、b、c，TRα在不同繁殖期的單因素方差分析結(jié)果，TRα在3個(gè)繁殖期之間均存在顯著性差異（0.01＜P＜0.05）；A和B表示TRβ在不同繁殖期的單因素方差分析結(jié)果， TRβ在繁殖前期和繁殖后期之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），TRβ在繁殖期與繁殖前期和繁殖后期之間均存在顯著性差異（0.01＜P＜0.05）；*，同一繁殖期內(nèi)TRα和TRβ之間比較，0.01＜P＜0.05；**，同一繁殖期內(nèi)TRα和TRβ之間比較，P＜0.01；n=3Fig. 2 Statistical analysis of the mRNA levels of TRα and TRβ in the ovary of Chinese alligators at dif erent reproductive stages. a, b and c represent the One-Way ANOVA values of TRα at dif erent reproductive stages, show ing signif cant dif erences among all three stages (0.01＜P＜0.05); A and B represent the One-Way ANOVA values of TRβ at dif erent reproductive stages, show ing no signif cant dif erence between pre-reproductive and post-reproductive periods (P＞0.05) but a signif cant dif erence in the breeding season (0.01＜P＜0.05); *, 0.01＜P＜0.05, comparison of TRα and TRβ at the same stage；**, P＜0.01, comparison of TRα and TRβ at the same stage; n=3

圖 3 TR 在揚(yáng)子鱷卵泡組織中免疫組織化學(xué)定位。A、C和E，TRα；B、D和F，TRβ；TF ，卵泡膜；GC ，顆粒細(xì)胞；OC ，卵母細(xì)胞質(zhì)；ON ，卵母細(xì)胞核；比例尺：A和B，80μm；C和D，40μm；E和F，20μmFig. 3 Immunohistochem ical localization of TR in the follicular tissue of the Chinese alligator. A, C and E, TRα; B, D and F, TRβ; TF, theca follicle; GC, granular cell; OC, oocyte cytoplasm; ON, oocyte nucleus; scale bar: 80μm in A and B, 40μm in C and D, 20μm in E and F

討 論

基于揚(yáng)子鱷甲狀腺激素受體基因氨基酸序列與其它脊椎動(dòng)物對(duì)應(yīng)甲狀腺受體基因氨基酸序列構(gòu)建的親緣關(guān)系樹(shù)，TRα和TRβ在不同脊椎物種間表現(xiàn)出高度的同源性，尤其與鳥(niǎo)類(lèi)同源性最高，這與大多分子生物學(xué)研究結(jié)果相一致，說(shuō)明甲狀腺激素受體在物種進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)時(shí)間較早，對(duì)動(dòng)物的個(gè)體生殖發(fā)育和生長(zhǎng)代謝等方面的調(diào)節(jié)作用非常重要[13]，因此序列的保守性較高，其次可能是本研究克隆獲得的TRs基因cDNA序列片段均位于高度保守的DNA結(jié)合功能區(qū)（DBD區(qū)）。

熒光定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種甲狀腺激素受體基因在卵巢組織中表達(dá)呈現(xiàn)顯著的繁殖相關(guān)變化模式，即季節(jié)性變化規(guī)律，表現(xiàn)為繁殖期表達(dá)水平最高。這可能是因?yàn)閾P(yáng)子鱷在繁殖期需要不斷的進(jìn)行新陳代謝以增加能量供給，這為繁殖代謝過(guò)程提供準(zhǔn)備。此外，在同一繁殖期內(nèi)，TRβ的表達(dá)水平均比TRα高，表明TRβ介導(dǎo)的功能作用比TRα突出。在其它脊椎動(dòng)物甲狀腺激素受體分布及功能的組織特異性研究表明甲狀腺激素受體對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝具有重要作用，并且主要通過(guò)TRβ介導(dǎo)[11,12,14-17]。在多種脊椎動(dòng)物中甲狀腺激素循環(huán)和生殖周期是正相關(guān)的[2]。在意大利壁蜥mRNA分離實(shí)驗(yàn)中使用的非洲爪蟾TRα基因片段特異的RNA印記雜交探針，在血清甲狀腺激素水平觀察中TRα轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平也隨著季節(jié)的變化發(fā)生著改變[18]。TRα和TRβ亞型在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程和不同的成年組織中均具有明顯的時(shí)空表達(dá)模式[19,20]，TRα和TRβ的mRNA表達(dá)水平在大多數(shù)組織中分布密度也不同，對(duì)T3有組織特異性反應(yīng)。甲狀腺激素的季節(jié)性波動(dòng)與生殖活動(dòng)也相一致，表現(xiàn)為繁殖期表達(dá)水平最高，非繁殖期表達(dá)水平相對(duì)較低[21]。

甲狀腺激素及其受體對(duì)性腺組織起到重要的作用。在卵巢中，甲狀腺激素濃度在卵母細(xì)胞的最終成熟過(guò)程、卵黃生成過(guò)程和胚胎形成過(guò)程中均有所增加；不同的生殖激素也存在特征性的表達(dá)變化模式，即雌激素的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于雄激素和孕激素，這可能是雌激素對(duì)卵巢發(fā)育影響最為重要的原因[22]。同時(shí)，甲狀腺激素對(duì)脊椎動(dòng)物性腺的早期發(fā)育、生殖發(fā)育過(guò)程中生殖激素的表達(dá)調(diào)控起到重要作用[23-25]，對(duì)人類(lèi)生殖管道的發(fā)育過(guò)程中也起到適當(dāng)?shù)淖饔肹26,27]。甲狀腺激素受體對(duì)脊椎動(dòng)物的發(fā)育和基因調(diào)節(jié)的變態(tài)發(fā)育過(guò)程也起到重要作用[28]。此外，TRα和TRβ mRNA表達(dá)水平在卵巢組織中也呈現(xiàn)高度的協(xié)同模式，表明TRα和TRβ對(duì)揚(yáng)子鱷卵黃生成和卵泡發(fā)育成熟具有協(xié)同作用。

TR的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TRα和TRβ在卵泡組織中的分布位置沒(méi)有顯著性差異，均在顆粒層細(xì)胞中陽(yáng)性反應(yīng)最明顯，其它細(xì)胞結(jié)構(gòu)中陽(yáng)性反應(yīng)稍弱，這說(shuō)明了顆粒層細(xì)胞是甲狀腺激素受體的主要功能作用部位。陽(yáng)性物質(zhì)多而密集的分布在卵泡區(qū)域，表明受體介導(dǎo)效應(yīng)在該部位相對(duì)較強(qiáng)。TRα基因在牛成熟卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞均存在表達(dá)[9]，且TRα陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨卵泡的發(fā)育成熟而增多[29]，說(shuō)明TRα對(duì)卵泡發(fā)育成熟具有促進(jìn)作用。

本研究獲得了TR基因序列，探索了揚(yáng)子鱷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；通過(guò)對(duì)TR蛋白的定位表達(dá)，即研究了甲狀腺激素兩種受體在揚(yáng)子鱷卵巢次級(jí)卵母細(xì)胞中的主要位置分布情況；對(duì)不同繁殖時(shí)期卵巢組織中TR mRNA水平動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，揭示了甲狀腺激素受體對(duì)雌性揚(yáng)子鱷繁殖過(guò)程中卵巢發(fā)育的影響和作用，這對(duì)瀕危物種揚(yáng)子鱷物種保護(hù)和種群的擴(kuò)增具有重要意義。但TR對(duì)雌鱷卵黃生成作用和卵泡的發(fā)育成熟過(guò)程是怎樣動(dòng)態(tài)調(diào)控作用還需要進(jìn)一步研究。

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Immunohistochem ical localization of thyroid hormone receptor and detection for variation of mRNA level in dif erent reproductive periods in the ovary of the Chinese alligator

Sun Long, Sun Hongji, Zhang Ruidong, Wang Huan, Yan Peng, Zhang Fang, Wu Rong, Wu Xiaobing*
(Department of Genetic Conservation Biology, College of Life Science, Anhui Normal University, Wuhu 241000,China)

ObjectiveTo investigate thyroid hormone receptor (TR) localization in the ovarian tissue, and the phylogenetic relationships of TR genes in Chinese alligators; also analyze the variation of their expression in the ovary at dif erent reproductive stages in adult Chinese alligators.MethodsThe TR amino acid sequences of the Chinese alligator and other vertebrates were compared by Clustal W software. The NJ phylogenetic tree was built by MEGA 6.0 software. The variation of the mRNA levels of TRα and TRβ in the ovary at dif erent reproductive stages was detected by qRT-PCR. Immunohistochemistry was used to locate TR in the ovarian follicles of Chinese alligators.ResultsThe phylogenetic analysis showed that the Chinese alligator had a close relationship w ith birds in the phylogeny tree. The TR mRNA level in the ovary of the Chinese alligator was the highest in the breeding season and relatively lower in the pre-reproductive and post-reproductive periods. Immunohistochem ical staining results showed that TR was mainly located in the granular layer, theca follicle, oocyte cytoplasm and nuclei of the follicle, and the reactivity was the most remarkable in the granular layer cells.ConclusionTR genes evolved early in the phylogeny tree, and their sequences are highly conserved. TRα and TRβ play an important role in the development and maturation of the follicle of Chinese alligators, and function mainly in the granular layer cells.

Chinese alligator; thyroid hormone receptor; ovary

Q955

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.004

2017-03-01

2017-06-02

中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472019)

孫龍，男（1990年），漢族，碩士研究生

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：wuxb@mail.ahnu.edu.cn