段宙位,謝 輝,何 艾,王世萍,劉 佳,竇志浩,*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工設計研究所,海南?？?571100;2.海南大學食品學院,海南海口 570228)

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大孔樹脂純化菠蘿蜜果皮黃酮工藝

段宙位1,謝 輝1,何 艾1,王世萍1,劉 佳2,竇志浩1,*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工設計研究所,海南海口 571100;2.海南大學食品學院,海南?？?570228)

本實驗以菠蘿蜜果皮為原料,比較5種大孔樹脂對菠蘿蜜果皮黃酮吸附率和解吸率的影響,篩選出適合純化菠蘿蜜果皮黃酮的大孔樹脂,通過單因素和正交實驗優(yōu)化純化工藝;測定菠蘿蜜果皮黃酮純化前后清除DPPH自由基和ABTS自由基作用,分析純化效果。結果表明:NKA-9樹脂純化菠蘿蜜黃酮效果較好,最佳條件為粗提液濃度6 mg/mL,上樣流速1.5 mL/min;洗脫劑70%(v/v)乙醇,洗脫流速2.5 mL/min,菠蘿蜜果皮黃酮純度提高至80.15%。菠蘿蜜果皮黃酮純化后清除DPPH自由基和ABTS自由基IC50值分別為0.0054、0.015 mg/mL,優(yōu)于純化前的IC50值0.041、0.092 mg/mL。以上說明,NKA-9樹脂適合分離純化菠蘿蜜果皮黃酮。

大孔樹脂,菠蘿蜜果皮黃酮,純化

菠蘿蜜,又稱苞蘿,是桑科桂木屬常綠喬木,有“熱帶水果皇后”之稱[1]。據(jù)統(tǒng)計,2014年我國菠蘿蜜種植面積約20萬畝,產(chǎn)量約120萬t[2]。菠蘿蜜產(chǎn)量高,果實碩大,含有糖類、蛋白質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)。菠蘿蜜以鮮食為主,也有加工成果脯、果醬等產(chǎn)品,在此過程中產(chǎn)生果皮果腱等廢棄物約占整果的40%～60%[3]。據(jù)報道,菠蘿蜜果皮富含糖類、多酚、黃酮、果膠等活性成分[4],而其中的黃酮類化合物具有抗凝血[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]、抗抑郁[9]等作用。因此,研究菠蘿蜜果皮利用途徑,具有重要意義。

大孔樹脂法常用于天然產(chǎn)物分離純化,具有穩(wěn)定性高、選擇性強、易操作等優(yōu)點[10]。國內(nèi)外應用大孔樹脂純化黃酮的報道較多,如陳曉俠等[11]用AB-8樹脂純化蛹蟲草黃酮;顧采琴等[12]用H103樹脂純化香蕉皮黃酮;何彥峰等[13]用HPD400型樹脂純化枸杞黃酮,但目前未見利用大孔樹脂純化菠蘿蜜果皮黃酮及比較純化前后抗氧化性的報道。因此,本實驗在提取菠蘿蜜果皮黃酮的基礎上,考察樹脂種類、上樣濃度、解吸劑、流速等因素對純化效果的影響,確定最佳純化條件;采用DPPH自由基法和ABTS自由基法比較純化前后黃酮的抗氧化性,以期為菠蘿蜜果皮的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 ?？谀媳彼袌?1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) Sigma公司;果膠酶(100000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;NKA-9、NKA-Ⅱ、D101、AB-8、X-5樹脂 南開大學化工廠。

BSZ-100柱層析系統(tǒng)Φ16 mm×500 mm層析柱 上海嘉鵬科技有限公司;TU-1810分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝流程 菠蘿蜜果皮→清洗→烘干(55 ℃)→粉碎→過篩(40目)→浸提→過濾→測定吸光值→計算得率

1.2.2 菠蘿蜜果皮黃酮的提取及含量測定

1.2.2.1 菠蘿蜜果皮黃酮粗提液的制備 稱取一定質(zhì)量的菠蘿蜜果皮粉末,按果膠酶用量300 U/g、乙醇濃度80%(v/v)、溫度55 ℃、pH5.5、底物質(zhì)量濃度45 g/L、時間2.0 h條件提取黃酮,經(jīng)濃縮干燥后,得到純度為13.15%的菠蘿蜜果皮黃酮粗提物。將菠蘿蜜果皮黃酮用20%(v/v)乙醇溶解,得菠蘿蜜果皮黃酮粗提液(以下簡稱“粗提液”),備用。

1.2.2.2 黃酮的測定與標準曲線的繪制 參考段宙位等[14]方法測定黃酮含量,移取0.25 mL樣液于10.0 mL比色管中,用蒸餾水定容至5.0 mL。分別往其中加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL,混勻靜置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,混勻靜置6 min;再向其中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL,混勻靜置15 min。同時用蒸餾水做空白對照,于510 nm波長處測定吸光度。

用70%的乙醇溶液配制成0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液,分別移取(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL)于10.0 mL的具塞試管中,用蒸餾水定容至5.0 mL。按上述方法測定吸光值,建立標準曲線方程:y=11.975x-0.0325,R2=0.9996,式中y表示吸光值,x表示蘆丁質(zhì)量濃度(濃度范圍0.02～0.10 mg/mL)。

1.2.2.3 黃酮純度的測定 取0.25 mL樣品溶液,按1.2.2.2方法測定吸光度,按下式計算黃酮純度。

純度(%)=(A+0.0325)×40×V×100/(11.975×1000m)

式中,A為吸光值;V為樣液體積(mL);m為樣品質(zhì)量(g);40為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 樹脂吸附與解吸特性的測定 參考陳建中等[10]方法,計算大孔樹脂對菠蘿蜜果皮黃酮粗提液的吸附量、吸附率、解吸率與回收率。

1.2.4 樹脂預處理 參考吳海霞等[15]方法處理樹脂。

1.2.5 吸附與解吸實驗

1.2.5.1 樹脂的篩選 取1.2.4方法處理的5種樹脂各5.0 g,加入100 mL粗提液,30 ℃下振搖(180 r/min)3 h,測定吸光值;將上述樹脂,用超純水洗至無色,加入70%乙醇100 mL,振搖(180 r/min)20 min,取上清液,510 nm處測定洗脫液吸光值。

1.2.5.2 粗提液濃度對吸附效果的影響 配制4.0～8.0 mg/mL粗提液,量取上述溶液各100 mL,向其中加入NKA-9樹脂5.0 g,振搖3 h,取上清液,510 nm處測定吸光值。

1.2.5.3 洗脫劑對菠蘿蜜果皮黃酮解吸率的影響 取飽和吸附的NKA-9樹脂各5.0 g,分別加入50%～90%(v/v)乙醇100 mL,振搖20 min,取上清液,510 nm處測定吸光值。

1.2.5.4 上樣流速對菠蘿蜜果皮黃酮吸附率的影響 準確稱取一定量的樹脂,填充于Φ16 mm×500 mm層析柱內(nèi),以1.0～3.0 mL/min流速上樣層析柱,取流出液,510 nm處測定吸光值。

1.2.5.5 洗脫流速對菠蘿蜜果皮黃酮解吸率的影響 將粗提液按上述最優(yōu)條件上柱,待吸附平衡后,用70%乙醇,以1.5～3.5 mL/min流速洗脫,取流出液,510 nm處測定吸光值。

1.2.5.6 菠蘿蜜果皮黃酮純化正交實驗 選擇影響菠蘿蜜果皮黃酮回收率較大的四個因素粗提液濃度、上樣流速、解吸劑、洗脫流速做正交實驗,因素水平如表1所示。

表1 因素與水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.5.7 動態(tài)吸附與洗脫曲線的繪制 將1.2.4方法處理的NKA-9樹脂填充(濕法裝柱)于層析柱中,以1.5 mL/min速度將6.0 mg/mL粗提液通過層析柱,分管收集,每管9 mL,測定吸光值。按每10管1個柱體積(BV),繪制吸附曲線。待吸附平衡后,用70%(v/v)乙醇以2.5 mg/mL速度洗脫,同上述方法收集洗脫液,繪制洗脫曲線。

1.2.6 菠蘿蜜果皮黃酮純化效果分析 比較菠蘿蜜果皮黃酮純化前后的純度,清除DPPH自由基[16]與ABTS自由基[17]能力,分析黃酮的純化效果。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有實驗數(shù)據(jù)重復3次取平均值,采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,Origin8.5軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 樹脂吸附與解吸實驗

2.1.1 樹脂篩選 大孔樹脂的表面性質(zhì)、孔徑及比表面積對被吸附物的吸附特性影響較大[12]。由表2可知,極性樹脂NKA-9與NKA-Ⅱ樹脂對菠蘿蜜果皮黃酮的吸附能力較強;乙醇對樹脂的解吸效果較好,其中AB-8樹脂的解吸率最高,NKA-9樹脂次之。這可能是因為菠蘿蜜果皮黃酮是一種極性物質(zhì),分子質(zhì)量比較小,根據(jù)樹脂吸附特性,極性樹脂對極性物質(zhì)有較強的吸附能力,吸附樹脂易于分離與其孔徑相當?shù)幕衔?菠蘿蜜果皮黃酮在極性、孔徑較小的樹脂上更易吸附分離,同樣條件下樹脂比表面積越大,吸附量越大;而在洗脫過程中,樹脂和菠蘿蜜果皮黃酮之間主要靠范德華力結合,結合能力較弱,易被乙醇破壞,解吸效果較好。綜合考慮大孔樹脂對菠蘿蜜果皮黃酮的吸附與解吸性能,確定NKA-9大孔樹脂作為吸附填料。

表2 不同樹脂吸附與解吸性能比較Table 2 Static adsorption and desorption of different resins

2.1.2 粗提液濃度對吸附效果的影響 由圖1可知,粗提液濃度在4～6 mg/mL時,吸附率變化較小,吸附量逐漸增大;當濃度大于6 mg/mL時,吸附率逐漸變小,吸附量變化不大。這是因為粗提液濃度過高,超出樹脂的吸附能力,吸附率下降;濃度過低樹脂未達到飽和吸附,吸附量增加。綜合考慮NKA-9樹脂對菠蘿蜜果皮黃酮吸附率與吸附量的影響,樣品濃度選擇6 mg/mL左右為宜。

圖1 粗提液濃度對吸附效果的影響Fig.1 Effect of concentration on the adsorption efficiency of crude flavonoids from jackfruit peel

2.1.3 洗脫劑對菠蘿蜜果皮黃酮解吸率的影響 由圖2可知,被吸附的菠蘿蜜果皮黃酮用70%(v/v)乙醇洗脫效果較好,增加或降低乙醇濃度,均影響洗脫效果。這可能是因為70%(v/v)乙醇易把吸附的菠蘿蜜果皮黃酮從樹脂中萃取出來。因此,洗脫劑(乙醇)濃度選擇70%(v/v)左右為宜。

圖2 乙醇濃度對菠蘿蜜果皮黃酮解吸率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on the desorption ratio of flavonoids from jackfruit peel

2.1.4 上樣流速對吸附率的影響 由圖3可知,粗提液上樣流速越快,吸附率越小,這是因為粗提物通過層析柱速度快,菠蘿蜜果皮黃酮未被NKA-9樹脂充分吸附便流出層析柱。1.5 mL/min流速下,NKA-9樹脂對粗提液的吸附率僅比1.0 mL/min時低0.91%,但粗提液處理量增加了0.5倍。在較高吸附率前提下,適當加快粗提液上柱速度,利于生產(chǎn),因此,上樣流速選擇1.5 mL/min左右為宜。

圖3 上樣流速對吸附率的影響Fig.3 Effect of flow velocity on the adsorption ratio of flavonoids from jackfruit peel

2.1.5 洗脫流速對解吸率的影響 由圖4可知,解吸率隨乙醇洗脫速度增大而降低,這是因為乙醇洗脫樹脂速度較快時,乙醇與黃酮接觸不充分,不能將其完全置換出來。2.5 mL/min流速下,乙醇洗脫樹脂的解吸率僅比1.5 mL/min時低1.93%,但黃酮洗脫量增加66.67%。在較高解吸率前提下,適當加快乙醇洗脫速度,利于生產(chǎn)應用,因此,洗脫流速選擇2.5 mL/min左右為宜。

圖4 洗脫流速對解吸率的影響Fig.4 Effect of elution velocity on the desorption ratio of flavonoids from jackfruit peel

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

2.1.6 正交實驗結果 由表3可知,影響NKA-9樹脂純化菠蘿蜜果皮黃酮效果的四個因素次序為A>B>C>D,即上柱濃度>乙醇濃度>上樣流速>洗脫流速,最優(yōu)水平A2B2C1D1。由表4可知,四個因素對菠蘿蜜果皮黃酮回收率影響均不顯著,且上樣流速、洗脫流速對回收率的影響更小,綜合考慮回收率、純化效率,最終確定菠蘿蜜果皮黃酮的純化工藝為A2B2C2D2,即粗提液濃度6 mg/mL、洗脫劑70%乙醇、上樣流速1.5 mL/min、洗脫流速2.5 mL/min。按照A2B2C2D2條件補加實驗,得黃酮回收率為82.16%,進一步驗證此工藝對純化菠蘿蜜果皮黃酮有效。

表3 正交實驗結果Table 3 Result of orthogonal design

2.2 菠蘿蜜果皮黃酮動態(tài)吸附與洗脫曲線

由圖5可知,流出液中黃酮濃度隨粗提液用量的增加而增大,當粗提液用量小于20 BV時,流出液中含有較少的黃酮,說明大部分粗提液被吸附;當粗提液用量大于20 BV時,流出液中黃酮含量增加較快,其中粗提液用量65 BV時,流出液中黃酮的濃度達81.34 μg/mL,接近于菠蘿蜜果皮黃酮粗提液初始濃度,說明吸附達到平衡。

圖5 菠蘿蜜果皮黃酮動態(tài)吸附曲線Fig.5 Dynamic adsorption curve of flavonoids from jackfruit peel

由圖6可知,當乙醇用量小于1.5 BV時,菠蘿蜜果皮黃酮的溶出隨著洗脫劑用量增加而增大,在乙醇用量1.5 BV時,洗脫液中黃酮濃度達到最大值903.55 μg/mL;當乙醇用量大于1.5 BV時,黃酮的溶出隨洗脫劑用量增大而減小,其中4.5 BV時洗脫液中黃酮濃度為57.97 μg/mL,到7 BV時黃酮濃度僅為6.23μg/mL,說明此時解吸基本完成。

圖6 菠蘿蜜果皮黃酮動態(tài)洗脫曲線Fig.6 Dynamic elution curve of flavonoids from jackfruit peel

2.3 菠蘿蜜果皮黃酮純化前后效果比較

由表5可知,菠蘿蜜果皮黃酮經(jīng)NKA-9樹脂純化后,純度由13.15%提高至80.15%;清除DPPH自由基IC50值由0.041 mg/mL降低至0.0054 mg/mL;清除ABTS自由基IC50值由0.092 mg/mL降低至0.015 mg/mL,說明經(jīng)NKA-9樹脂純化后菠蘿蜜果皮黃酮的純度和抗氧化性明顯增強,NKA-9樹脂純化菠蘿蜜果皮黃酮效果較好。

表5 菠蘿蜜果皮黃酮純化前后效果比較Table 5 Comparison purification effect of flavonoids from jackfruit peel

3 結論

比較了5種大孔樹脂對菠蘿蜜果皮黃酮的吸附與解吸特性,篩選出NKA-9大孔樹脂適合分離純化菠蘿蜜果皮黃酮。通過樹脂吸附-解吸實驗,確定最佳純化條件為粗提液濃度6 mg/mL,上樣流速1.5 mL/min;洗脫劑70%(v/v)乙醇,流速洗脫2.5 mL/min。此條件下,黃酮回收率為82.16%(相對于菠蘿蜜果皮黃酮粗提物),純度提高至80.15%。比較了菠蘿蜜果皮黃酮純化前后的抗氧化性,菠蘿蜜果皮黃酮純化后清除DPPH自由基和ABTS自由基IC50值分別為0.0054、0.015 mg/mL,優(yōu)于純化前的0.041、0.092 mg/mL,說明經(jīng)過NKA-9大孔樹脂純化后菠蘿蜜果皮黃酮的純度顯著提高,抗氧化性明顯增強。

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Purification of flavonoids from jackfruit peel with macroporous resin

DUAN Zhou-wei1,XIE Hui1,HE Ai1,WANG Shi-ping1,LIU Jia2,DOU Zhi-hao1,*

(1.Institute of Processing&Design of Agroproducts,Hainan Academy of Agricultural Science,Haikou 571100,China;2.Collage of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The best macroporous resin for purification jackfruit peel flavonoids was selected from five types resin by adsorption and desorption capacities. Based on single factor test,an orthogonal design was applied to optimize purification process. Analysis purification effect was evaluated by DPPH and ABTS radical scavenging assay. The results showed that NKA-9 macroporous resin was feasible for the purification. During the resin adsorption process,the optimum adsorption conditions were sample concentration 6 mg/mL,flow rate 1.5 mg/mL. The desorption conditions were elution concentration 70%(v/v)alcohol,with eluanting velocity 2.5 mL/min .The optimized purification increased the purity of the flavonoid extract from jackfruit peel to 80.15%. The IC50of the final purified product for scavenging DPPH and ABTS free radicals were 0.0054,0.015 mg/mL,much better than 0.041,0.092 mg/mL of crude flavonoids. The results suggested that NKA-9 type macroporous resin can be used to purify the flavonoids from jackfruit peel.

macroporous resin;flavonoids from jackfruit peel;purification

2017-02-14

段宙位(1985-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：營養(yǎng)與功能食品研究，E-mail:universeduan@163.com。

*通訊作者:竇志浩(1961-)，男，本科，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮，E-mail:513408658@qq.com。

海南省省屬科研院所技術開發(fā)研究專項(KYYS-2015-10)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)13-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.035