冮潔，張爽，劉瑤，解彬，龐士磊

(大連民族大學(xué)，生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連，116600)

富鋅培養(yǎng)對香菇菌絲體生長和抗氧化酶系的影響

冮潔，張爽，劉瑤，解彬，龐士磊

(大連民族大學(xué)，生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連，116600)

通過對香菇菌絲體進(jìn)行液體和固體富鋅培養(yǎng)，以確定香菇菌絲體在外源鋅的作用下生長和抗氧化酶活性的變化規(guī)律。香菇菌絲體具有較強(qiáng)的耐鋅和富鋅能力，低濃度鋅對香菇菌絲體的生長有促進(jìn)作用，高濃度有抑制作用，適宜的鋅質(zhì)量濃度為600 mg/L。在鋅質(zhì)量濃度400 ～1 000 mg/L，香菇菌絲體超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)隨鋅濃度增加先升高再降低，最大值分別為：147.47 U/g、6.15×10-3U/g和147.52 U/g；菌絲體丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量隨鋅濃度增加先呈下降的趨勢，然后逐漸上升，在鋅質(zhì)量濃度600 mg/L時達(dá)到最低，為4.47×10-5μmol/g。香菇菌絲體抗氧化酶系隨培養(yǎng)時間變化規(guī)律的研究結(jié)果表明，香菇菌絲體在培養(yǎng)的第9天，SOD、POD和CAT的酶活性均達(dá)最大值，MDA含量達(dá)到最低值，分別為：154.31 U/g、6.21×10-3U/g、147.92 U/g和4.18×10-5μmol/g。香菇菌絲體在適宜濃度富鋅培養(yǎng)，不僅對香菇菌絲體的生長有促進(jìn)作用，同時可提高香菇菌絲體的鋅含量，并且提高了香菇菌絲體的抗氧化酶活性。

香菇；菌絲體；富鋅；抗氧化酶

WHO調(diào)查表明，全球近1/3的人口面臨著缺鋅引起的健康問題，缺鋅已成為影響人類健康的主要因素之一[1]。鋅是人體必需微量元素之一，不但參與40多種酶的組成，更是穩(wěn)定人體所必需的物質(zhì)(RNA、DNA、核糖體)[2]。鋅有“兒童生長素”之稱，缺鋅可致免疫力低下、佝僂病及貧血，營養(yǎng)不良及反復(fù)呼吸道感染，不同程度影響兒童生長發(fā)育[3-4]，甚至導(dǎo)致出現(xiàn)異食癖[5]。補(bǔ)鋅產(chǎn)品第一代是硫酸鋅等無機(jī)鋅，其缺點(diǎn)是難以吸收，且一般游離態(tài)金屬均具有一定的毒性。第二代是葡萄糖酸鋅和檸檬酸鋅等有機(jī)鋅，可以提高鋅的吸收率，但因其含有酸根，對人體有一定的副作用。第三代是蛋白鋅等生物鋅，使鋅能被人體更高效、更安全地吸收利用。食用菌具有較強(qiáng)的富鋅能力。通過將鋅攝入食用菌菌絲細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化，將無機(jī)鋅結(jié)合到大分子活性物質(zhì)(如多糖和蛋白質(zhì))上，成為有機(jī)鋅多糖和鋅蛋白，可以避免無機(jī)鋅的缺點(diǎn)，并更有利于有機(jī)鋅的免疫功能和食藥用菌的抗病功能的發(fā)揮[6]。香菇是我國第二大栽培食用菌[7]。其菌絲體和子實體中能富集鋅及其他微量元素[8]。香菇菌絲體對鋅、硒、鐵和錳等微量元素的吸收相互影響[9]。香菇可做為谷物食品的微量元素添加劑[10]。食用菌對微量元素的吸收主要都是通過菌絲體[11-14]。本課題研究了香菇菌絲體在外源鋅的作用下生長和抗氧化酶活性的變化規(guī)律，為開發(fā)新型生物補(bǔ)鋅制劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

香菇(Lentinusedodes, 早豐8號)，由遼寧省岫巖滿族自治縣嘉韻食用菌種植專業(yè)社提供；馬鈴薯，超市購買；葡萄糖、瓊脂、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、亞硒酸鈉、愈創(chuàng)木酚、30%H2O2、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、EDTA-Na2、核黃素、PVP、DTT、硫代巴比妥酸等均為分析純試劑；ZnSO4·7H2O，食品級，購自湖南奧馳生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

Z-2000原子吸收光譜儀，日本日立公司；PL203電子精密天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HYG-3多功能搖床，金壇市杰瑞爾電器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；UV2800型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；GRP-9080恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；TGL-16C高速臺式離心機(jī)，江蘇省興化市分析儀器廠；KDB-III COD微波消解儀，青島科迪博電子科技有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋，日本三洋；SW-CJ-1C無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香菇菌種制備

斜面培養(yǎng)基(綜合PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41.5 g，MgSO41.0 g，瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH 自然。

液體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：不加瓊脂的綜合PDA培養(yǎng)基。121 ℃，滅菌30 min。

富鋅培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按照實驗需要的鋅濃度加入硫酸鋅，混勻后分裝。

菌種活化：將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d。

液體菌種培養(yǎng)：將活化的斜面菌種4塊(黃豆粒大小)接種到裝有100 mL液體PDA綜合培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置25 ℃，150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)10 d。

1.3.2 香菇菌絲體液體培養(yǎng)

將液體菌種接入裝100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，接種量為10%， 25 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)結(jié)束后將菌絲體過濾，蒸餾水洗滌2遍，60 ℃烘干，稱重后測定菌絲體中鋅含量。

1.3.3 香菇菌絲體平板培養(yǎng)

在平皿中倒入PDA培養(yǎng)基制成培養(yǎng)平板，將斜面菌種用接菌環(huán)取出大小相近的2個菌塊(黃豆粒大小)，點(diǎn)接在培養(yǎng)平板上。于25 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.4 菌絲體生物量的測定

培養(yǎng)10 d的液體培養(yǎng)基稱量發(fā)酵液體積(mL)，用稱量好的濾紙進(jìn)行抽濾，抽濾過程中菌絲體用蒸餾水反復(fù)洗滌，將抽取的菌絲體放入60 ℃烘干至恒重，稱重。按公式(1)計算生物量：

(1)

1.3.5 菌絲體鋅含量的測定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.14-2003《食品中鋅的測定》第一法，采用原子吸收光譜法測定。

(2)

1.3.6 抗氧化酶系酶活的測定

將液體培養(yǎng)基中菌絲體過濾后稱取0.5 g，加入1 mL預(yù)冷的0.05 mol/L、pH 7.5的磷酸緩沖液，研磨后定容至5 mL，于冷凍離心機(jī)5 000 r/min，4 ℃、離心10 min，得上清液，為測定酶活溶液。

超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測定[15]。SOD活性單位定義：以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位。SOD 總活性以鮮重酶單位每克表示(U/g)。

過氧化物酶(POD)測定參照文獻(xiàn)[16]。過氧化物酶活性單位定義：以每克樣品(鮮重)每分鐘吸光度變化值增加1時記為1個活性單位。

過氧化氫酶(CAT)測定參照文獻(xiàn)[17]。過氧化氫酶(CAT)活性單位定義：以每克樣品鮮重每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個過氧化氫酶活性單位。

1.3.7 丙二醛(MDA)含量的測定

采用硫代巴比妥酸( TBA) 比色法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗處理3次重復(fù)，用Microsoft Excel軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果及分析

2.1 富鋅培養(yǎng)對香菇菌絲體生長的影響

2.1.1 香菇菌絲體固體平板富鋅培養(yǎng)的生長情況

通過香菇菌絲體固體平板富鋅培養(yǎng)，測定菌落直徑，考察香菇菌絲體耐鋅能力，結(jié)果如表1所示。

表1 香菇菌絲體固體平板富鋅培養(yǎng)結(jié)果

根據(jù)表1所示，在不同的鋅濃度的PDA固體培養(yǎng)基上，香菇菌絲生長情況有著明顯的差異。在培養(yǎng)的第3天，在700 mg/L的鋅質(zhì)量濃度下菌絲生長得好，其次是鋅質(zhì)量濃度為500 mg/L、600 mg/L的培養(yǎng)基；在培養(yǎng)至第8天時，同樣是700 mg/L的鋅質(zhì)量濃度下的香菇菌落直徑最大；在第10天時，500 mg/L的鋅質(zhì)量濃度下的香菇菌落直徑最大，其次是600 mg/L和700 mg/L的鋅質(zhì)量濃度。由此可見，在鋅質(zhì)量濃度低于500 mg/L時培養(yǎng)，香菇菌落直徑隨著鋅濃度的增加而上升，而鋅濃度為500～1 000 mg/L時，香菇菌絲的生長隨鋅濃度的增加而下降。在500 mg/L的鋅濃度下的香菇菌落直徑最大，表明生長的最好。

2.1.2 香菇菌絲體液體富鋅培養(yǎng)生長情況

通過香菇菌絲體液體富鋅培養(yǎng)，測定菌絲體生物量，考察香菇菌絲體耐鋅能力，結(jié)果如表2所示。

表2 香菇菌絲體液體富鋅培養(yǎng)結(jié)果

注：在同一列中，不同字母的標(biāo)注表示數(shù)據(jù)具有顯著差異(P≤0.05)，標(biāo)注順序是從平均值最大的開始，依次為a,b,c，…，下同。

由表2可以看出，香菇菌絲體富鋅培養(yǎng)，隨著鋅濃度的增加，生物量基本呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的狀態(tài)。當(dāng)鋅質(zhì)量濃度添加至600 mg/L時生物量最高達(dá)到2.28 g/100mL，繼續(xù)增加鋅質(zhì)量濃度，生物量有所下降，但其生物量仍顯著高于對照組(P≤0.05)。所以，香菇菌絲體具有很強(qiáng)的耐鋅能力。菌絲體的鋅含量隨著鋅質(zhì)量濃度的增加而升高，鋅質(zhì)量濃度添加到800 mg/L以后，菌絲體中的鋅沒有明顯地上升或者下降，僅有輕微波動，含量基本達(dá)到穩(wěn)定。從富鋅率來看，隨鋅濃度增加，逐漸增大，在800 mg/L濃度時，達(dá)到最大，但與600 mg/L和700 mg/L時的富鋅率相差不大。所以，選擇鋅質(zhì)量濃度600 mg/L為香菇菌絲體富鋅液體培養(yǎng)時適宜添加的鋅濃度。在食用菌培養(yǎng)過程中添加鋅會刺激食用菌菌絲體的生長，增加菌絲體中的鋅含量[19-24]。

2.2 香菇菌絲體富鋅液體培養(yǎng)抗氧化酶變化規(guī)律

2.2.1 富鋅培養(yǎng)香菇菌絲體超氧化物歧化酶變化規(guī)律

不同鋅質(zhì)量濃度下液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其菌絲體中SOD酶活性測定結(jié)果如表3所示。

表3 不同鋅質(zhì)量濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體SOD酶活性

從表3可見，富鋅液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其SOD酶活性明顯高于未添加鋅源的液體培養(yǎng)菌絲體中SOD酶活性。鋅質(zhì)量濃度在400～700 mg/L，菌絲體SOD酶活性呈逐漸升高的趨勢，700 mg/L以上逐漸降低。SOD酶活性在鋅質(zhì)量濃度700 mg/L時達(dá)到最高，為147.47 U/g，比未添加鋅培養(yǎng)的菌絲體SOD酶活性增大了69.23%。當(dāng)鋅質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 mg/L時，菌絲體SOD酶活性有明顯的降低，但仍然高于不添加鋅源時培養(yǎng)的香菇菌絲體，說明添加鋅能刺激香菇菌絲體的SOD酶活性升高。生物體內(nèi)的過氧化作用，主要是由活性氧及其衍生物引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)?？寡趸缚梢葬槍@些過氧化反應(yīng)發(fā)揮作用，利用氧化還原作用將過氧化物轉(zhuǎn)換為毒害較低或無害的物質(zhì)[25]。SOD 可通過歧化反應(yīng)消除O2-是生物體防護(hù)機(jī)制的中心酶，SOD 活性的增加代表 O2-的產(chǎn)生速率增加，可能還因為鋅是 SOD 的重要組成部分[26]。

在鋅質(zhì)量濃度為600 mg/L液體培養(yǎng)時，香菇菌絲體SOD酶活性隨時間變化規(guī)律，如圖1所示。

圖1 富鋅液體培養(yǎng)香菇菌絲體SOD酶活性變化規(guī)律Fig.1 SOD activity changes of Lentinus edodes mycelium in zinc accumulation liquid culture

從圖1可見，在鋅質(zhì)量濃度為600 mg/L時，對香菇菌絲體進(jìn)行富鋅培養(yǎng)，隨培養(yǎng)時間增加，菌絲體生物量逐漸增加，SOD酶活也逐漸增加，在培養(yǎng)的第9天，菌絲體SOD酶活性達(dá)到最大值，為154.31 U/g，之后呈逐漸下降趨勢。

2.2.2 富鋅培養(yǎng)香菇菌絲體過氧化物酶變化規(guī)律

不同鋅濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其過氧化物酶活性測定結(jié)果如表4所示。

表4 不同鋅濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體POD酶活性

在添加不同濃度鋅源對香菇菌絲體液體培養(yǎng)時，菌絲體中過氧化物酶活性明顯高于未添加鋅源的菌絲體過氧化物酶活性。說明添加鋅能刺激香菇菌絲體中POD酶活的增加。在鋅質(zhì)量濃度低于500 mg/L時，菌絲體過氧化物酶活性呈明顯上升的趨勢，高于500 mg/L之后，隨鋅濃度增加，POD酶活呈緩慢下降。在鋅質(zhì)量濃度500 mg/L時，達(dá)到最高值，為6.15×10-3U/g，比未富鋅培養(yǎng)增大了167.39%。POD主要功能是減輕過氧化氫對機(jī)體的傷害，其活性的應(yīng)激性變化被廣泛作為反映植物受逆境脅迫程度的一個重要指標(biāo)。鋅進(jìn)入植物組織后，脅迫植物體內(nèi)產(chǎn)生大量有害的過氧化物，因此隨著植物體內(nèi) POD酶底物濃度的增加誘使 POD活性增加[27]。對于香菇菌絲體來說，鋅同樣刺激其POD酶活的增加。

在鋅質(zhì)量濃度600 mg/L液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其POD活性隨時間變化規(guī)律如圖2所示。

圖2 富鋅液體培養(yǎng)香菇菌絲體POD酶活變化規(guī)律Fig.2 POD activity changes of Lentinus edodes mycelium in zinc accumulation liquid culture

根據(jù)圖2可知，香菇菌絲體POD酶活隨培養(yǎng)時間的增加，逐漸增大，在第9天達(dá)到高峰，為6.21×10-3U/g，之后呈下降趨勢。

2.2.3 富鋅培養(yǎng)香菇菌絲體過氧化氫酶變化規(guī)律

不同鋅質(zhì)量濃度下液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其過氧化氫酶活性測定結(jié)果如表5所示。

表5 不同鋅質(zhì)量濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體CAT酶活性

不同鋅質(zhì)量濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其過氧化氫酶活性明顯高于未添加鋅源的液體培養(yǎng)菌絲體過氧化氫酶活性。鋅質(zhì)量濃度在400～500 mg/L，菌絲體過氧化氫酶活性呈明顯上升的趨勢，在500 mg/L之后緩慢下降。在500 mg/L時，過氧化氫酶達(dá)到最高值，為147.52 U/g，比未富鋅培養(yǎng)增大了78.51%。 CAT也是抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，可以催化過氧化氫分解為分子氧和水，有效清除體內(nèi)活性氧[25]。添加鋅培養(yǎng)，同樣刺激了香菇菌絲體中CAT酶活的增加。

在鋅濃度600 mg/L液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其CAT活性隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律如圖3所示。

圖3 富鋅液體培養(yǎng)香菇菌絲體CAT酶活變化規(guī)律Fig.3 CAT activity changes of Lentinus edodes mycelium in zinc accumulation liquid culture

從圖3可見，香菇菌絲體SOD酶活性隨培養(yǎng)時間的增加逐漸增加，在第9天達(dá)到最大值，為147.92 U/g，之后呈下降趨勢。

2.2.4 富鋅培養(yǎng)香菇菌絲體丙二醛含量的變化規(guī)律

不同鋅質(zhì)量濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其MDA含量測定結(jié)果如表6所示。

表6 不同鋅質(zhì)量濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體丙二醛含量

不同鋅質(zhì)量濃度液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其丙二醛含量明顯低于未添加鋅源的液體培養(yǎng)菌絲體丙二醛含量，說明富鋅培養(yǎng)可抑制香菇菌絲體中丙二醛的產(chǎn)生。鋅濃度在400～600 mg/L菌絲體丙二醛含量呈明顯下降的趨勢，600～800 mg/L丙二醛含量逐漸上升，在800 mg/L之后緩慢下降。在600 mg/L時，菌絲體中丙二醛含量達(dá)到最低值，為4.47×10-5μmol/g，比未添加鋅培養(yǎng)的菌絲體丙二醛含量降低了66.89%。

富鋅液體培養(yǎng)香菇菌絲體，其MDA含量隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律如圖4所示。

圖4 富鋅液體培養(yǎng)香菇菌絲體丙二醛含量變化規(guī)律Fig.4 MDA content changes of Lentinus edodes mycelium in zinc accumulation liquid culture

從圖4中可以看出，從培養(yǎng)的第5天開始，香菇菌絲體中丙二醛含量隨培養(yǎng)時間的增加，就逐漸呈上升趨勢，說明菌絲體逐漸衰老，丙二醛逐漸產(chǎn)生。MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生加劇膜的損傷，會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度[25]。

3 結(jié)論

通過固體平板和液體富鋅培養(yǎng)證明香菇菌絲體具有較強(qiáng)的耐鋅和富鋅能力，低濃度鋅對香菇菌絲體的生長，有一定的促進(jìn)作用，高濃度有抑制作用，適宜鋅質(zhì)量濃度為600 mg/L。通過不同濃度富鋅液體培養(yǎng)以及同一濃度不同培養(yǎng)時間對香菇菌絲體抗氧化酶活性和丙二醛含量變化規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，與未添加鋅源的菌絲體對比，適宜濃度的富鋅培養(yǎng)可以使香菇菌絲體的SOD、POD和CAT酶活性顯著提高，使丙二醛含量下降。香菇菌絲體在培養(yǎng)的第9天時，SOD、POD和CAT的酶活性均達(dá)最大值，MDA含量達(dá)到最低值，生長的各項指標(biāo)達(dá)到最佳值。

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Effects of zinc on the growth and antioxidant enzymes ofLentinusedodesmycelium

GANG Jie，ZHANG Shuang，LIU Yao，XIE Bin，PANG Shi-lei

(Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization，Ministry of Education，Dalian Minzu University，Dalian 116600，China)

The objective of this study was to determine the growing changes and the antioxidant enzyme activities ofLentinusedodesmycelium cultured in liquid and solid zinc-rich medium supplemented with exogenous zinc. The results showed thatLentinusedodesmycelium had strong resistance to zinc and zinc-rich ability, while the low zinc concentration could promote the mycelial growth ofLentinulaedodes, and the high zinc concentration could inhibit the growth, and the optimum concentration of zinc sulfate was 600 mg/L. The activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) ofLentinulaedodesmycelium increased with the increase of zinc sulfate concentration in the range of 400 mg/L to 1 000 mg/L, and the maximum values were 147.47 U/g, 6.15×10-3U/g , 147.52 U/g, respectively. The content of malondialdehyde (MDA) decreased with the increase of zinc concentration, and then increased gradually, and the minimum content of MDA was 4.47×10-5μmol/g at a zinc concentration of 600 mg/L. SOD, POD and CAT activities ofLentinulaedodesmycelia reached the maximum value and the MDA content reached the lowest value on the 9 th day of culture, which were 154.31 U/g, 6.21×10-3U/g, 147.92 U/g and 4.18×10-5μmol/g, respectively. The optimal zinc concentration in the medium could improveLentinusedodesmycelium growth and the zinc content ofLentinusedodesmycelium, and increase the antioxidant enzyme activities.

Lentinusedodes；mycelium；zinc-accumulation；antioxidant enzymes

博士，教授(本文通訊作者，E-mail:gangjie@ dlnu.edu.cn)。

遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2015020676)；財政專項-中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項目(DC201501020301)

2017-01-23,改回日期：2017-02-15

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706024