毛跟年，周亞麗，賀磊，曹晴，王勇,2，李彥軍,2

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安，710021)2(陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安，710021)

魔芋ACE抑制肽的分離純化及活性檢測(cè)

毛跟年1*，周亞麗1，賀磊1，曹晴1，王勇1,2，李彥軍1,2

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安，710021)2(陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安，710021)

利用堿溶酸沉法從魔芋飛粉中提取魔芋蛋白，以魔芋蛋白為原料，利用堿性蛋白酶酶解制備魔芋ACE抑制肽粗品；其粗品通過超濾法除去大分子雜質(zhì)，再經(jīng)過Sephadex G-15柱層析分離，最后經(jīng)過RP-HPLC純化后得到純度較高的魔芋ACE抑制肽，并且對(duì)超濾膜進(jìn)行選擇、Sephadex G-15柱層析分離進(jìn)行條件優(yōu)化；以馬尿酸含量為指標(biāo)，紫外分光光度法測(cè)其活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：選擇規(guī)格為1 kDa超濾膜；Sephadex G-15最佳分離條件為濃度為120 mg/mL、流速為0.8 mL/min、上樣量為1.0 mL；經(jīng)過RP-HPLC純化后得到魔芋ACE抑制肽抑制率可達(dá)到92.85%?？瞻滓褐蠬ip含量為22.50 mg,反應(yīng)液中Hip含量為9.22 mg，說明魔芋ACE抑制肽抑制活性較好。

魔芋蛋白；ACE抑制肽；分離純化；活性

ACE抑制肽(angiotensin-converting enzyme inhibition，ACEI)是指血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。ACEI對(duì) ACE 活性區(qū)域結(jié)合能力較強(qiáng)，共同特點(diǎn)是與 ACE 活性部位的鋅離子結(jié)合的能力比AngI或緩激肽更強(qiáng)，而且結(jié)合上之后不易從 ACE 結(jié)合區(qū)釋放，從而阻礙ACE催化AngI 水解成 AngⅡ及催化舒緩激肽水解成為失活片段2個(gè)過程，起到降血壓的作用。與化學(xué)降血壓藥比較，具有分子質(zhì)量小，免消化、直接吸收等特點(diǎn)，更具有優(yōu)勢(shì)和廣闊的市場(chǎng)前景[1]。

目前，已經(jīng)從燕麥蛋白、玉米醇溶蛋白、牦牛乳酪蛋白[2-4]等多種蛋白中提取出ACE抑制肽，并且通過多種分離純化方法得到高純度ACE抑制肽。目前廣泛采用超濾、離子交換層析、葡聚糖凝膠層析、RP-HPLC、毛細(xì)管電泳法、大孔樹脂吸附法等，王雙等[5]應(yīng)用大孔吸附樹脂 DA201-C、HPLC、SephadexG-15凝膠對(duì)燕麥ACE抑制肽進(jìn)行分離純化，得到純度較高ACE抑制肽；王振斌[6]通過超濾法分離芝麻蛋白ACE抑制肽，結(jié)果表明分子質(zhì)量分布為 3～10 kDa 和小于3 kDa 酶解液抑制活性較好。目前，已有研究者利用魔芋飛粉為原料，通過酶解法提取和柱層析法分離純化制備出魔芋ACE抑制肽，但是其他方面有待于研究。

本文利用前期工作中優(yōu)化地制備出了魔芋ACE抑制肽粗品，研究了魔芋ACE抑制肽超濾、Sephadex G-15和RP-HPLC的分離純化工藝，并采用紫外分光光度法對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

魔芋飛粉，購(gòu)于陜西省鎮(zhèn)安縣雪櫻花魔芋公司。堿性蛋白酶(酶活力≥20 萬U/g)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；Sephadex G-15凝膠，上海源葉生物技術(shù)有限公司；HHL(馬尿酰-組氨酰-亮氨酸)，Sigma公司；ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)Sigma公司；Hip(馬尿酸)標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物技術(shù)有限公司；NaOH、硼酸、硼砂、HCl、乙腈等，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；YP802N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)，深圳市同奧科技有限公司；UV-5100紫外分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;Waters制備型液相，上?？普苌夹g(shù)有限公司；超濾系統(tǒng)，美國(guó)Pellicon；自動(dòng)部分收集器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魔芋ACE抑制肽的制備

1.2.1.1 魔芋蛋白的提取

稱取8 g魔芋飛粉，加入280 mL純凈水，攪拌均勻，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)飛粉液pH值至10，放入設(shè)定溫度為50 ℃水浴鍋中保溫反應(yīng)50 min，期間用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)，保持飛粉液的pH不變。之后4 000 r/min離心15 min，收集上清液，用1.0 mol/LHCl液將上清液調(diào)至魔芋蛋白等電點(diǎn)pH 3.8，靜置30 min，再在4 000 r/min下離心15 min，棄去上清液收集沉淀，用5倍的水對(duì)沉淀進(jìn)行3次水洗后收集沉淀。將得到的蛋白質(zhì)沉淀在-60 ℃下冷凍干燥24 h，即得魔芋蛋白質(zhì)。根據(jù)公式得魔芋蛋白的平均提取率為60%。蛋白質(zhì)提取率計(jì)算公式為：

蛋白質(zhì)提取率/%=(提取的蛋白質(zhì)含量/飛粉中總蛋白的含量)×100

(1)

1.2.1.2 魔芋ACE抑制肽的制備工藝

配制5份相同濃度魔芋蛋白質(zhì)溶液，放在恒溫磁力攪拌器上，分別加入一定量的堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、膠原蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，以ACE抑制率和水解度為指標(biāo)，得出堿性蛋白酶為最佳用酶。堿性蛋白酶的酶解條件為pH 10、底物濃度3%、加酶量5 000 U/g、酶解溫度46 ℃，酶解時(shí)間3 h。然后高溫條件下滅酶10 min,待酶解液冷卻至室溫，將酶解液pH值調(diào)至魔芋蛋白等電點(diǎn)，在10 000 r/min下離心20 min后收集上清液，測(cè)其ACE抑制率。5種蛋白的ACE抑制率和水解度測(cè)定結(jié)果見圖1。

A-菠蘿蛋白酶；B-堿性蛋白酶；C-風(fēng)味蛋白酶；D-復(fù)合蛋白酶；E-膠原蛋白酶圖1 不同蛋白酶酶解后水解度和ACE抑制率測(cè)定結(jié)果Fig.1 Hydrolysis degree and ACE inhibition rate after enzymatic hydrolysis of different proteases

1.2.1.3 ACE抑制率的測(cè)定[7]

取75 μL、HHL(馬尿酰-組氨酰-亮氨酸)與25 μL、ACE抑制劑(多肽液)充分混勻。在37 ℃水浴鍋中溫育5 min,加入25 μL、25 mu/mL ACE硼酸鹽溶液，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)40 min。結(jié)束后加入200 μL、1.0 mol/L HCl液破壞反應(yīng)環(huán)境，終止反應(yīng)進(jìn)程。然后于各試管中加入乙酸乙酯1.7 mL，使其混勻；吸取1.2 mL乙酸乙酯層于另一試管中，放入100 ℃烘箱中，揮發(fā)溶劑40 min。取出冷卻后加入去離子水3 mL，混勻后在波長(zhǎng)228 nm下測(cè)定其吸光度。

(2)

式中：A1,ACE抑制肽和ACE都存在溶液的吸光度值；A2,不加ACE抑制肽存在溶液的吸光度值；A3,ACE與HHL存在空白溶液的吸光度值。

1.2.2 超濾

超濾過程：將上述制備的魔芋蛋白酶解液用規(guī)格為10、5和1 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，收集3種組分：Ⅰ(M<10 kDa)、Ⅱ(M<5 kDa)、Ⅲ(M<1 kDa)，各個(gè)組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，再測(cè)各個(gè)組分的ACE抑制率，選出ACE抑制率最高的組分進(jìn)行下一步分離純化。確定超濾膜：

以膜通量和 ACE 抑制率為參考指標(biāo)對(duì)3種不同規(guī)格的超濾膜進(jìn)行篩選，膜通量的計(jì)算公式如下

(3)

式中：V，透析液的體積，L；T，取樣時(shí)間，h；A，膜面積，m2。

1.2.3 Sephadex G-15柱層析

采用Sephadex G-15對(duì)超濾所得分子質(zhì)量小于1 kDa的組分進(jìn)一步進(jìn)行分離，為了達(dá)到最好的分離效果，本實(shí)驗(yàn)探討了上樣濃度、流速和上樣量對(duì)分離效果的影響。

將處理好的Sephadex G-15凝膠裝入1.6 cm×30 cm玻璃層析柱。洗脫劑為超純水，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每管收集5.0 mL，結(jié)合每管在220 nm[8]處的吸光值，考察不同上樣濃度、流速和上樣量對(duì)分離效果的影響，確定最佳分離條件。將最佳分離條件下不同峰段收集的組分測(cè)ACE抑制率，ACE抑制率最高組分濃縮后冷凍干燥，進(jìn)一步進(jìn)行純化。

1.2.3.1 不同上樣濃度對(duì)分離效果的影響

上樣量為1.0 mL，控制流速為0.8 mL/min，設(shè)定不同上樣濃度為：80、120、160 mg/mL?？疾觳煌蠘訚舛葘?duì)分離效果的影響，確定最適上樣濃度。

1.2.3.2 不同流速對(duì)分離效果的影響

上樣量為1.0 mL，控制上樣濃度為120 mg/mL，設(shè)定不同流速為：0.6、0.8、1.0 mL/min。考察不同流速對(duì)分離效果的影響，確定最適流速。

1.2.3.3 不同上樣量對(duì)分離效果的影響

流速為0.8 mL/min，控制上樣濃度為120 mg/mL，設(shè)定不同上樣量為：0.5、1.0、1.5 mL?？疾觳煌蠘恿繉?duì)分離效果的影響，確定最適上樣量。

1.2.4 RP-HPLC

經(jīng)Sephadex G-15分離后得到的ACE抑制率最高組分溶于水,配成20 mg/mL的溶液,利用RP-HPLC[9]進(jìn)一步純化,收集各洗脫峰經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥后得到各分離組分,進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定，抑制率最高組分測(cè)其體外抑制活性。

制備型高效液相Waters2489，色譜柱C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量5 mL；樣品濃度：20 mg/mL；流速5 mL/min；洗脫條件：流動(dòng)相A-乙腈，B-超純水，0～10 min:20%A+80%B、10～15 min:40%A+60%B、15～20min:20%A+80%B。

1.2.5 魔芋ACE抑制肽體外活性檢測(cè)

1.2.5.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

用pH值為8.3的硼酸緩沖液配制5 mmol/L的HHL溶液,用超純水配制1 mmol/L的Hip,然后在190～350 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定Hip的檢測(cè)波長(zhǎng)。由圖2可得到 Hip標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)228 nm 處有最大吸收峰。在228 nm 波長(zhǎng)下測(cè)0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL Hip標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到Hip標(biāo)準(zhǔn)品的曲線方程為：y=0.222 6x-0.001 5，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，線性關(guān)系良好。由此可得出反應(yīng)液和空白液中Hip濃度，并計(jì)算出含量，檢測(cè)出魔芋ACE抑制肽的抑制活性。

圖2 Hip檢測(cè)波長(zhǎng)的確定Fig.2 Hip detection wavelength determined

1.2.5.2 魔芋ACE抑制肽體外活性檢測(cè)

采用紫外分光光度法檢測(cè)魔芋ACE抑制肽的體外活性。

反應(yīng)液：150 μL HHL溶液,加入50 μL經(jīng)分離純化后魔芋ACE抑制肽溶液,在37 ℃下溫育5 min后加入50 μL ACE溶液，溶液開始反應(yīng),在37 ℃條件下反應(yīng)40 min后，加入200 μL、1.0 mol/L HCl中止反應(yīng),得到反應(yīng)液；空白對(duì)照液：用50 μL 硼酸鹽緩沖液替換魔芋ACE抑制肽溶液制備反應(yīng)液，即空白對(duì)照液。在228 nm檢測(cè)反應(yīng)液和空白對(duì)照液的吸光度值，并計(jì)算它們各自的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋ACE抑制肽的分離純化

2.1.1 超濾

2.1.1.1 超濾膜的確定

由圖3、圖4可知，用截留分子質(zhì)量分別為10、5、1 kDa 3種超濾膜進(jìn)行分離，膜通量的大小隨著截留分子質(zhì)量的增大而增加，當(dāng)超濾膜的截留分子質(zhì)量達(dá)到 10 kDa時(shí)，此時(shí)的膜通量達(dá)到最大值 7.5 L/(m2·h)。相反，ACE抑制率的大小則隨著截留分子量的增大呈現(xiàn)出減小的趨勢(shì)，當(dāng)超濾膜截留分子質(zhì)量大小為 1 KDa 時(shí)，ACE 抑制率達(dá)到最大值 85.30%。ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)較接近，分子質(zhì)量較小，所以選擇截留分子質(zhì)量的大小為1 kDa的超濾膜。通過規(guī)格為1 kDa的超濾膜超濾后，將得到組分冷凍干燥，分子質(zhì)量大于1 kDa和小于1 kDa 2種組分比例分別是25.10%和74.90%。

圖3 超濾膜分子質(zhì)量大小對(duì)膜通量的影響Fig.3 The molecular weight of ultrafiltration membrane flux membrane

圖4 超濾膜分子質(zhì)量大小對(duì) ACE 抑制率的影響Fig.4 Ultrafiltration membrane molecular size of ACE inhibition rate

2.1.2 Sephadex G-15柱層析

樣品濃度對(duì)分離效果有較大影響，由圖5可知，當(dāng)上樣濃度為80 mg/mL和120 mg/mL時(shí)可得到3個(gè)洗脫峰，當(dāng)濃度達(dá)到160 mg/mL時(shí)，得到,2個(gè)洗脫峰。但是上樣濃度為80 mg/mL和160 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)拖尾，并且分離效果不明顯。這可能是因?yàn)闃悠窛舛冗^大會(huì)導(dǎo)致黏度增大，而使層析分辨率下降，樣品濃度過小分子質(zhì)量黏度減小，流動(dòng)性較大，導(dǎo)致洗脫峰分不開。因此，上樣濃度選用120 mg/mL。

A-濃度為 80mg/mL；B-濃度為120mg/mL；C-濃度為160 mg/mL圖5 樣品濃度對(duì)分離效果的影響Fig.5 Sample concentration effects on the separation

合適的流速是凝膠柱層析分離的重要條件。由圖6可知，當(dāng)洗脫流速?gòu)?.6 mL/min增加到0.8 mL/min時(shí)，分離效果明顯，3個(gè)洗脫峰隨流速增大而分離效果較好。當(dāng)流速達(dá)到1.0mL/min時(shí)，僅有2個(gè)洗脫峰且峰形不佳。流速過大時(shí)，ACE抑制肽不能得到較好分離。因?yàn)槟z柱層析的分離主要取決于分子擴(kuò)散進(jìn)入凝膠的機(jī)會(huì)，流速過快一些分子來不及分開就被洗脫出來，速度較小時(shí)被分離的組分因擴(kuò)散又混合在一起，因此，選擇洗脫流速為 0.8 mL/min為分離最佳流速。

A-流速為0.6mL/min；B-流速為0.8mL/min；C-流速為1.0mL/min圖6 流速對(duì)分離效果的影響Fig.6 Flow rate effects on the separation

上樣量一般為凝膠床的1%～4%，上樣量也直接影響分離效果。由圖7可知，上樣量0.5 mL時(shí)，可得到兩個(gè)洗脫峰，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，上樣量太少、實(shí)驗(yàn)效率低。當(dāng)上樣量為1.5 mL時(shí)，洗脫峰明顯的僅有1個(gè)，而且峰形較寬，這是因?yàn)槟z顆粒的吸附容量已經(jīng)達(dá)到飽和。當(dāng)上樣量為1 mL時(shí)，出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰且峰形較好。由峰形和洗脫峰2個(gè)指標(biāo)考慮，最佳上樣量為1 mL。

A-上樣量為0.5 mL；B-上樣量為1.0 mL；C-上樣量為1.5 mL圖7 上樣量對(duì)分離效果的影響Fig.7 Sample volume effects on the separation

由圖7-B可見，經(jīng)過Sephadex G-15凝膠柱層析分離后，分子質(zhì)量為小于1 kDa的組分被分離為1、2和3三個(gè)組分。分別收集這3個(gè)組分冷凍干燥，并進(jìn)行ACE抑制率的測(cè)定，其中組分2的抑制活性較大，可達(dá)到90.20%，對(duì)該組分進(jìn)一步進(jìn)行純化。

2.1.3 RP-HPLC

由圖8可知，在RP-HPLC的C18柱上進(jìn)一步純化分離出2個(gè)主要肽峰，純化得到的的2個(gè)主要肽峰1和2有較好的分離度,分別收集這2個(gè)肽峰,冷凍干燥后測(cè)定各峰ACE抑制率，其中峰2抑制率最高,其ACE抑制率為92.85%。并對(duì)組分2進(jìn)行進(jìn)一步的抑制活性檢測(cè)。

圖8 RP-HPLC純化魔芋ACE抑制肽圖譜Fig.8 RP-HPLC purifiedkonjac ACE inhibitory peptides Atlas

2.2 魔芋ACE抑制肽體外活性檢測(cè)

以HHL為AngI的模擬底物，ACE可催化分解HHL生成馬尿酸，加入ACE抑制肽后，與ACE活性區(qū)域作用,ACE活性受到抑制,于是阻止了ACE對(duì)HHL的催化分解作用,導(dǎo)致馬尿酸的生成量減少。如圖9，空白液中的馬尿酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于反應(yīng)液中馬尿酸的含量，其含量大約是反應(yīng)液的3倍。說明魔芋ACE抑制肽對(duì)HHL分解產(chǎn)物Hip具有抑制作用，魔芋ACE抑制肽活性較好。

圖9 魔芋ACE抑制肽抑制活性檢測(cè)結(jié)果Fig. Konjac ACE inhibitory peptide inhibitory activity test results

3 小結(jié)

本研究將魔芋飛粉通過堿溶酸沉法提取魔芋蛋白，以魔芋蛋白為原料經(jīng)過堿性蛋白酶酶解，得到魔芋ACE抑制肽粗品；通過超濾除去大分子雜質(zhì)，分子質(zhì)量為1 kDa的超濾膜分離效果較好；然后用Sephadex G-15凝膠柱層析進(jìn)一步分離，將分子質(zhì)量小于1 kDa的多肽區(qū)段分離為1、2和3三個(gè)組分，測(cè)3個(gè)組分ACE抑制率，其中組分2的抑制活性最高達(dá)到90.20%；最后經(jīng)過RP-HPLC純化，得到兩個(gè)肽峰1和2，其中組分2的抑制活性最高，達(dá)到92.85%。利用紫外分光光度法測(cè)純品的抑制活性，魔芋ACE抑制肽對(duì)HHL分解產(chǎn)物Hip具有較強(qiáng)抑制作用，說明魔芋ACE抑制肽活性較好。本研究以魔芋蛋白質(zhì)為原料，經(jīng)過分離純化工藝得到純度較高的魔芋ACE抑制肽，既拓寬了魔芋ACE抑制肽的分離純化方法，也為魔芋飛粉的開發(fā)利用及生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品開辟了一條新途。

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Separation and purification of konjac ACE inhibitory peptides and active substance detection

MAO Gen-nian1*,ZHOU Ya-li1, HE Lei1, CAO Qing1，WANG Yong1,2, LI Yan-jun1,2

(School of Food and Biological Engineering ,Shaanxi Unversity of Science & Technology, Xi’an 710021,China)2(Shaanxi Research Institute of Agricultural Products Processing Technology,Xi'an 710021,China)

Protein was extracted from konjac powder by alkali extraction and acid precipitation method; konjac protein is material, konjac ACE inhibitory peptides crude were prepared by alkaline hydrolysis protease on konjac protein; its crude macromolecular impurities were removed by ultrafiltration, Sephadex G-15 column chromatography, and RP-HPLC purification. Highly purified konjac ACE inhibitory peptide was obtained. The ultrafiltration, Sephadex G-15 column chromatographic separation conditions were optimized; hippuric acid was used as the index and Spectrophotometric was used to determine the activity. The results showed that an ultrafiltration membrane has a molecular weight of 1 kDa, The optimal separation condition for Sephadex G-15 was 120 mg/mL, flow rate was 0.8 mL/min, sample volume was 1.0 mL. After RP-HPLC purified, konjac ACE inhibitory peptide inhibition rate was reached to 92.85%. Blank solution Hip content was 22.50 mg, the reaction mixture Hip content was 9.22 mg, which indicates that konjac ACE inhibitory peptide inhibitory activity was better.

konjac protein; ACE inhibitory peptides; separation and purification;activity

學(xué)士，教授(本文通訊作者,E-mail：maogn@sust.edu.cn)。

陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-167)；西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目(NC1405(3))；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2015NY010、2016NY-142)；陜西省協(xié)同創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2016XT-21)

2016-09-28，改回日期：2016-11-23

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706027