張 媛，丁樹哲

ZHANG Yuan1，DING Shu-zhe2

運動性骨骼肌內質網應激與線粒體功能調控

張 媛1，丁樹哲2

ZHANG Yuan1，DING Shu-zhe2

內質網（ER）是真核細胞中Ca2+貯存庫，負責調節(jié)蛋白質合成、合成后加工、折疊和聚集的細胞器，其具有極強的內穩(wěn)態(tài)體系，當細胞穩(wěn)態(tài)受外界刺激因素改變時可導致內質網功能內穩(wěn)態(tài)失衡，形成內質網應激（ER stress，ERs）。由于線粒體與內質網存在內質網-線粒體聯接區(qū)域（mitochondrial associated membranes，MAM）結構以及在功能方面的相互作用，使得線粒體對ERs非常敏感，ERs可通過改變代謝物的轉移，如Ca2+，或通過應激反應信號通路，將信息傳遞至線粒體，直接影響線粒體功能，包括：代謝酶活性、呼吸鏈功能及ATP生成、線粒體融裂、DNA生物發(fā)生、質量控制等方面。骨骼肌ERs的現象首先被發(fā)現存在于一些肌病中，隨后的研究提示，運動訓練也是誘發(fā)骨骼肌ERs的因素之一，運動訓練可能在調節(jié)骨骼肌線粒體功能、優(yōu)化ERs水平、維持細胞蛋白穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，其具體分子機制有待進一步研究。

骨骼?。粌荣|網應激；線粒體；運動訓練

前言

真核細胞含有多個細胞器以及被膜包圍的間隙，大多數蛋白在胞漿內質網上合成，大約一半以上需要通過轉移或穿過至少一層細胞膜到達它們的目的地。以線粒體為例，99%的線粒體蛋白需借助存在于線粒體膜上的蛋白輸入機制（PIM，Protein Import Machinery）進入線粒體不同區(qū)域發(fā)揮作用［11］。在諸多對影響線粒體PIM功能的分子機制研究中，除發(fā)現PIM自身組件蛋白表達水平可影響線粒體蛋白輸入效率外，另一重要因素亦值得思考，即線粒體內、外蛋白穩(wěn)態(tài)環(huán)境，而這一穩(wěn)態(tài)環(huán)境的維持與內質網功能及狀態(tài)密切相關。研究表明，線粒體與內質網緊密聯系，兩者的結合區(qū)域稱為內質網-線粒體聯接膜（MAM， mitochondrial associated membranes），MAM結構復雜并含有大量功能蛋白，如伴侶蛋白GRP75、磷脂合成酶、線粒體融合蛋白Mfn2等，這些蛋白可通過調節(jié)基礎代謝物（脂肪）或信號物質（鈣）的雙向供應以維持和控制線粒體功能，甚至決定細胞命運［38］（圖1-C）。內質網是真核細胞中Ca2+貯存庫，也是調節(jié)蛋白質合成及合成后加工、折疊和聚集的場所，是一種重要的細胞器，其具有極強的內穩(wěn)態(tài)體系，當細胞穩(wěn)態(tài)受外界刺激因素改變時，可導致內質網功能的內穩(wěn)態(tài)失衡，形成內質網應激（ERs，Endoplasmic Reticulum stress）［12］。由于線粒體與內質網在結構與功能方面的相互作用，使得線粒體對ERs非常敏感，ERs可通過改變代謝物的轉移，如Ca2+，或通過應激反應信號通路，將信息傳遞至線粒體，直接影響線粒體功能［55］。

1 內質網

內質網（ER）是細胞內負責蛋白質合成與折疊的細胞器，在真核細胞中維持細胞正常功能，大約有1/3的細胞蛋白質需通過內質網上相關核糖體合成。ER由連續(xù)的膜結構構成，分為粗面ER、光面ER、傳統(tǒng)ER以及核膜，基于細胞在融合、分裂、延伸、膜降解等方面的需求，ER在結構上做相應的改變。粗面ER大多較薄，表面附著核糖體，是合成蛋白的場所，光面ER大多為管狀結構，參與糖原和脂類的合成，是與其它細胞器交流的主要區(qū)域。ER對Ca2+內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調節(jié)作用在細胞信號通路、細胞適應及存活等方面及其重要。此外，ER與其它細胞器，包括高爾基體、細胞膜、細胞核以及線粒體之間存在精巧而復雜的關聯性［16、22、51］。近幾年的大量研究表明，ER與線粒體之間關系密切，尤其是ER對細胞應激的應答反應對調節(jié)線粒體生物活性及功能具有重要作用，進而影響細胞代謝與存活質量。

2 內質網穩(wěn)態(tài)

細胞穩(wěn)態(tài)改變可干擾內質網功能而誘發(fā)內質網應激（ERs），導致機體出現諸多生理、病理性改變。ERs將伴隨激活兩種適應性機制：未折疊蛋白反應（UPR，Unfolded Protein Response）或內質網超負荷反應（EOR，Endoplasmicreticulum Overload Response）。UPR通過激活內質網膜上相關蛋白，一方面，提高ER對蛋白的折疊能力，另一方面，降低蛋白翻譯過程，緩解蛋白合成負荷，進而阻止ER未折疊蛋白的進一步堆積。EOR也是機體自我保護性反應之一，指正確折疊蛋白在內質網上過度積聚時引起的內質網超負荷，從而導致一系列信號物質的激活。細胞在以上兩種適應性機制的調節(jié)作用下，ERs狀態(tài)得以緩解，相反，如果細胞在ERS環(huán)境中不能及時通過UPR或EOR途徑進行自我適應，將最終走向凋亡［16］。

由于ERS常導致內質網內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的蓄積，引起UPR，所以，一般用參與UPR的標志性分子來提示ERs的發(fā)生。如圖1-A所示：哺乳動物細胞內質網膜上存在3種未折疊蛋白感應跨膜蛋白，分別為IRE1α（inositol-requiring protein 1 alpha），ATF6 （activating transcription factor 6） 以及PERK （eukaryotic translation initiation factor-2-alpha kinase）（圖1-A）［33，34，42］。當3個跨膜蛋白的管腔域在ER固有伴侶蛋白—免疫球蛋白重鏈結合蛋白/78Da葡萄糖調節(jié)蛋白（Bip/GRP78）存在時處于與膜結合狀態(tài)，其蛋白保持失活狀態(tài)。而當ER中未折疊蛋白積累到一定程度，Bip將與上述3種跨膜蛋白暴露部位的疏水域結合，使其激活［2］。其一、激活后的ATF6將轉移至細胞核與UPR相關基因的啟動子相結合發(fā)揮作用；其二、活化的PERK可使真核翻譯起始因子2-α（eIF2α）磷酸化，抑制蛋白翻譯過程，同時優(yōu)先翻譯一些特殊蛋白；其三、IRE1α被激活后將通過對X盒結合蛋白1（XBP-1）mRNA的加工，使其編碼相關轉錄因子從而促進參與ER內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的相關基因表達［4，10，51］。綜上所述，以上3個信號通路的激活將分別作用于：1）降低蛋白翻譯過程，緩解蛋白折疊負荷；2）提高內質網蛋白折疊能力；3）降解未折疊蛋白等3個方面，最終緩解內質網蛋白負荷。同樣，當細胞無法通過UPR途徑恢復內質網蛋白穩(wěn)態(tài)，細胞將走向凋亡［23］。

3 內質網與線粒體

3.1 內質網與線粒體途徑細胞凋亡

線粒體是真核細胞中普遍存在的最重要的細胞器之一，同時也是機體自由基產生和清除的重要器官，在細胞代謝過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。此外，線粒體對細胞死亡過程的調節(jié)至關重要，包括細胞凋亡與細胞壞死。細胞凋亡有兩個途徑，其中，細胞內凋亡途徑的起始事件為線粒體內膜（IMM）兩側膜電位急劇下降，進而誘發(fā)線粒體內促凋亡因子釋放，如細胞色素C［36］。線粒體通透性轉換孔（MPTP）是線粒體內促凋亡因子得以釋放的必經之路（圖1-B），當ERs嚴重延長超過UPR的適應性反應時，細胞將啟動凋亡程序，其中具體的分子信號通路并未完全闡明。

3.2 內質網-線粒體聯接區(qū)域

ER與線粒體聯接區(qū)域（MAM）最初被認為是線粒體區(qū)域含有ER代謝雜質的一個標志，但一些前沿的研究發(fā)現，這一區(qū)域的膜及內腔分子成分能夠相互混合與交換（圖1-C）。MAM約占整個線粒體外膜區(qū)域（OMM）的20%，參與內質網小管融合［9］、線粒體分布［43］以及細胞器形態(tài)變化的諸多蛋白質均為MAM成員或與之關聯。例如：胞漿伴侶蛋白GRP75在ER表面鈣通道IP3R與OMM的VDAC之間形成結構上的鏈接，ER-線粒體間隙富含鈣結合ER伴侶鈣聯蛋白［53］。此外，MAM區(qū)域還包括線粒體融合蛋白（Mfn-2）［15］、伴侶蛋白、分類蛋白和其它酶類物質，如磷脂合成酶，直接調節(jié)脂肪合成與轉運［22］，線粒體與ER之間的脂質交換發(fā)生在特定的結合位點，從而促使脂質通過疊合翻動或其它機制從一側直接轉移至另外一側（圖1-D）。

3.3 內質網應激與線粒體功能

ER與線粒體在結構與功能方面的相互作用，使得線粒體對ERs非常敏感。ERs可通過改變代謝物的轉移，如Ca2+［14］，或通過應激反應信號通路，將信息傳遞至線粒體，直接影響線粒體功能：包括線粒體代謝酶活性、呼吸鏈功能及ATP生成、線粒體融裂、線粒體DNA生物發(fā)生、ROS生成、線粒體質量控制等方面［55］。基于細胞應激產生的程度，由ER傳遞至線粒體的應激信號可最終影響細胞存活質量。在ER應激的早期適應性階段，ER-線粒體交流增強，Ca2+在兩個細胞器之間轉運增加，進入線粒體的Ca2+流增加［5，30］，線粒體中受Ca2+調節(jié)，并參與TCA循環(huán)中的脫氫酶活性改變，從而促進線粒體代謝，提高線粒體呼吸及ATP生成。然而，若長期處于ERs將對線粒體代謝產生負面影響，降低線粒體呼吸，減弱細胞ATP水平［5、35］導致內質網中Ca2+儲備下降，線粒體內Ca2+含量增加［50，54］最終使線粒體分裂并開放線粒體通透性轉換孔（MPTP），開啟細胞內凋亡信號通路導致細胞凋亡。對于不同的細胞類型，變化的ER應激狀態(tài)還將影響其它線粒體功能，包括線粒體DNA生物發(fā)生［25］，呼吸鏈亞基的轉錄水平［35］以及影響線粒體ROS等方面。近期研究發(fā)現，Bak－/－Bax－/－造血干細胞經過24 h ERs誘導劑衣霉素處理后，細胞UPR將持久性被激活，同時伴隨線粒體代謝功能嚴重下降，提示，線粒體代謝功能受損是造成ER應激關聯性細胞死亡的潛在因素［56］。因此，在ERs狀態(tài)下，線粒體-ER相互作用為細胞能量調節(jié)提供保障，使細胞得以適應［6］。

圖1 內質網與線粒體的關聯性 （引自：Bravo R. Curr Mol Med，2013［7］）Figure 1. The Relationship between Endoplasmic Reticulum and Mitochondria

3.4 內質網應激與線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)

線粒體內膜及基質中含有許多特殊伴侶蛋白分子，以確保線粒體蛋白折疊及復合物組裝的高效性［11，29］，如基質Hsp60、mtHsp70伴侶蛋白。線粒體基質中ClpXP和LON均為AAA蛋白酶，主要負責降解錯誤折疊的水溶性蛋白，其中LON是線粒體蛋白質穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子，在線粒體生物代謝的多個方面發(fā)揮重要作用，包括受損線粒體蛋白的降解［1-3］、電子傳遞鏈復合物IV的組裝［21，27］、降解線粒體轉錄因子TFAM調節(jié)mtDNA轉錄與復制等［39］。當細胞處于中度應激狀態(tài)時，線粒體需通過蛋白輸入、折疊以及水解等途徑維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)環(huán)境。UPR信號通路之一PERK激酶的激活，可在ER應激狀態(tài)下誘導線粒體LON表達［24］。此外，線粒體非折疊蛋白反應（UPRmt）是維持線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)的重要機制［37，40，41］。UPRmt被激活是細胞內部失調的一種征兆，細胞將通過這一機制維持正常的線粒體功能。正常條件下，轉錄因子ATFS-1被輸入線粒體，而后在線粒體基質中被LON蛋白酶降解，當UPRmt被激活時，ATFS-1輸入線粒體受阻，在細胞質中積累到一定程度后被輸入至細胞核，進入細胞核的ATFS-1將轉錄激活UPRmt相關基因，調節(jié)線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)。

3.5 內質網應激與線粒體質量控制

細胞內線粒體數量處于連續(xù)變化狀態(tài)，線粒體質量控制將通過自噬作用識別并篩選排除受損線粒體。ER應激誘發(fā)大量線粒體功能損傷可通過線粒體融合、分裂的質量控制途徑得以緩解，線粒體融合既通過內容物的混合更新大量功能損傷的線粒體，線粒體融合蛋白也可與ER相互作用，促進代謝交換從而提高線粒體功能［13，59］。另一方面，線粒體分裂使細胞分離出功能損傷的線粒體，一旦得以分離，這些線粒體即通過線粒體自噬途徑被泛素化標記進而降解。線粒體自噬需要一系列自噬相關特異蛋白，如BNIP3、NIX以及泛素連接酶Parkin等基因， Parkin可選擇性募集受損線粒體，使其通過OMM蛋白的泛素化被標記而后降解。ERs時，Parkin可能通過PERK途徑被上調，進而增強ER-線粒體相互作用，從而滿足細胞器內Ca2+交換與線粒體生物合成，相反，Parkin缺失將減少ER-線粒體結合，標志ER-線粒體結合區(qū)存在缺陷［8，52］。Parkin在ERs時發(fā)揮的諸多作用還包括，參與一些特異性底物被泛素化標記后進行蛋白酶體降解的過程、參與線粒體自噬清除受損線粒體以及增強應激環(huán)境下細胞生理代謝水平等［57］。

4 骨骼肌內質網應激的誘發(fā)因素

4.1 病理因素

蛋白質聚集是導致蛋白質錯誤折疊或誘發(fā)蛋白結構變異性疾病的最常見因素，這類疾病大多為精神性系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森綜合征及亨廷頓氏舞蹈癥等，越來越多的研究表明，闡明這些疾病伴隨的ERs機制對未來預防與治療此類疾病具有重大意義［46］。此外，內質網應激現象在與物質代謝相關組織中，如胰島、肝臟［47］、脂肪等，已得到廣泛研究［26，28］。盡管事實上骨骼肌在很大程度上影響機體葡萄糖利用，進而與許多代謝性疾病密切相關，包括糖尿病、肥胖癥等，然而，與其它代謝器官相比，對骨骼肌內質網應激的研究一直被忽視。骨骼肌雖具有有限的分泌功能，但因骨骼肌含有大量特異性ER網狀結構，即肌質網（SR），加之在維持SR管腔Ca2+濃度穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，骨骼肌ERs的現象首先被發(fā)現存在于一些肌病中，如I型強直性肌營養(yǎng)不良癥、包涵體肌炎等。肌病患者的肌肉樣本中ER應激誘導伴侶蛋白GRP94、鈣網織蛋白表達顯著增高，以促進肌肉的再合成［26，28］。因此，了解骨骼肌ER/SR應激機制在健康、病理肌肉生理中的作用顯得尤為重要。

4.2 運動訓練

內質網應激機制是骨骼肌在應對內環(huán)境變化時所出現的諸多適應性調節(jié)機制之一，這一過程可直接影響蛋白合成從而調節(jié)肌肉質量。那么，運動訓練或肌肉收縮是否引發(fā)骨骼肌ERs？一項對8名男子經過200 km長跑前后肌肉活檢研究表明，這種極限運動的運動負荷可激活內質網應激通路［31］，骨骼肌Bip和剪切的X盒結合蛋白1表達顯著上調。同樣是過度訓練，近期一項研究過度上、下坡跑及無坡度跑訓練8周后趾長伸肌、比目魚肌中ER應激相關基因變化情況，發(fā)現：過度下坡跑訓練8周后，不同類型肌纖維中IRE-1、PERK、真核起始因子α磷酸化水平均顯著增高，而在運動后2周時間均恢復正常，其它組別：過度上坡跑及無坡度跑模型僅對比目魚肌的ERs蛋白有顯著影響［48］。提示：極限過度運動可顯著激活ER應激相關信號通路，這種激活可能對肌肉造成不同程度的損傷或病理狀態(tài)，即部分解釋了過度訓練對機體帶來的負面影響，當然，這種變化將在恢復期中逐漸消失，其中的分子機制有待深入研究。

耐力訓練是研究骨骼肌ER應激機制的一種常見運動模型，在采用耐力訓練模型研究骨骼肌內質網應激的過程中，一些研究結果提示，內質網應激信號通路的激活可能與線粒體生物發(fā)生存在某種關聯。Spiegelman BM研究小組2011年對PGC-1α特異性基因敲除鼠的研究報道中，充分證實了UPR在運動訓練誘發(fā)骨骼肌適應性改變中的重要作用，研究發(fā)現，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α（PGC-1α）可通過輔激活ATF6α調節(jié)肌管細胞與骨骼肌UPR，而PGC-1α在調節(jié)運動性骨骼肌線粒體生物發(fā)生中的作用已得到充分證實［58］。另一項研究，Kim K等人通過不同運動強度的實驗模型，檢測其對大鼠骨骼肌ERs相關基因的影響，發(fā)現：經過5周的跑臺訓練，高強度運動組（跑速34 m/min）Bip、ATF4及CHOP等基因表達水平均顯著低于對照組及低強度運動組（跑速20 m/min），同時，PGC-1α mRNA 表達水平及線粒體解偶聯蛋白3（UCP3）水平顯著增高［32］。提示：較高運動強度能夠在誘發(fā)線粒體生物發(fā)生的同時降低ER應激水平，緩解細胞應激狀態(tài)。

此外，有研究提出，骨骼肌ER應激是導致肌肉質量減少的潛在誘因，一方面，ER應激可直接導致肌細胞凋亡，另一方面，骨骼肌ERs可抑制蛋白合成代謝雷帕霉素靶蛋白復合體（mTORC1）信號通路，間接影響肌肉質量。隨著年齡的增長，UPR相關基因表達下調，將造成ER處于高水平應激狀態(tài)，因此，適宜的運動訓練可上調UPR相關基因，緩解ERs水平，是維持肌肉質量調節(jié)全身代謝水平的新途徑［20］。有研究表明，力量訓練也可誘發(fā)骨骼肌ER應激，Ogborn DI等人分別對青年組（21歲左右）和老年組（70歲左右）進行1組10次，共4組75%最大力量腿部推蹬和伸展力量訓練，運動訓練后3、24、48 h肌肉活檢取大腿股外側肌，研究發(fā)現，力量訓練通過激活ATF6、IRE1α通路誘發(fā)ERs，而PERK通路及CHOP基因表達并不變化，這些現象不受年齡因素的影響［45］。綜上所述，運動對骨骼肌ERs的誘發(fā)機制十分復雜，其不但與運動強度、運動負荷、運動方式密切相關，而且還可能受到鄰近細胞器功能狀態(tài)的影響。

4.3 其它因素

營養(yǎng)過剩或不足也是誘發(fā)骨骼肌ERs的因素，有研究表明，小鼠在經過6周高脂膳食（膳食中含70%脂類與不足1%的糖類）喂養(yǎng)后，其比目魚肌、脛骨前肌肉BiP、IRE1α表達顯著增高，此研究還發(fā)現，棕櫚酸可誘導C2C12肌細胞發(fā)生UPR，同時降低mTORC1的活性［17－19］。相反，研究發(fā)現：小鼠分別饑餓1、2、3天后脛骨前肌和比目魚肌的CHOP及eIF2α表達無顯著變化，然而，2、3天饑餓使小鼠脛骨前肌BiP表達水平降低［44］。另一方面，細胞水平的研究也發(fā)現氧化應激環(huán)境與ER的關系，C2C12細胞在200μmol H2O2環(huán)境處理4、17 h后BiP水平顯著增高，ERs激活UPR的3個信號通路呈現不同的變化趨勢：其中，PERK-ATF4-CHOP信號通路激活效果最顯著，IRE1α-XBP1s通路次之，ATF6信號通路幾乎無變化［49］。此外，衣霉素、毒胡蘿卜素是體外實驗中常用的ERs激活劑。

5 小結

內質網與線粒體在結構與功能方面的相互作用使得線粒體對ERs非常敏感。由于UPRER機制的存在，適度ER應激狀態(tài)并非對細胞造成損害，ERs可通過改變代謝物的轉移，如Ca2+，或通過應激反應信號通路，將信息傳遞至線粒體，調節(jié)線粒體功能（圖2）。

圖 2 正常及ERs狀態(tài)下的線粒體與內質網Figure 2. Mitochondria and Endoplasmic Reticulum under Normal and ER Stress

因此，在適度ERs狀態(tài)下，線粒體-ER相互作用為細胞能量調節(jié)提供保障，使細胞得以適應。相反，當細胞處于重度ERs狀態(tài)，即錯誤蛋白聚集水平超過UPRER調節(jié)蛋白穩(wěn)態(tài)能力時，ERs將導致線粒體受損，細胞凋亡。 運動訓練作為誘發(fā)骨骼肌ERs的因素之一，可能在調節(jié)線粒體功能的同時優(yōu)化ERs水平，通過提高UPRER調節(jié)蛋白穩(wěn)態(tài)，其中的分子機制還有待進一步研究。

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Regulation of Exercise-induced ER Stress and Mitochondrial Function in Skeletal Muscle

The endoplasmic reticulum （ER） is an intracellular Ca2+reservoir organelle whose primary function is protein synthesis，folding and processing，with strong homeostasis system，ER stress is induced by several physiological or pathological stimuli that change the homeostasis of the cell. A consequence of the physical，like MAM structure，and functional interaction between ER and mitochondria is that mitochondria function is sensitive to ER stress. ER stress can be transmitted to mitochondria by alterations in the transfer of metabolites such as Ca2+or by stress-responsive signaling pathways，directly influencing mitochondrial functions：Including mitochondrial metabolic enzyme activity，respiratory chain function，ATP production，mitochondrial movement，mtDNA biogenesis and mitochondrial quality control. In skeletal muscle，ER stress first was observed in myopathies，recently，it was reported that ER stress is activated by doing exercise，exercise may paly an role in regulating mitochondrial function，optimizing ER stress level and maintaining protein homeostasis in skeletal muscle，the molecular mechanism of this process needs to be further investigated.

skeletal muscle；endoplasmic reticulum stress；mitochondria；sport exercise

1002-9826（2017）04-0091-06

10. 16470/j. csst. 201704013

G804.2

A

2016-05-23；

2017-05-20

江蘇高校青藍工程資助（優(yōu)秀青年骨干教師）；南京體育學院院級課題重大項目（YJ1601）。

張媛，女，講師，博士研究生，主要研究方向為運動性骨骼肌線粒體調控，Tel：（025）84755226，E-mail：beibei82506@126.com。

1. 南京體育學院 運動健康科學系，江蘇 南京 210014；

2. 華東師范大學 體育與健康學院，上海 200241 1. Nanjing Sports Institute，Nanjing 210014，China；2. East China Normal University，Shanghai 200241，China.