姬衛(wèi)秀，何詩依，嚴 露，張 纓

JI Wei-xiu，HE Shi-yi，YAN Lu，ZHANG Ying

低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量和p-Nrf2表達的影響

姬衛(wèi)秀，何詩依，嚴 露，張 纓

JI Wei-xiu，HE Shi-yi，YAN Lu，ZHANG Ying

目的：轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關因子（Nrf2）－Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（Keapl）信號通路是細胞氧化應激反應中的關鍵通路。普遍認為，長期低氧訓練會影響抗氧化能力，研究試圖通過對小鼠施加低氧暴露、低氧訓練兩種方式，探討其對小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表達以及活性氧（ROS）水平的影響。方法：C57BL/6J小鼠30只，分為3組，分別是對照組（C）、低氧組（H）和低氧訓練組（HT）。其中，小鼠跑臺訓練的跑速為12 m/min，1 h/d，6 d/周，持續(xù)4周；低氧濃度為10%，8 h/d，持續(xù)4周。干預結束后脫頸處死取后腿兩側(cè)骨骼肌。Western Blot法測定骨骼肌Nrf2、Keapl和p-Nrf2的蛋白表達。免疫共沉淀法測Nrf2/Keap1結合量。高質(zhì)熒光測定法檢測小鼠骨骼肌ROS水平。結果：與C組相比，H、HT組小鼠骨骼肌中Nrf2/Keap1結合量顯著升高，游離Nrf2顯著降低，p-Nrf2蛋白表達顯著降低，游離Keap1基本無變化。WHT組ROS水平顯著高于WC組。結論：氧濃度為10%的4周低氧暴露和低氧訓練均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解綁作用；低氧訓練組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常顯著性降低，可能是造成ROS水平顯著升高的原因之一。

低氧；低氧訓練；Nrf2/Keap1；p-Nrf2

近年來，低氧訓練已成為運動員提高運動成績的重要輔助手段。研究已表明，低氧訓練可影響骨骼肌的抗氧化能力［1，3，4，11］，但其作用機制目前并不十分清楚。

NF-E2相關因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是細胞氧化應激反應中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)靶基因Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表達［11，26］。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keapl），是Nrf2的調(diào)節(jié)者，對Nrf2功能起負調(diào)控作用［19］。在正常情況下，Keapl與Nrf2耦聯(lián)，并與肌動蛋白結合被錨定于胞漿中，通過泛素化介導Nrf2蛋白降解，從而維持細胞漿內(nèi)Nrf2處于較低水平［15］。而當機體受到氧化應激刺激后，Keap1蛋白上半胱氨酸的巰基易受到破壞，使其構象發(fā)生改變，可促進Nrf2與Keapl偶聯(lián)作用的解除。同時，氧化應激刺激使Nrf2/Keap1復合物中的Nrf2發(fā)生磷酸化（p-Nrf2），加劇其和Keap1的解離作用，也可使游離Nrf2發(fā)生磷酸化［10，14］，從而使Nrf2和P-Nrf2在細胞漿中聚集，并轉(zhuǎn)位進入細胞核與Maf蛋白形成雜化二聚體［25］，而后與下游靶基因DNA上的抗氧化元件（ARE）結合，啟動其靶基因的轉(zhuǎn)錄，成為許多抗氧化基因的開關［17，20］。

運動可以激活Nrf2－ARE通路，增強心肌的抗氧化防御能力，但Nrf2敲除鼠這種作用減弱［22］。也有研究發(fā)現(xiàn)，急性運動可使小鼠骨骼肌細胞核Nrf2的蛋白表達升高［5］。在低氧環(huán)境中，機體細胞缺氧，會產(chǎn)生一系列的反應。低氧預處理可以激活Nrf2及其靶基因的表達，從而提高大鼠胚胎心肌細胞的生物學功能及抗缺氧能力［16］。沉默Nrf2基因后，低氧導致的內(nèi)皮細胞凋亡增加，細胞的體外增殖活動減少［28］。但也有研究表明，慢性間歇性低氧暴露4周和8周小鼠心肌組織中Nrf2表達水平下降［8］。在氧濃度為零的極度缺氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h的人類晶狀體上皮細胞，其Nrf2蛋白和mRNA表達降低，導致嚴重的細胞蛋白破壞［29］。

由上可知，低氧與Nrf2關系密切。然而，低氧暴露和低氧訓練如何影響骨骼肌的Nrf2信號及其抗氧化作用，目前并不十分清楚。因此，本研究試圖通過動物實驗，以Nrf2/Keap1復合物為切入點，探討4周低氧暴露和低氧訓練，對小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量和Nrf2、Keap1、p-Nrf2蛋白表達以及活性氧（ROS）水平的影響，為低氧訓練影響骨骼肌抗氧化作用的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康8周齡C57BL/6J雄性小鼠（購于維通利華公司實驗動物技術有限公司，動物合格證書：SCX-K（京）2009-0004）30只，按體重隨機分為3組，分別是對照組（C組），低氧暴露組（H組），低氧訓練組（HT組），每組10只。小鼠體重（18.37±2.26）g，每籠3～4只飼養(yǎng)于北京體育大學動物房，動物房溫度保持在20～25℃，相對濕度保持在50%～70%，每天光照12 h（7：00～19：00），3組動物均自由進食和飲水。

1.2 干預方案

低氧暴露組小鼠每天暴露在常壓低氧環(huán)境中8 h（8：00～16：00），氧氣濃度為10%，持續(xù)4周；通過制氮機（北京創(chuàng)文氣體有限公司）、凍干機（杭州超濾）和空氣壓縮機（美國英格索蘭）共同作用將空氣中的氮氣通入動物飼養(yǎng)室內(nèi)達到相應氧濃度；低氧訓練組的低氧環(huán)境與低氧組相同，并在低氧環(huán)境下進行跑臺運動，經(jīng)過兩天的適應性訓練后，進行正式訓練，其中，跑速12m/min，坡度為0，每天1 h，每周6天，持續(xù)4周。

1.3 取材

最后一次訓練結束后，休息48 h脫頸處死，迅速取兩側(cè)腿部骨骼肌，用錫紙包裹標記，投于液氮，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱備后續(xù)之用。

1.4 指標測定

1.4.1 提取總蛋白

取100 mg組織，加入800μl含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，超聲勻漿，冰上靜置30 min，隨后12 000 rpm，4℃離心30 min，取上清溶液即為總蛋白。

1.4.2 Western blot

對提取的組織蛋白進行BCA蛋白濃度測定（BCA Protein Assay Reagent，美國Thermo Scientific公司），根據(jù)濃度計算配樣，上樣量為20μg。采用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）和NuPAGE MOPS SDS電泳緩沖液（美國life technologies公司）進行電泳。之后采用美國Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標記后用5%的脫脂牛奶或BSA封閉1 h后，進行一抗孵育：p-Nrf2（bs-2013R，1：200）、Nrf2（sc-722，1：200）、Keap1（sc-33569，1：500）、內(nèi)參β-actin（sc-47778，1：1 000），于4℃搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后進行二抗孵育1 h：p-Nrf2（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：5 000）、Nrf2（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：2 000）、Keap1（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：5 000）、β-actin（羊抗鼠，中科晨宇，164017，1：5 000）、。最后，洗脫二抗后加發(fā)光液用BIORAD凝膠顯影儀器進行顯影，用其配套軟件進行條帶檢測與分析。讀取灰度值，計算結果，公式如下：

1.4.3 免疫共沉淀

采用免疫共沉淀法測組織胞漿中Nrf2/Keap1的結合量。根據(jù)蛋白的濃度，用PBS稀釋到1μg/μl；將1 ml已稀釋的蛋白溶液中加入到含20μl Protein A/G Mix Magnetic Beads（美國Millipore公司，LSKMAGAG02）的離心管中，4℃搖床2 h，將離心管放到磁力架（美國Millipore公司），轉(zhuǎn)移上清；向上清中加入5μl Nrf2抗體（sc-30915，santa cruz）（Input中加入Nomal goat IgG），4℃搖床過夜；次日加入30 μl Protein A/G Mix Magnetic Beads，室溫搖床2 h，棄上清，PBS清洗3次，加35 μl上樣緩沖液洗脫，70℃水浴10 min，轉(zhuǎn)移上清液，重復洗脫第二遍，共吸出上清液70μl。用Bolt 4%～12% Bis-Tris Plus凝膠（美國life technologies公司）上樣30μl進行電泳。之后，采用美國Invitrogen公司的iBlot 2將蛋白從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至NC膜上。目的條帶標記后用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，加入一抗稀釋液Keap1（sc-33569，1：500），于4℃搖床孵育過夜。次日洗脫一抗后加入二抗稀釋液（羊抗兔，中杉金橋，ZB-2301，1：5 000），室溫搖床孵育1 h。最后，洗脫二抗后加發(fā)光液用BIO-RAD凝膠顯影儀器進行顯影。

1.4.4 ROS測定

采用GENMED試劑盒（中國上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，GMS10016.3）對小鼠骨骼肌ROS進行測定，實驗操作嚴格按照試劑盒的說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)分析方法為單因素方差分析，用P＜0.05和P＜0.01分別表示具有顯著性和非常顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌 Nrf2/Keap1結合量的影響

圖1 各組小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結合量Figure 1 The Nrf2/Keap1 Binding Capacity in Skeletal Muscle of Mice

由圖1可知，H、HT組分別與C組相比，小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1復合物結合量顯著性增加。

2.2 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達的影響

由圖2可知，H、HT組分別與C組相比，小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達量均顯著性降低。

2.3 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達的影響

由圖3可知，H、HT組分別與C組相比，小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達均無顯著性變化。

2.4 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達的影響

圖2 各組小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達量Figure 2 The Expression of Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

圖3 各組小鼠骨骼肌Keap1蛋白表達量Figure 3 The Expression of Keap1 in Skeletal Muscle of Mice

由圖4可知，間歇低氧暴露后，H組骨骼肌p-Nrf2蛋白表達水平與C組相比顯著性下降；低氧訓練后，HT組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達量與C組相比，非常顯著性降低。

2.5 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌活性氧（ROS）的影響

由圖5可知，H組與C組相比，小鼠骨骼肌中ROS水平無顯著性變化；HT組與C組相比，小鼠骨骼肌ROS水平顯著性升高。

圖4 各組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達量Figure 4 The Expression of p-Nrf2 in Skeletal Muscle of Mice

圖5 各組小鼠骨骼肌ROSFigure 5 The Level of ROS in Skeletal Muscle of Mice

3 分析討論

3.1 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌Nrf2、Keap1蛋白表達量和Nrf2/Keap1結合量的影響

缺氧模擬化合物氯化鈷（CoCl2）處理小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞和骨骼肌衛(wèi)星細胞，可促進Nrf2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位入細胞核，使核內(nèi)Nrf2蛋白含量增加，進而上調(diào)Nrf2介導的抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄［6，7］。Nrf2作為氧化應激反應的關鍵調(diào)節(jié)者，急性運動后小鼠心臟和骨骼肌細胞Nrf2核蛋白表達顯著增加［18，22］。6周中等強度運動訓練可提高年輕和年老小鼠心臟細胞Nrf2核蛋白的水平，從而使抗氧化酶的表達增強［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)，4周和8周的慢性間歇低氧暴露，小鼠心肌組織中Nrf2表達水平下降［8］。在本研究中，低氧暴露、低氧訓練這兩種干預作用下，小鼠骨骼肌Nrf2蛋白表達量均顯著性降低，且兩種干預方式間無顯著性差異。這種Nrf2蛋白表達量的降低可能與實驗動物所處低氧環(huán)境的氧濃度有關。

有研究提出，Keap1與Nrf2的相互作用遵循著“開放”和“閉合”不同構象的循環(huán)方式。“開放”構象即1個Nrf2分子結合1個Keap1分子；“閉合”構象即1個Nrf2分子結合兩個Keap1分子。當機體受到氧化應激刺激時，處于安靜“開放”狀態(tài)的分子可被誘導呈現(xiàn)為“閉合”態(tài)，從而釋放出1個游離Nrf2分子，而Keap1結合數(shù)量仍保持不變，游離Keap1未被釋放［9］。因此，在本研究中，低氧暴露、低氧訓練兩種干預作用下小鼠骨骼肌游離Keap1蛋白表達無顯著性變化，可能與此相關。

Nrf2/Keap1復合物是Nrf2和Keap1結合物。在本研究中，低氧暴露、低氧訓練兩種干預作用下，小鼠骨骼肌Nrf2/ Keap1結合量均顯著增加。說明兩種干預方式使得Nrf2/ Keap1復合物的解離作用減弱，是造成游離Nrf2蛋白水平降低的重要原因。

3.2 低氧、低氧訓練對小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達和ROS水平的影響

機體受到氧化應激后，Nrf2蛋白磷酸化（p-Nrf2）與Nrf2一樣，在與Keap1解綁、核易位及其靶基因轉(zhuǎn)錄過程中也可能發(fā)揮著重要調(diào)控作用［10，23］。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠6周游泳運動后，海馬體的p-Nrf2蛋白表達增加［12］。而在本研究中，低氧暴露、低氧訓練這兩種干預作用下小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白表達均降低，且降低程度依次增強，但兩種干預方式之間并無顯著變化。Nrf2蛋白磷酸化減少可能也會造成p-Nrf2與靶基因的ARE結合活性降低，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。

生物活性小分子ROS是細胞代謝的產(chǎn)物，正常情況下細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除能力之間呈現(xiàn)動態(tài)平衡。運動、低氧都會影響機體ROS的產(chǎn)生［2，24，27］。在本研究中，低氧暴露、低氧訓練這兩種干預作用下，低氧訓練組小鼠骨骼肌ROS水平顯著性增加，說明p-Nrf2蛋白表達的非常顯著性降低可能影響了下游抗氧化酶的表達，進而使骨骼肌的ROS水平提高。

4 結論

氧濃度為10%的4周低氧暴露和低氧訓練均抑制了小鼠骨骼肌Nrf2和Keap1的解綁作用；且低氧訓練組小鼠骨骼肌p-Nrf2蛋白水平非常顯著性降低，可能是造成ROS水平顯著升高的原因之一。

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Effects of Hypoxia and Hypoxic Training on Nrf2/Keap1 Binding Capacity and p-Nrf2 Expression in Skeletal Muscle of Mice

Objective：NF-E2-related factor 2(Nrf2)－Kelch-like ECH-associated protein-1 (Keapl) signaling pathway is a key pathway of cell oxidative stress reaction. It is generally believed that the long-term hypoxic training could impact oxidation resistance. This research attempts to apply hypoxic training on mice to study the binding capacity of Nrf2/Keap1 and the contents of Nrf2、Keap1、p-Nrf2proteins in skeletal muscle. Methods：The 30 C57BL/6J mice were divided into three groups：control group (C)，hypoxia group (H)，hypoxic training group (HT). The mice ran on treadmill in speed of 12 m/min，1h/d，6d/week，for 4 weeks. Oxygen concentration in hypoxia chamber was 10%. Mice were treated for 4 weeks，8h/d. After both the interventions，the mice were sacrificed and collected skeletal muscle of legs. The expression of Nrf2，Keap1 and p-Nrf2were analyzed by western blot. High quality fluorescence assay was done to detect ROS level in skeletal muscle of mice. Result：Compared with C group，Nrf2/Keap1 binding capacity in skeletal muscle of H、HT groups mice was significantly increased while free Nrf2 and p-Nrf2were significantly reduced respectively；Free Keap1 did not change in skeletal muscle of mice；The ROS level in skeletal muscle of HT group mice significantly increased compared with C group mice. Conclusion：Hypoxia and hypoxic training which oxygen concentration was 10% could reduce the Nrf2/Keap1 unbinding capacity in skeletal muscle of mice. The exerpression of p-Nrf2in skeletal muscle of mice in hypoxic training group was significantly reduced，which may result in marked increase in ROS level.

hypoxia；hypoxic training；Nrf2/Keap1；p-Nrf2

1002-9826（2017）04-0114-05

10. 16470/j. csst. 201704016

G804.2

A

2016-11-28；

2017-05-24

國家自然基金項目（31471134）；中央高校基本科研業(yè)務費資助；北京體育大學自主課題（2016BS004）。

姬衛(wèi)秀，女，博士研究生，主要研究方向為運動與骨骼肌代謝，E-mail：jwx8918@163.com。

張纓，女，北京人，博士，博士研究生導師，研究方向為運動與骨骼肌代謝，E-mail：zhyi9256@126.com，Tel：（010）62989584

北京體育大學 運動人體科學學院，北京 100084

Beijing Sports University，Beijing 100084，China.