郭俊國，王興榮,2，趙晴，宋繼科，畢宏生,2

·論著：實驗研究·

線性探針聯(lián)合HPLC研究六銳膠囊中沒食子酸的眼部藥代動力學(xué)

郭俊國1，王興榮1,2，趙晴3，宋繼科3，畢宏生1,2

目的建立線性探針聯(lián)合高效液相色譜（HPLC）測量兔前房沒食子酸的方法，探討六銳膠囊中沒食子酸的眼部藥代動力學(xué)參數(shù)。方法6只新西蘭大白兔前房植入微透析線性探針（CMA402），灌胃給予六銳膠囊（20ml/kg）。以乙腈和0.1%醋酸水為流動相梯度洗脫，283 nm檢測沒食子酸濃度，DAS 2.0分析沒食子酸的藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果沒食子酸檢測限為0.67μg/ml，定量限為1.34μg/ml，在1.34~20.13μg/m l間線性關(guān)系良好，精密度和穩(wěn)定性的相對標準差（RSD）分別為0.77%和2.21%，體內(nèi)回收率為50.78%。沒食子酸前房藥代動力學(xué)符合二室模型，生物半衰期為54min，達到最大濃度時間為80min。結(jié)論采用線性探針聯(lián)合HPLC實時測量兔眼沒食子酸前房濃度準確可靠；六銳膠囊中的沒食子酸可以進入兔眼前房，其藥代動力學(xué)符合二室模型特征。

六銳膠囊；沒食子酸；線性探針；高效液相色譜；藥代動力學(xué)

六銳膠囊為藏藥，由訶子、紅花、巴夏嘎、木香、安息香、人工麝香六種藥物組成，具有清熱涼血、明目退翳功效，主要用于血、膽、疬引起的頭痛病，云翳等眼科疾病[1]。臨床發(fā)現(xiàn)六銳膠囊對白內(nèi)障、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、眼底出血及滲出等均有較好的臨床療效，但其作用機制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確[2-4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，六銳膠囊可通過減輕前房炎癥滲出和炎癥細胞浸潤，保護眼部組織結(jié)構(gòu)，增強機體抗氧化能力，調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)，發(fā)揮對葡萄膜炎的治療作用[5]。訶子主要含有沒食子酸、訶子酸等化學(xué)成分，沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗自由基等多種生物學(xué)活性，是六銳膠囊的有效化學(xué)成分之一[6]。微透析采樣技術(shù)可以提供眼前房組織游離藥物濃度的實時、連續(xù)、在線監(jiān)控，同步進行檢測前房內(nèi)藥物濃度變化[7]。本研究旨在通過微透析CMA402探針實時取樣房水，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）檢測沒食子酸的濃度，探討其眼部藥代動力學(xué)。

1 材料與方法

1.1 材料

新西蘭大白兔6只，雌雄兼有，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，山東大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號SYXK（魯）2003-0020。在室溫20~26℃，相對濕度40%~70%，光照12 h明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。

六銳膠囊（西安大唐制藥集團有限公司提供，國藥準字：Z20090461）；沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定院，A0110）；乙腈和甲醇（色譜級，Productof Tedia，United States America）；其它試劑均為分析純。

戴安U-3000液相色譜儀（UltiMate 3000自動進樣器，UltiMate 3000泵，UltiMate 3000二極管陣列檢測器，UltiMate 3000 RS柱溫箱）；EL204電子天平（德國梅特勒有限公司）；MS205DU十萬分之一天平（德國梅特勒公司）；FW135高速粉碎機（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。微透析線性探針（CMA 30，瑞典CMA公司）。

1.2 樣品制備與灌胃

取六銳膠囊內(nèi)容物在真空干燥箱中干燥8 h，高速粉碎后過60目藥篩。稱取100 g，置三角燒瓶中，加25%甲醇200ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，濾過，取續(xù)濾液濃縮至1ml相當于1 g藥材。采用兔用開口器進行灌胃，劑量為20ml/kg。

1.3 沒食子酸對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品4.63mg，置10ml棕色容量瓶中，加25%甲醇溶解并定容，得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1.0ml，置10ml棕色容量瓶中，加25%甲醇溶解并定容，得對照品溶液46.3μg/ml。 1.4色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Acclaim 120 A C18色譜柱（5μm，4.6 mm×150mm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1%醋酸水，梯度洗脫：0min 97%B；5min 95%B；10min 55%B；20min 75%B；25min 97%B；流速為1.0ml· min-1，檢測波長為283 nm，柱溫30℃進樣量5μl。

1.5 探針植入方法

術(shù)前3 d常規(guī)抗生素眼液點眼，術(shù)前30min耳緣靜脈注射肝素鈉（100U/kg），防止前房炎性滲出。腹腔注射1%戊巴比妥納（1mg/kg）麻醉實驗兔，將其側(cè)臥固定于解剖臺上，開瞼器開瞼，5號針頭沿瞼裂方向于角鞏膜緣處進針，做貫通前房穿刺，導(dǎo)入探針，使探針滲析窗全部浸入房水中[8]（圖1）。

微透析探針植入兔眼部后，約2 h前房恢復(fù)，以生理氯化鈉溶液為灌注液，流速設(shè)定為1μl/min，沖洗0.5 h后，開始灌胃，并將流速設(shè)定為2μl/min，每一樣品收集20min，HPLC色譜法測定滲析液中沒食子酸含量。

圖1 眼部微透析線性探針植入圖

1.6 方法學(xué)考察

工作曲線：分別精密吸取濃度為40.26μg/ml的沒食子酸對照品各0.5、1、2.5、3.75、5.0ml，置10ml棕色容量瓶中，加25%甲醇溶解并定容，精密吸取5 μl，注入液相色譜儀測定。以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制工作曲線。

檢測限和定量限：將沒食子酸對照品溶液依次稀釋至不同濃度，按照1.4的色譜條件分別測定。以信噪比3∶1作為檢測限，以信噪比10∶1作為定量限。

精密度和穩(wěn)定性：取濃度為6.671μg/mL沒食子酸對照組溶液，按照1.4的色譜條件連續(xù)進樣5次，計算精密度。分別于0、2、4、8、12、24 h，按照1.4的色譜條件分別進樣，計算穩(wěn)定性。

回收率：微透析探針植入家兔眼部后，約2 h前房恢復(fù)，以零凈通量法，分別以6.671μg/mL和20.13μg/mL的沒食子酸溶液進行灌注，流速設(shè)定為1μl/min，更換灌注液后，至少沖洗0.5 h才開始取樣，每一樣品收集20min，HPLC色譜法測定滲析液中沒食子酸含量，計算探針在體回收率（Rinvivo）。Rinvivo=(Cd-Cp)/(Cm-Cp)×100%。Cd為滲析液藥物濃度，Cp為灌注液中的藥物濃度，Cm為組織中的藥物濃度[9]。

1.7 藥物動力學(xué)分析

藥代動力學(xué)軟件DAS 2.0進行前房藥物的藥時動力學(xué)分析；用灌胃器將六銳膠囊樣品溶液灌到動物胃內(nèi)，流速設(shè)定為2μl/min，每一樣品收集20 min，收集360min共18個樣品，按照1.4的色譜條件分別測定。以沒食子酸濃度和時間繪制曲線，以lgC-t判斷房室模型。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

實驗結(jié)果表明，所建立的樣品處理方法和檢測條件下，沒食子酸對照品和樣品圖譜保留時間一致，微透析線性探針對沒食子酸的保留時間無影響（圖2～圖4）。

圖2 沒食子酸對照組色譜圖（高效液相色譜法）。數(shù)字1標示了沒食子酸的保留時間

圖3 六銳膠囊樣品溶液色譜圖（高效液相色譜法）。數(shù)字1標示了沒食子酸的保留時間

2.2 工作曲線

沒食子酸在1.34~20.13μg/ml范圍線性關(guān)系良好，回歸曲線為y=0.0106x+0.0012，r=0.9999。見圖5。

圖4 六銳膠囊微透析溶液色譜圖（高效液相色譜法）。數(shù)字1標示了沒食子酸的保留時間

圖5 沒食子酸線性范圍

2.3 檢測限和定量限

沒食子酸的檢測限為0.67μg/ml，定量限為1.34μg/ml。

2.4 精密度和穩(wěn)定性

沒食子酸連續(xù)進樣5針，峰面積分別為0.0744、0.0737、0.0734、0.0735、0.0728，相對標準差（RSD）值為0.77%，表明儀器的精密度良好。沒食子酸不同時間的峰面積分別為0.0741、0.0733、0.0748、0.0715、0.0711，RSD值為2.21%，說明沒食子酸溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 探針回收率

探針植入兔眼前房后測得體內(nèi)回收率為50.78%±3.02%，表明探針回收率良好。

2.6 沒食子酸藥代動力學(xué)

由沒食子酸在新西蘭大白兔前房的參數(shù)和lgC-t曲線，其藥代動力學(xué)符合二室模型，生物半衰期為54min，達到最大濃度時間為80min。具體結(jié)果見表1，圖6和圖7。表明六銳膠囊中沒食子酸可以進入新西蘭大白兔前房。

3 討論

為證實六銳膠囊中訶子的有效成分沒食子酸是否可進入前房發(fā)揮治療作用，本研究應(yīng)用線性微透析探針實時取樣技術(shù)，建立沒食子酸的HPLC檢測方法，并采用DAS 2.0分析前房沒食子酸的藥代動力學(xué)參數(shù)。微透析技術(shù)是一項完善的在體取樣技術(shù)，可實現(xiàn)不同組織同時取樣，為闡明藥物的體內(nèi)過程及作用機制提供依據(jù)，原理是基于物質(zhì)的自由擴散，降低生物樣本個體差異，結(jié)合高靈敏度的分析檢測技術(shù)，達到連續(xù)監(jiān)測動態(tài)變化的目的[10-12]。方法學(xué)考察的結(jié)果顯示，沒食子酸檢測限為0.67μg/mL，定量限為1.34μg/mL，在1.34μg/mL~20.13μg/mL范圍線性關(guān)系良好，精密度和穩(wěn)定性的RSD值分別為0.77%和2.21%，探針體內(nèi)回收率為80.78%，說明微透析聯(lián)合HPLC檢測技術(shù)可以實時準確地測定動物眼前房中的沒食子酸濃度，是進行眼部藥代動力學(xué)研究的便捷工具。本研究發(fā)現(xiàn)，六銳膠囊中的沒食子酸可以進入新西蘭大白兔前房，藥代動力學(xué)符合二室模型，生物半衰期為54min，達到最大濃度時間為80min。但六銳膠囊中沒食子酸如何進入前房，原因尚未深入研究，可能與六銳膠囊中的芳香開竅藥人工麝香和安息香有關(guān)。

綜上所述，線性探針聯(lián)合HPLC連續(xù)測量動物眼沒食子酸前房濃度準確可靠；六銳膠囊中的沒食子酸可以進入兔眼前房，其藥代動力學(xué)符合二室模型特征。

表1 六銳膠囊灌胃給藥實驗兔前房內(nèi)沒食子酸的藥物動力學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

表1 六銳膠囊灌胃給藥實驗兔前房內(nèi)沒食子酸的藥物動力學(xué)參數(shù)（±s，n=6）

參數(shù)單位參數(shù)值t1/2βmin54.21±2.17 AUC(0-360)mg·L-1·min38.79±1.58 AUC(0-∞)mg·L-1·min42.50±3.12 MRT(0-∞)min180.11±9.76 Tmaxmin80.00±5.34 CLz/FL·min-1·kg-10.04±0.01 Cmaxmg·L-10.25±0.03

圖6 沒食子酸在實驗兔前房的藥物濃度-時間曲線

圖7 沒食子酸在實驗兔前房的lgC-t曲線

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Study on ocular pharmacokinetics of gallic acid from Liurui capsule by line probe combined w ith HPLC

GUO Junguo,WANG Xingrong,ZHAOQing,et,al.Eye Institute of Shandong University of Traditional ChineseMedicine,Jinan 250002,China

OBJECTIVE To establish themeasurementmethod ofgallic acid in rabbitanterior chamber by line probe combined high performance liquid chromatography(HPLC),and to study the ocular pharmacokinetics of gallic acid of Liurui capsule.METHODS Six New Zealand white rabbits were implanted with linear probemicro dialysis(CMA402)in anterior chamber,Liurui capsule(20ml/kg)was given by intragastric administration.The acetonitrile and 0.1%acetic acid waterwere used formobile phase gradient elution,the gallic acid concentration was detected at283 nm wavelength,the pharmacokinetic parametersofgallic acid were analyzed by DAS 2.0.RESULTS Limitof detection ofgallic acid was 0.67μg/mL,limitofquantitation was 1.34μg/mL;From 1.34μg/mL to 20.13μg/ mL,the linear relationship was fine;The relative standard deviation(RSD)of precision and stabilitywere 0.77%and 2.21%respectively,and RSD of line probe recovery ratewas50.78%.The pharmacokinetic ofgallic acid in anterior chamber conformed to the two chambermodel,the biological half-lifewas 54min,themaximum concentration time was80min.CONCLUSIONS The line probe combined with HPLC technology could accurately determine the concentration of gallic acid in anterior chamber,and it from Liurui capsule entered into the anterior chamber which meant itspharmacokineticswas consistentwith featuresof two compartmentmodels.

Liuruicapsule;gallic acid;line probe;high performance liquid chromatography;pharmacokinetic

R776.1

A

1002-4379（2017）02-0083-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.02.004

山東省重點研發(fā)計劃（2015GGH319001）；山東省自然科學(xué)基金（2014ZRB14483）；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃普通項目（2013-106）

1山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所，濟南250002 2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院，濟南250002 3山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科與視光醫(yī)學(xué)院，濟南250355

畢宏生，E-mail：hongshengbi1@163.com