文/吳 騰 何 瑛 楊愛君 紀(jì)坤發(fā) 楊美豐

高效液相色譜法測定牛奶中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸含量

文/吳 騰 何 瑛 楊愛君 紀(jì)坤發(fā) 楊美豐

（廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司）

建立采用高效液相色譜法測定牛奶中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸含量的方法。試驗采用C18柱，以甲醇∶乙酸銨溶液（0.02 mol/L）＝5∶95（V/V）為流動相進(jìn)行分離，檢測波長230 nm，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明，樣品中的安賽蜜、苯甲酸和山梨酸的最低檢出限均為1 mg/kg，平均加標(biāo)回收率分別為93.03%、94.56%、90.71%。

牛奶；安賽蜜；苯甲酸；山梨酸；高效液相色譜法

食品添加劑是為改善食品色、香、味等品質(zhì)，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質(zhì)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，在食品生產(chǎn)過程中過量添加食品添加劑的現(xiàn)象越來越普遍，因而我國制定了國家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]，規(guī)定了2 000 種以上的食品添加劑限量要求。

苯甲酸和山梨酸是目前食品中使用范圍最廣的防腐劑。依據(jù)相關(guān)規(guī)定，苯甲酸和山梨酸不允許在牛奶中添加[1]，但是牛奶本身含有微量的苯甲酸，為0.40～1.02 mg/kg[2]，而在發(fā)酵過程中，牛奶中的馬尿酸脫甘氨酸生成苯甲酸，酸牛乳中天然苯甲酸含量有所增加[3]。

安賽蜜是食品中常用的人工合成甜味劑，其甜度約為蔗糖的200倍，甜覺快，味質(zhì)好，不增加血糖含量，適合于糖尿病患者食用[4]。但經(jīng)常食用合成甜味劑超標(biāo)的食品會對人體的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成危害，如果短時間內(nèi)大量食用，會引起血小板減少導(dǎo)致急性大出血。

為了防止以上3 種物質(zhì)在食品中超量使用，需要對其進(jìn)行監(jiān)控，檢驗其在食品中的含量，保障消費者的身體健康。目前，食品中安賽蜜的檢測方法有高效液相色譜法[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、離子色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]等，苯甲酸和山梨酸的檢測方法有高效液相色譜法[9]、薄層色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、氣相色譜法[12]等。2016年國家頒布GB 5009.28-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》[13]，在采用該標(biāo)準(zhǔn)對牛奶中的安賽蜜、苯甲酸和山梨酸檢驗的過程中，發(fā)現(xiàn)加標(biāo)回收率偏低且不穩(wěn)定，為此，對檢驗條件進(jìn)行反復(fù)研究，建立采用高效液相色譜法測定牛奶中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸含量的方法，通過驗證，該方法回收率高，重復(fù)性良好，試劑污染少，適合企業(yè)日常檢驗使用。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

生乳：采自廣東、福建、廣西等地的奶牛場。

1.1.2 試劑

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682-2008《分析試驗室用水國家標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的一級水。

亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）：稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，定容至1 000 mL。

乙酸鋅溶液（183 g/L）：稱取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL。

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加入適量水溶解，定容至1 000 mL，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2 000 mg/L）：準(zhǔn)確稱取干燥后的安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至50 mL，混勻后置于4 ℃避光保存。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 mg/ L）：準(zhǔn)確稱取干燥后的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至50 mL，混勻后置于4 ℃避光保存。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 mg/ L）：準(zhǔn)確稱取干燥后的山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至50 mL，混勻后置于4 ℃避光保存。

安賽蜜、苯甲酸和山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別吸取安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL，苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液各2 mL于50 mL棕色容量瓶，用純水定容至50 mL，配制成濃度均為20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，混勻后置于4 ℃避光保存。

1.1.3 儀器

Agilent 1200液相色譜儀-DAD檢測器（美國安捷倫科技公司），電子分析天平（感量0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司），離心機(jī)（德國希格瑪公司），超純水系統(tǒng)（德國默克密理博公司），超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），渦旋振蕩器（廣州海太光電生物科技有限公司），移液槍（德國普蘭德（Brand）公司）；0.22μm水相微孔濾膜，50 mL具塞離心管。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.001 g）樣品于50 mL具塞離心管中，加水約15 mL，渦旋混勻，于50℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2 mL，混勻，于8 000 r/min離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中；于殘渣中加水10 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r/ min離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL具塞離心管中，重復(fù)操作2次；將萃取液用水定容至40 mL，混勻。取適量萃取液過0.22 μm濾膜待測。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（Waters HSS T3，5 μm×4.6 mm×150 mm）；

流動相：甲醇∶乙酸銨（0.02 mol/L）=5∶95（V/V）；

檢測波長：230 nm；

柱溫：25 ℃；

流速：1 mL/min；

進(jìn)樣量：10 μL 。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取10 mL比色管5 支，分別吸取0.025、0.050、0.500、2.000、4.000 mL安賽蜜、苯甲酸和山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用水定容至10 mL，配制成濃度為0.05、0.10、1.00、4.00、8.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），通過液相色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 樣品測定

將待測溶液上機(jī)測定，根據(jù)計算公式得到樣品中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸的含量。

1.2.5 計算公式

樣品中的安賽蜜、苯甲酸和山梨酸的含量按以下公式計算：

X—樣品中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸的含量，mg/kg；

A—樣品中各檢測物質(zhì)峰面積；

C—標(biāo)樣中各檢測物質(zhì)濃度，mg/L；

V—樣品最終定容體積，mL；

As—標(biāo)樣中各檢測物質(zhì)峰面積；

m—樣品取樣量，g。

2 分析與討論

試驗從樣品的萃取次數(shù)、定容體積及萃取溶劑三方面進(jìn)行調(diào)整，最后根據(jù)交叉試驗結(jié)果選擇最優(yōu)的試驗條件。mL，每個加標(biāo)水平重復(fù)5 次，得出樣品的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值），試驗結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，三次萃取時各組分的加標(biāo)回收率均優(yōu)于二次萃取，且三次萃取時回收率的RSD值小于兩次萃取，重復(fù)性較好，因而選擇萃取次數(shù)為三次。1.2.1的步驟進(jìn)行，分別使用45、35、25 mL的水對加標(biāo)樣品進(jìn)行二次萃取，最后用水定容至50、40、30 mL，每個加標(biāo)水平重復(fù)5 次，試驗結(jié)果如表2所示。

從表2可以看到，最終定容體積分別為50 mL和40 mL時，各組分加標(biāo)回收率相對較好，但山梨酸的加標(biāo)回收率仍不理想，保留這兩個試驗條件待下一步的試驗研究。

2.2 定容體積的選擇

2.3 萃取溶劑的選擇

2.1 樣品萃取次數(shù)的選擇

試驗按1.2.1的步驟進(jìn)行，使用45 mL水分別對加標(biāo)樣品進(jìn)行二次和三次萃取，最后用水定容至50

為了在充分提取樣品的同時盡量減少樣品稀釋帶來的試驗誤差，試驗比較最終定容體積分別為50、40、30 mL時，樣品中安賽蜜、苯甲酸及山梨酸的平均加標(biāo)回收率，以選擇最佳的定容體積。試驗按

從以上試驗可以發(fā)現(xiàn)山梨酸的加標(biāo)回收率并不理想，山梨酸微溶于水，能溶于有機(jī)溶劑，因此將萃取溶劑進(jìn)行調(diào)整，分別比較用水和50%甲醇水（V/V）進(jìn)行萃取時，樣品中安賽蜜、苯甲酸及山梨酸的平均加標(biāo)回收率，選擇最佳的萃取溶劑。試驗按1.2.1的步驟進(jìn)行，分別使用45 mL水和50%甲醇水對加標(biāo)樣品進(jìn)行二次萃取，最后定容至50 mL，每個加標(biāo)水平重復(fù)5 次，試驗結(jié)果如表3所示。

表1 不同萃取次數(shù)的樣品加標(biāo)回收率

表2 不同定容體積的樣品加標(biāo)回收率

從表3可以看出，使用50%甲醇水提取時，山梨酸的加標(biāo)回收率有所提高，而安賽蜜和苯甲酸的加標(biāo)回收率變化不大，可能是由于安賽蜜和苯甲酸均能溶于水和有機(jī)試劑。

2.4 交叉試驗

綜合上述試驗結(jié)果，選擇萃取次數(shù)為三次，最終定容體積分別為50 mL和40 mL，萃取溶劑分別為水和50%甲醇水幾個條件進(jìn)行交叉試驗，和國標(biāo)法（二次水萃取、最終定容至50 mL）對比，得出樣品的平均加標(biāo)回收率，同時計算出RSD值，以選擇出最優(yōu)的試驗方法。試驗按1.2.1中的步驟進(jìn)行，分別對樣品萃取次數(shù)、最終定容體積及萃取溶劑進(jìn)行調(diào)整，每個加標(biāo)水平重復(fù)5 次，試驗結(jié)果如表4和表5所示。

從表4和表5可以看出：（1）各方法的安賽蜜回收率差別不大，均在90%～100%，其中使用50 mL 50%甲醇水三次萃取及使用40 mL水三次萃取的回收率RSD值較小，均低于2%；（2）苯甲酸回收率普遍較好，均在90%～110%，其中使用40 mL水和50%甲醇水三次萃取這兩種方法的RSD值較小，均低于5%；（3）使用50%甲醇水萃取時山梨酸的回收率較高，在89%～100%，使用40 mL水三次萃取時山梨酸的回收率次之，在88%～96%，其中使用50 mL 50%甲醇水三次萃取及40 mL水三次萃取這兩種方法的回收率RSD值較小，均低于5%。

綜合各方法回收率及RSD值，考慮到減少稀釋倍數(shù)帶來的試驗誤差及試劑污染等因素，選擇分別使用15、10、10 mL水三次萃取樣品，最后用水定容到40 mL為最終試驗方案。該試驗方案與國標(biāo)法相比較，回收率較高，重復(fù)性良好。

表3 不同萃取溶劑的樣品加標(biāo)回收率

3 結(jié)果與驗證

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在試驗選定的色譜條件下，將1.2.3中所配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液依次上機(jī)測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2值分別為安賽蜜0.9999，苯甲酸0.9999，山梨酸0.9999。

表4 交叉試驗的樣品加標(biāo)回收率

表5 交叉試驗樣品加標(biāo)回收率的RSD值

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表6 重復(fù)試驗樣品加標(biāo)回收率及RSD值

3.2 檢出限和回收率

使用選定的試驗方法進(jìn)行6 次重復(fù)試驗，得出方法中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸的最低檢出限均為1 mg/kg，各組分平均加標(biāo)回收率分別為99.29%、90.46%、95.96%，RSD值分別為3.4%、3.9%、2.4%，回收率高，重復(fù)性良好，試驗結(jié)果如表6所示。

4 小結(jié)

4.1使用本方法測得生乳樣品中苯甲酸含量均低于1.38 mg/kg，與相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[2]；巴氏殺菌乳樣品中苯甲酸含量均低于1.09 mg/kg，發(fā)酵乳樣品中苯甲酸含量為4.20～5.45 mg/kg，滅菌型含乳飲料樣品中苯甲酸含量均低于1.73 mg/kg；各樣品中均未檢出山梨酸；測得含乳飲料樣品中安賽蜜含量為137.62～155.24 mg/ kg，符合GB 2760-2014《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的規(guī)定。

4.2本方法與國標(biāo)法相比較，回收率高，重復(fù)性良好，適用于牛奶中安賽蜜、苯甲酸和山梨酸含量的日常監(jiān)測。

[1] 國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 2760-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

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Determination of Acesulfame，Benzoic Acid and Sorbic Acid in Milk by High Performance Liquid Chromatography

WU Teng，HE Ying，YANG Ai-jun，JI Kun-fa，YANG Mei-feng
（Guangdong Yantang Dairy Corporation Ltd.）

A method for detecting acesulfame，benzoic acid and sorbic acid in milk by high performance liquid chromatography（HPLC）was built. A C18column was used，and methanol∶ammonium acetate（0.02 mol/L）= 5∶95（V/V） as mobile phase（1 mL/min） to separate. The detector wave was at 230 nm，the flow rate was 1 mL/min，the column temperature was 25 ℃and the sample quantity was 10 μL. Results showed the minimum detectable value of acesulfame，benzoic acid and sorbic acid is 1 mg/kg，and the average recovery rates are 93.03%，94.56%，90.71%.

milk；acesulfame；benzoic acid；sorbic acid；HPLC

吳騰（1989-），女，食品助理工程師，廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司品控部檢驗員，主要從事乳制品檢測工作。

2017-06-15）