馬洋，王向棟，王萌慧，李會(huì)，史勁松，許正宏

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高效轉(zhuǎn)化植物甾醇為9α-OH-AD的分枝桿菌誘變選育及工藝優(yōu)化

馬洋1，王向棟1，王萌慧1，李會(huì)1，史勁松1，許正宏2

1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122

馬洋, 王向棟, 王萌慧, 等. 高效轉(zhuǎn)化植物甾醇為9α-OH-AD的分枝桿菌誘變選育及工藝優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1198–1206.Ma Y, Wang XD, Wang MH, et al. Mutation breeding of high 9α-hydroxy-androst-4-ene-3,17-dione transforming strains from phytosterols and their conversion process optimization. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1198–1206.

以實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的分枝桿菌(sp. LY-1)為出發(fā)菌株，采用等離子誘變(ARTP)技術(shù)選育出能高效轉(zhuǎn)化植物甾醇為重要甾體藥物中間體9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的菌株，并對(duì)其轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過(guò)ARTP誘變選育得到遺傳穩(wěn)定性較好的分枝桿菌突變株sp. C33，當(dāng)?shù)孜镏参镧薮纪读蠞舛葹?5 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化生成9α-OH-AD的摩爾得率達(dá)到15.5%，較原始菌株提高34.8%。繼而采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)突變菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，并建立了油水雙相轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)一步提高了突變菌株C33的產(chǎn)物摩爾得率，最高達(dá)到47.0%，較優(yōu)化前(15.5%)提高了2倍。

分枝桿菌，植物甾醇，9α-OH-AD，等離子誘變，生物轉(zhuǎn)化

甾體激素類(lèi)藥物主要包括性激素、腎上腺皮質(zhì)激素和蛋白同化激素三大類(lèi)[1]。甾體激素藥物最首要的藥效體現(xiàn)在對(duì)人類(lèi)生育能力的改善[2-4]，其次還具有顯著的抗腫瘤、抗炎抗敏、抗菌抗病毒、抗痙攣等效果[5-7]。由于甾類(lèi)激素藥物對(duì)人體機(jī)體發(fā)揮著十分重要的調(diào)節(jié)作用，因此該類(lèi)藥物現(xiàn)已成為僅次于抗生素的第二大品種。由于傳統(tǒng)化學(xué)合成法帶來(lái)嚴(yán)重的工業(yè)污染，并且存在收率低、成本高等問(wèn)題，極大地限制了甾體激素在藥物領(lǐng)域的發(fā)展，故近年來(lái)利用微生物轉(zhuǎn)化逐漸成為主要發(fā)展趨勢(shì)[8]。

植物甾醇是大豆榨油后的下腳料，作為新的甾體資源，由于其來(lái)源豐富、價(jià)格低廉，使得產(chǎn)品價(jià)格大幅度下降，為甾體激素藥物產(chǎn)品帶來(lái)了新的市場(chǎng)。植物甾醇是一類(lèi)疏水性化合物，它的低溶解性導(dǎo)致的傳質(zhì)限制是其轉(zhuǎn)化的瓶頸問(wèn)題之一[9]。雙相轉(zhuǎn)化體系一定程度上為解決這個(gè)問(wèn)題提供了有力的技術(shù)保障，采用天然油脂能夠增加甾醇溶解度，且對(duì)微生物的傷害較低[10-13]。

9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD) 是一種重要的甾體藥物中間體[14]，其9α位作為被羥基化的位點(diǎn)，在進(jìn)行簡(jiǎn)單的鹵化反應(yīng)后便可引入F或Cl等鹵素取代基，從而有效提升某些皮質(zhì)類(lèi)激素(如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等藥物) 的藥效[15]，因此研究由植物甾醇轉(zhuǎn)化生成9α-OH-AD具有廣闊的市場(chǎng)前景。但利用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD仍存在轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)物得率低及產(chǎn)物純度不高等諸多問(wèn)題。要切實(shí)提高轉(zhuǎn)化率，可行的措施主要包括：一是通過(guò)誘變篩選方法獲得優(yōu)勢(shì)菌株，二是通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行菌株改造，三是通過(guò)優(yōu)化調(diào)整轉(zhuǎn)化工藝。由于在分子操作方面尚存在一定難度，我們嘗試以實(shí)驗(yàn)室1株可轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的分枝桿菌sp. LY-1作為出發(fā)菌株，采用誘變結(jié)合工藝調(diào)整和優(yōu)化的方法提升轉(zhuǎn)化效率，以提高目的產(chǎn)物9α-OH-AD的濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

分枝桿菌sp. LY-1，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

植物甾醇(β-谷甾醇47.0%，菜油甾醇24.6%，豆甾醇15.5%，菜籽甾醇3.4%)購(gòu)自湖北巨勝科技有限公司；9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮 (9α-OH-AD)購(gòu)自上海瀚香生物科技，純度為98.0%以上。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基(g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaNO35.4，酵母粉 15，甘油 2，(NH4)2HPO40.6。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：NaNO35.4，玉米漿 20，(NH4)2HPO40.6，植物甾醇 15，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

將PDA斜面保存的分枝桿菌菌體接種于無(wú)菌種子培養(yǎng)基，120 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)72 h。

1.2.2 菌株誘變時(shí)間的選擇

將斜面上挑取的分枝桿菌移至100 mL種子培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)72 h至菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取0.01 mL菌液均勻地涂在金屬載片上。把裝有樣品的金屬載片平板放到ARTP誘變系統(tǒng)操作室里，逐漸增加誘變時(shí)間(15–210 s) 進(jìn)行誘變。誘變結(jié)束后，用鑷子把金屬載片移至裝有1 mL培養(yǎng)基的EP管里，制成新的菌懸液。對(duì)新的菌懸液進(jìn)行后培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)結(jié)束后記錄下各平板的菌落數(shù)，計(jì)算誘變致死率，如下式，確定最佳誘變時(shí)間。

1.2.3 分枝桿菌sp. LY-1的ARTP誘變及發(fā)酵選育

在最佳誘變處理時(shí)間下，對(duì)分枝桿菌進(jìn)行ARTP誘變操作。挑取PDA平板上的全部突變子于10 mL/50 mL的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物甾醇，測(cè)定9α-OH-AD得率，篩選優(yōu)勢(shì)突變株并保種。

1.2.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將篩選出的優(yōu)勢(shì)突變株分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，測(cè)定其9α-OH-AD的生成能力，將保種管中的突變菌株分區(qū)劃線(xiàn)于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，挑取單菌落于種子培養(yǎng)基中，120 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基7 d后測(cè)定9α-OH-AD得率，再將該種子液重新劃線(xiàn)于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，挑取單菌落于種子培養(yǎng)基，按上述步驟重復(fù)5次，比較每次9α-OH-AD得率，以考察突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 菌體生物量測(cè)定

菌體生物量以每升轉(zhuǎn)化液中的菌體干重來(lái)表示。取潔凈的離心管75 ℃烘干至恒重，稱(chēng)重記為1。準(zhǔn)確量取1 mL的待測(cè)菌液置于離心管中，12 000 r/min離心3 min后棄上清，用乙酸乙酯清洗菌體3遍。將含菌體的離心管再次烘干至恒重，稱(chēng)量得到菌體與離心管的重量之和，記為2。2與1之差即為1 mL的待測(cè)菌液中的菌體干重。

1.2.6 產(chǎn)物提取

準(zhǔn)確量取0.5 mL待測(cè)發(fā)酵液，用等體積乙酸乙酯反復(fù)萃取6遍，合并萃取后的上清液，將上清液烘干得到底物、副產(chǎn)物、產(chǎn)物的混合物，用8倍體積的乙腈復(fù)溶稀釋后，0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾除雜，HPLC分析轉(zhuǎn)化液中底物、副產(chǎn)物、產(chǎn)物含量。

1.2.7 分析方法

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)產(chǎn)物，配制0.5 g/L的9α-OH-AD標(biāo)準(zhǔn)品，利用外標(biāo)法計(jì)算目的產(chǎn)物的濃度。色譜柱，Agilent TC-C18 (4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相，乙腈/水(7∶3，體積比)；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速 0.5 mL/min；進(jìn)樣10 μL。

產(chǎn)物摩爾得率計(jì)算方法：

產(chǎn)物摩爾得率=(p×s)/(s×p)×100%

底物轉(zhuǎn)化率=(s–)/s×100%

式中，s為底物DHEA的質(zhì)量濃度(g/L)；為待測(cè)轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物的質(zhì)量濃度(g/L)；s為底物摩爾質(zhì)量(g/mol)；p為產(chǎn)物摩爾質(zhì)量(g/mol)。

1.2.8 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最佳培養(yǎng)基組分

根據(jù)原始培養(yǎng)基組分設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)(表1)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基。以1.0%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)液中，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)7 d。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.9 油水雙相轉(zhuǎn)化體系的建立

按照每投加1 g底物，加入16 mL的油量向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入大豆油、菜籽油、葵花籽油、橄欖油，并與無(wú)油轉(zhuǎn)化進(jìn)行對(duì)比，比較5種條件下9α-OH-AD的積累量。

選擇最佳的油水轉(zhuǎn)化方式后，對(duì)油的添加濃度進(jìn)行梯度優(yōu)化，當(dāng)投加每1 g底物時(shí)，分別加入4、8、12、16、20 mL油量進(jìn)行轉(zhuǎn)化，30 ℃，120 r/min培養(yǎng)7 d后，乙酸乙酯萃取發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)9α-OH-AD得率，確定最優(yōu)的油添加濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 分枝桿菌sp. LY-1的ARTP誘變

2.1.1 最佳誘變時(shí)間的確定

將分枝桿菌sp. LY-1經(jīng)ARTP 誘變照射不同時(shí)間后進(jìn)行再生培養(yǎng)，根據(jù)再生單菌落數(shù)計(jì)算其致死率，結(jié)果如圖1所示。隨著ARTP誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體致死率迅速增加。當(dāng)照射時(shí)間為150 s時(shí)，菌體致死率達(dá)到98.0%左右，當(dāng)達(dá)到180 s時(shí)，平板無(wú)菌體生長(zhǎng)，由于等離子誘變?cè)谥滤缆瘦^高時(shí)比較易發(fā)生正向突變，故選擇150 s作為原生質(zhì)體的處理時(shí)間。

2.1.2 突變菌株的選育及轉(zhuǎn)化能力驗(yàn)證

在ARTP誘變系統(tǒng)操作室對(duì)菌體照射150 s后，涂布于PDA平板上培養(yǎng)7 d，從單菌落中挑取150株突變株，測(cè)定各突變株的9α-OH-AD得率。如圖2、3所示，通過(guò)搖瓶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，最終篩選得到8株正向突變菌株C3、C12、C21、C25、C27、C33、C39、C49，其中C33產(chǎn)物得率較野生菌提高最多，9α-OH-AD摩爾得率達(dá)到15.5%。

圖1 不同誘變時(shí)間菌體的致死率

圖2 優(yōu)勢(shì)突變菌株的篩選

2.1.3 最佳誘變時(shí)間的確定

將突變株C33進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以考察其遺傳穩(wěn)定性。如圖4所示，經(jīng)過(guò)連續(xù)5代的培養(yǎng)，確定其為1株穩(wěn)定性好且轉(zhuǎn)化率高的菌株。

2.2 突變菌株的轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

培養(yǎng)基的組分、配比、緩沖能力都對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成有重要的影響。本試驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在搖瓶中對(duì)分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇的培養(yǎng)基組分(NaNO3、玉米漿和(NH4)2HPO4)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步研究各組分對(duì)菌種轉(zhuǎn)化能力的影響。設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交試驗(yàn)，以9α-OH-AD的濃度為指標(biāo)，選用L9(33)正交表進(jìn)行培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化，并進(jìn)行極差分析。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由極差值可知，(NH)2HPO4濃度對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成影響最為顯著，然后依次是玉米漿、NaNO3。正交實(shí)驗(yàn)得到的理論最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C2，即NaNO35 g/L，玉米漿25 g/L，(NH)2HPO40.6 g/L，此條件下9α-OH-AD得率 最高。

2.2.2 油水雙相轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建及優(yōu)化

油水雙相轉(zhuǎn)化體系的建立：構(gòu)建油水雙相體系可以很大程度地提高9α-OH-AD的積累量，兩相體系中用到的大豆油脂，能夠有效增加甾醇溶解度，且相比有機(jī)溶劑對(duì)微生物的傷害性更低。在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，加入油脂可以提高甾醇的投料量和菌體的活力[16-17]，因此采用該體系，利用突變菌株C33轉(zhuǎn)化植物甾醇，從圖5可以看出，大豆油-水雙相體系下9α-OH-AD的得率最高，并且大豆油的價(jià)格相對(duì)也較低，故采用大豆油進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。從圖6可以看出，9α-OH-AD濃度在轉(zhuǎn)化7 d左右的時(shí)間達(dá)到最高，摩爾得率達(dá)到43.0%以上。

圖3 產(chǎn)物HPLC檢測(cè)圖譜(A：9α-OH-AD標(biāo)樣，B：出發(fā)菌株LY-1，C：誘變菌株C33)

圖4 突變菌株C33的遺傳穩(wěn)定性

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

大豆油添加濃度的優(yōu)化：在建立油水雙相體系并大大提高9α-OH-AD得率后，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆油進(jìn)行了進(jìn)一步的濃度優(yōu)化，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)大豆油的添加量為每1 g植物甾醇添加12 mL時(shí)，9α-OH-AD的摩爾得率最高，達(dá)到47.0%以上。

圖5 油水雙相體系中油類(lèi)的篩選

圖6 突變菌株C33油水雙相體系轉(zhuǎn)化參數(shù)

圖7 不同油梯度的轉(zhuǎn)化效果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室保存的分枝桿菌sp. LY-1為出發(fā)菌株，采用等離子誘變技術(shù)(ARTP)對(duì)菌株進(jìn)行誘變選育。通過(guò)篩選，成功獲得了1株遺傳穩(wěn)定性良好，且能高效轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α-OH-AD的突變菌株C33，并對(duì)誘變菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定了最適培養(yǎng)基組分為：NaNO35 g/L，玉米漿25 g/L，(NH4)2HPO40.6 g/L。此外，建立了油水雙相轉(zhuǎn)化體系，優(yōu)化后得到當(dāng)每1 g植物甾醇添加12 mL大豆油時(shí)9α-OH-AD得率最高，投加15 g/L底物時(shí)，9α-OH-AD摩爾得率可達(dá)到47.0%以上。

目前利用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇的產(chǎn)物多為AD與ADD，或以AD為底物轉(zhuǎn)化生成9α-OH-AD，直接由植物甾醇生成9α-OH-AD的報(bào)道相對(duì)較少，后續(xù)研究希望通過(guò)提高底物投料量，為工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造更大的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)中大豆油的作用機(jī)制尚不明確，僅了解到其對(duì)底物起到助溶作用，但對(duì)菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是否存在影響從而增強(qiáng)了底物傳質(zhì)效率，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。本文的研究結(jié)果可作為大豆油作用機(jī)制的研究基礎(chǔ)，對(duì)于其他微溶于水底物的生物轉(zhuǎn)化研究也具有一定的參考價(jià)值。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Mutation breeding of high 9α-hydroxy-androst-4-ene-3,17- dione transforming strains from phytosterols and their conversion process optimization

Yang Ma1, Xiangdong Wang1, Menghui Wang1, Hui Li1, Jinsong Shi1, and Zhenghong Xu2

1 School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University, Wuxi214122, Jiangsu, China 2 School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi214122, Jiangsu, China

In order to improve transformation efficiency of phytosterols into 9α-hydroxylation of 4-androstene-3,17-dione (9α-OH-AD) bysp. LY-1, we studied the strains breeding using atmospheric and room temperature plasma (ARTP) technology and optimized their conversion process. A high production strain named C33 with a good genetic stability was selected and the product molar yield reached to 15.5%, 34.8% higher than that of original strain with 15 g/L phytosterols. Furthermore, the fermentation medium was optimized through the design of orthogonal experiment. Besides, oil-water bidirectional transformation system was set up to improve the 9α-OH-AD molar yield of mutant strain C33. With adding 12 mL soybean oil to each 1 g phytosterols, the molar yield of 9α-OH-AD reached 47.0%, which increased twice than that of control (15.5%).

sp., phytosterol, 9α-OH-AD, atmospheric and room temperature plasma, biotransformation

January 13, 2017; Accepted:March 29, 2017

Hui Li. Tel: +86-510-85326883; Fax: +86-510-85328177; E-mail: lihui@jiangnan.edu.cn

Supported by:National High Technology Program of China (863 Program) (No. 2011AA02A211), Jiangsu College and University Academic Degree Graduate Research and Innovation Program (No. KYLX16_0826).

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2011AA02A211)，江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No. KYLX16_0826)資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-04-11

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170411.1701.001.html