劉清華＊，李瑜＊，曹曉娜，張莉，翟旭雯（.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原0000；.北京體育大學(xué)醫(yī)院，北京00084；.山西省兒童醫(yī)院，山西太原000）

4種5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠心肌IK1通道的影響及促心律失常風(fēng)險(xiǎn)比較

劉清華1＊，李瑜2＊，曹曉娜2，張莉3，翟旭雯1（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原030001；2.北京體育大學(xué)醫(yī)院，北京100084；3.山西省兒童醫(yī)院，山西太原030013）

目的 比較4種5-羥色胺4型（5-HT4）受體激動(dòng)劑西沙必利（cisapride），扎考必利（zacopride），莫沙必利（mosapride）和2〔1-（4-胡椒基）哌嗪〕基苯并噻唑{2-〔1-（4-Piperonyl）piperazinyl〕benzothiazole，BZTZ}對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞膜內(nèi)向整流鉀通道（IK1）功能和蛋白表達(dá)的影響，并觀察其對(duì)大鼠離體心臟心律的影響，從而評(píng)估其致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)。方法應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別觀察4種激動(dòng)劑對(duì)膠原酶分解的成年SD大鼠心室肌細(xì)胞膜IK1和HEK293細(xì)胞異源表達(dá)的Kir2.1通道電流的影響。應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)4種激動(dòng)劑孵育大鼠心室肌細(xì)胞24 h后IK1主要亞單位Kir2.1通道蛋白表達(dá)的變化。將麻醉大鼠的心臟取出進(jìn)行Langendorff主動(dòng)脈逆行灌流，分別觀察4種激動(dòng)劑給藥30 min內(nèi)離體心臟節(jié)律的變化，全程記錄心電圖。結(jié)果 在大鼠心室肌細(xì)胞，BZTZ，西沙必利和莫沙必利0.1～10 μmol·L-1可濃度依賴性地抑制IK1。在相同濃度（1 μmol·L-1）時(shí)，BZTZ對(duì)IK1的抑制效應(yīng)最強(qiáng)（P＜0.01），其次為西沙必利，莫沙必利最弱。扎考必利可激動(dòng)IK1（P＜0.01）。在Kir2.1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，扎考必利激動(dòng)Kir2.1通道電流（P＜0.01），而莫沙必利無明顯影響。在大鼠離體心臟，BZTZ和西沙必利1 μmol·L-1可引起嚴(yán)重的心律失常，期前收縮數(shù)分別達(dá)到159±28和（61±13）次（P＜0.01），室速發(fā)生率分別為50%（P＜0.05）和25%，室顫發(fā)生率分別為37.5%和12.5%。莫沙必利和扎考必利對(duì)心律均無明顯影響，不引起心律失常的發(fā)生。扎考必利還可抑制西沙必利和BZTZ誘發(fā)的心律失常。4種激動(dòng)劑的促心律失常風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)依次為BZTZ＞西沙必利＞莫沙必利和扎考必利。結(jié)論IK1可能作為5-HT4受體激動(dòng)劑致心律失常副作用的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子和篩選安全5-HT4受體激動(dòng)劑和促胃腸動(dòng)力藥的新靶點(diǎn)。

內(nèi)向整流鉀通道；心律失常；5-羥色胺4型受體；促胃腸動(dòng)力藥

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2017.06.006

嚴(yán)重心律失常是心臟病患者的主要死因之一，利用藥物預(yù)防和治療心律失常是降低心律失?；颊咚劳雎?、提高心臟病患者生活質(zhì)量的主要手段之一。心肌離子通道的異常及由此引發(fā)的動(dòng)作電位形態(tài)的變化往往是心律失常的形成機(jī)制和藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。2013年，美國(guó)FDA提出了綜合體外致心律失常分析（comprehensive in vitro proarrhythmia assay，CiPA）的策略［1］。通過研究藥物對(duì)人心肌細(xì)胞多個(gè)離子通道和動(dòng)作電位的影響，輔以計(jì)算機(jī)模擬整合，最后結(jié)合臨床Ⅰ期研究中對(duì)人體心電圖的評(píng)估，構(gòu)成完整的CiPA策略。這一策略的核心和基礎(chǔ)即在于研究藥物對(duì)心臟多個(gè)離子通道功能的影響。根據(jù)美國(guó)安全藥理學(xué)會(huì)心臟離子通道工作組（Ion Channel Working Group）的建議，目前納入檢測(cè)的離子通道有7個(gè)，分別是可引起去極化的內(nèi)向電流鈣電流（ICa-L）、電壓依賴性快鈉電流（INaFast）和晚鈉電流（INaLate），及參與復(fù)極化的外向電流快速延遲整流鉀電流〔ether-a-gogo（hERG）電流，IKr〕、緩慢延遲整流鉀電流（IKs）、瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）和內(nèi)向整流鉀電流（inward rectifier potassium current，IK1）［2］。

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）又稱血清素，通過與相應(yīng)受體結(jié)合產(chǎn)生中樞或外周效應(yīng)。目前臨床應(yīng)用的促胃腸動(dòng)力藥如西沙必利（cisapride）、替加色羅（tegaserod）、普卡必利（prucalopride）和莫沙必利（mosapride）等都屬于5-HT 4型受體（5-HT4）激動(dòng)劑，用于治療胃輕癱、胃食管返流以及慢性便秘等多種消化道癥狀［3］，但是這類藥物的致心律失常副作用也引起了普遍擔(dān)憂。西沙必利和替加色羅由于嚴(yán)重的心律失常甚至致死性尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速等逐漸增多的心腦血管事件已先后退出市場(chǎng)［4-5］。這促使許多學(xué)者開始研究5-HT4受體激動(dòng)劑與心臟功能和節(jié)律的關(guān)系，試圖揭示其電生理機(jī)制。已有研究表明，西沙必利的致心律失常作用與其阻斷延遲整流鉀通道（IK）有關(guān)。IK由人類ether-a-gogo（hERG）K+通道基因編碼。Potet等［6］對(duì)4種不同的5-HT4受體激動(dòng)劑西沙必利、普卡必利、倫扎必利和莫沙必利對(duì)克隆的人心肌hEGG通道的作用進(jìn)行研究，并比較了它們致心律失常的潛力。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，這些藥物對(duì)人心肌hERG K+通道具有不同的親合力，西沙必利對(duì)hERG的阻斷作用最強(qiáng)，他們認(rèn)為促胃腸動(dòng)力藥物對(duì)hEGG通道的親和力是其致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)因子，那些沒有阻斷hERG電流副作用的5-HT4受體激動(dòng)劑可作為西沙必利安全的替代品。

扎考必利和西沙必利同屬5-HT4受體激動(dòng)劑，兩者化學(xué)結(jié)構(gòu)相似（圖1）。與西沙必利顯著的促心律失常副作用不同，扎考必利對(duì)心律和心功能均無明顯影響。探究其離子機(jī)制，西沙必利明顯抑制大鼠心室肌IK1，而扎考必利則可選擇性激動(dòng)IK1，其對(duì)ICa-L，INa，Ito，IKr，IKs，ATP敏感鉀電流（IKATP）、鈉鈣交換電流（INXC）和Na+-K+泵電流（Ipump）等影響心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的主要膜電流無明顯影響［7］。我們?cè)O(shè)想，IK1的變化會(huì)否和hERG通道相似，與藥物的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)存在內(nèi)在聯(lián)系，IK1通道能否作為體外篩選安全促胃腸動(dòng)力藥提供新靶點(diǎn)。為此，我們進(jìn)一步擴(kuò)大藥物檢測(cè)范圍，增加了兩種5-HT4受體激動(dòng)劑：莫沙必利（mosapride）和2〔1-（4-胡椒基）哌嗪〕基苯并噻唑{2-〔1-（4-piperonyl）piperazinyl〕benzothiazole，BZTZ}，這兩者同時(shí)具有5-HT4受體激動(dòng)劑和5-HT3受體阻斷劑的效應(yīng)，與扎考必利的受體作用非常相似。此外，為了避免藥物對(duì)IK的影響從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ，選擇SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因?yàn)榇笫笮募〖?xì)胞膜表面缺乏功能性IK。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察上述4種藥物對(duì)心室肌細(xì)胞IK1功能和蛋白表達(dá)的影響，并觀察它們對(duì)大鼠離體心臟心律的影響，從而判斷IK1能否作為5-HT4受體激動(dòng)劑致心律失常副作用的風(fēng)險(xiǎn)因子，為篩選安全促胃腸動(dòng)力藥提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和儀器

健康成年SD大鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，No.0025371，雄性，220～250 g。

莫沙必利、BZTZ、西沙必利和扎考必利購(gòu)自美國(guó)Tocris公司。小鼠抗人IK1（Kir2.1）單克隆抗體（SAB5200027，批號(hào)1205）、?；撬?、4-氨基吡啶（4-AP）、三磷酸腺苷二鉀鹽（ATP-K2）、三磷酸腺苷鎂鹽（ATP-Mg）、L-谷氨酸、EGTA和HEPES（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；膠原酶P（德國(guó)Bochringer Mannhein公司）；Lipofectamine 2000試劑盒（北京英駿生物技術(shù)有限公司）；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG多抗（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

Fig.1 Structures of four 5-hydroxytryptamine type 4（5-HT4）receptor agonists.

超純水配置臺(tái)氏液（mmol·L-1）：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 5.0，葡萄糖10，MgCl21.0，CaCl21.8，用NaOH調(diào)節(jié)PH至7.38。酶液為50 mL無鈣臺(tái)氏液中加入膠原酶3.5～5 mg，牛磺酸125 mg。KB液（mmol·L-1）：KOH 85，L-谷氨酸50，KCl 30，?；撬?0，KH2PO430，MgCl21.0，HEPES 10，葡萄糖10，EGTA 0.5，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.4。IK1電極內(nèi)液成分（mmol·L-1）：KCl 150，HEPES 5，EGTA 5.0，ATP-K23.0，MgCl21.0，4-AP 5.0，ATP-Mg 1.0，用KOH調(diào)節(jié)PH至7.3；細(xì)胞外液在臺(tái)氏液中加入CdCl20.5 mmol·L-1阻斷ICa-L電流。Kir2.1通道電流，細(xì)胞外液（mmol·L-1）：NaCl 136，KCl 5，CaCl21.8，MgCl21.0，葡萄糖10，HEPES 10，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。電極內(nèi)液（mmol·L-1）：KCl 40，天冬氨酸鉀80，KH2PO410，磷酸肌酸3，EGTA 5，HEPES 5，ATP-Mg 5，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.2。

Langendorff灌流裝置，澳大利亞AD Instruments公司；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；微電極拉制儀，日本Narishige公司；Axopatch 200B膜片鉗放大器和Digidate 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器，美國(guó)Molecular Device公司。

1.2 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)測(cè)定大鼠心室肌細(xì)胞IK1電流

Langendorff-原酶法分離大鼠心室肌細(xì)胞［7］。選取橫紋清晰的心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。形成高阻抗封接后，負(fù)壓破膜，進(jìn)行全細(xì)胞記錄。離子電流信號(hào)經(jīng)Axopatch 200B膜片鉗放大器、Digidate 1322A模數(shù)轉(zhuǎn)換器及Pclamp8.0采集、貯存及分析。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫25℃下進(jìn)行。

由于大鼠左心室IK1通道以Kir2.1亞單位為主［8］，重點(diǎn)觀察激動(dòng)劑對(duì)Kir2.1通道電流的影響。采用斜坡（ramp）方式鉗制細(xì)胞由-40 mV去極化至60 mV，然后再以20 mV·s-1的速度連續(xù)復(fù)極化和超極化至-140 mV，以電壓為橫坐標(biāo)，電流為縱坐標(biāo)顯示Kir2.1電流-電壓（I-V）關(guān)系曲線。

1.3 在HEK293細(xì)胞建立大鼠心肌Kir2.1通道基因表達(dá)系統(tǒng)

將大鼠心肌Kir2.1基因插入pEGFP-N1質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamine 2000試劑盒轉(zhuǎn)染入人胚胎腎293（human embryonic kidney，HEK-293）細(xì)胞。在含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄Kir2.1通道電流，觀察扎考必利和莫沙必利對(duì)異源表達(dá)Kir2.1通道電流的影響。

1.4 Western蛋白印跡法檢測(cè)大鼠心室肌細(xì)胞IK1Kir2.1蛋白表達(dá)

取4只健康成年SD大鼠，膠原酶法分離左心室肌細(xì)胞。大鼠左心室IK1通道以Kir2.1亞單位表達(dá)為主。將細(xì)胞梯度復(fù)鈣（Ca2+終濃度1.8 mmol·L-1）后分別放入5個(gè)10 mL EP管中，調(diào)整細(xì)胞懸液體積為每管5 mL。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、莫沙必利1 μmol·L-1組、西沙必利1 μmol·L-1組、BZTZ 1 μmol·L-1組和扎考必利1 μmol·L-1組。室溫孵育24 h后離心（600×g，5 min），棄上清，PBS沖洗2次后，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆??？偟鞍踪|(zhì)提取后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至NC膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入稀釋后的Kir2.1一抗（1∶1000）4℃過夜孵育，洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000）室溫下孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影，Bio-R ad曝光采集信息備用。Image J軟件對(duì)蛋白印跡進(jìn)行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用IA目標(biāo)蛋白/IAGAPDH比值表示。

1.5 離體大鼠心臟心電圖記錄

大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉65 mg·kg-1麻醉。麻醉后頸動(dòng)脈放血，迅速開胸取出心臟，通過主動(dòng)脈懸掛于Langendorff裝置上，恒溫37℃，100%氧氣飽和的臺(tái)氏液以7 kPa恒壓逆行灌流。將2根銀絲分別置于心尖部與右心房的心外膜下同步記錄心電圖（ECG）。平衡1 h待各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定后，分別給予1 μmol·L-1的西沙必利、扎考必利、莫沙必利、BZTZ或扎考必利+西沙必利和扎考必利+BZTZ灌流心臟，持續(xù)30 min，記錄給藥后30 min內(nèi)的室性期前收縮（premature ventricular beats，PVB）數(shù)目，室速（ventricular tachycardia，VT）和室顫（ventricular fibrillation，VF）發(fā)生率。心律失常類型：PVB，連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)以下的室性異位搏動(dòng)；VT，連續(xù)出現(xiàn)5個(gè)以上的室性早搏；VF，QRS波及T波消失，代之以一系列大小、形狀不同的不規(guī)則波動(dòng)。剔除自發(fā)心律失常的樣本。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 4種5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)心肌細(xì)胞膜IK1電流的影響

BZTZ、西沙必利和莫沙必利0.1～10 μmol·L-1可濃度依賴性抑制心肌IK1；在相同濃度時(shí)，BZTZ對(duì)IK1的抑制最明顯（圖2和3）。BZTZ、西沙必利和莫沙必利1 μmol·L-1使IK1內(nèi)向電流密度（命令電壓為-100 mV）由給藥前的（-8.05±1.02）pA·pF-1分別下降至（-5.88±1.21）pA·pF-1（P＜0.01），（-7.21± 0.33）pA·pF-1（P＜0.05）和（-7.41±1.37）pA·pF-1，使IK1外向電流密度（命令電壓為-60 mV）由給藥前的（2.82±0.10）pA·pF-1分別下降至（2.06±0.16）pA·pF-1（P＜0.01），（2.43±0.09）pA·pF-1（P＜0.01）和（2.56± 0.10）pA·pF-1（P＜0.01）。而在0.1～10 μmol·L-1范圍內(nèi)，扎考必利可增強(qiáng)IK1。1 μmol·L-1為其最大效應(yīng)濃度，使IK1內(nèi)向電流密度（命令電壓為-100 mV）增強(qiáng)至（-11.38±1.21）pA·pF-1（P＜0.01），外向電流密度（命令電壓為-60 mV）增強(qiáng)至（3.73±0.17）pA·pF-1（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of four 5-hydroxytryptamine type 4(5-HT4) receptor agonists on inward rectifier potassium current（IK1）in rat ventricular myocytes by whole-cell configration of patch-clamp technique.The dosage of the four agonists was 1 μmol·L-1，respectively.x±s，n=8 cells.

2.2 5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)Kir2.1通道電流的影響

課題組前期工作表明，扎考必利可增強(qiáng)Kir2.1電流，但有效濃度＞30 μmol·L-1［8］。大鼠左心室IK1通道以Kir2.1亞單位為主。圖4結(jié)果 顯示，扎考必利30 μmol·L-1可使Kir2.1通道電流（-60 mV）由（1.06±0.10）pA·pF-1增大至（1.25±0.07）pA·pF-1（P＜0.01），而莫沙必利10 μmol·L-1對(duì)Kir2.1通道電流無明顯影響。

Fig.3 Effect of different concentrations of four 5-HT4receptor agonists onIK1in rat ventricular myocytes by whole-cell configration of patch-clamp technique.x±s，n=8 cells.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control respectively.

Fig.4 Effect of mosapride and zacopride on Kir2.1 in HEK293 cells by whole-cell configration of patchclamp technique.The concentration was 10 μmol·L-1for mosapride and 30 μmol·L-1for zacopride.x±s，n=8.＊＊P＜0.01 compared with control.

2.3 4種5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞Kir2.1蛋白表達(dá)的影響

Western蛋白印跡結(jié)果 （圖5）顯示，扎考必利可上調(diào)大鼠心室肌細(xì)胞Kir2.1蛋白表達(dá)，西沙必利和BZTZ明顯下調(diào)Kir2.1蛋白（P＜0.05），而莫沙必利對(duì)Kir2.1通道蛋白表達(dá)無明顯影響。

Fig.5 Effect of four 5-HT4receptor agonists on Kir2.1 expression in rat left ventricular myocytes by Western blotting.The concentration of agents was 1 μmol·L-1respectively.x±s，n=4.＊P＜0.05，compared with control group.

2.4 4種5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠離體心臟心律的影響

4種5-HT4受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠離體心臟節(jié)律的影響（表1，圖6）。其中，BZTZ可引起明顯的心律失常，在30 min內(nèi)PVB數(shù)達(dá)到（159±28）個(gè)，8例離體心臟中4例出現(xiàn)VT，3例發(fā)展為VF。其次是西沙必利，PVB數(shù)（61±13）個(gè)，2例出現(xiàn)VT，1例發(fā)展為VF。莫沙必利和扎考必利對(duì)大鼠離體心臟的節(jié)律均無明顯影響，不引起心律失常的發(fā)生。值得注意的是，當(dāng)扎考必利分別與西沙必利和BZTZ聯(lián)合灌流心臟時(shí)，可以抑制西沙必利和BZTZ誘發(fā)的PVB。

Tab.1Effect of 5-HT4receptor agonists on heart rhythm inex vivorat hearts

Fig.6 Effect of four 5-HT4receptor agonists at 1 μ mol·L-1respectively on ECGS inex vivorat hearts.Representative electrocardiogram tracings（recorded fromⅡlimb leads with recorder speed 100 mm·s-1）before and after application.A：control；B：cisapride；C：zacopride；D：BZTZ；E：mosapride. See Tab.1 for the treatment.

3 討論

IK1通道廣泛存在于心臟特別是心室肌細(xì)胞，參與靜息膜電位的維持和心肌動(dòng)作電位3期終末的復(fù)極［9-10］。在心室肌靜息膜電位附近，IK1電導(dǎo)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于除ATP敏感鉀通道（IKATP）以外的其他離子通道，而IKATP在正常情況下是不激活的。因此，調(diào)節(jié)IK1必然影響心肌的興奮性和心律失常的發(fā)生。從理論上講，IK1下調(diào)將使膜去極化，細(xì)胞的興奮性和自律性增高，易化延遲后除極等觸發(fā)活動(dòng)的發(fā)生［9］；IK1的抑制使膜電阻增大，放大了跨膜電流引起的膜電位波動(dòng)，造成膜電位的不穩(wěn)定；抑制IK1還可延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，引發(fā)長(zhǎng)QT綜合征。臨床和實(shí)驗(yàn)研究也證明了阻斷IK1的致心律失常風(fēng)險(xiǎn)。氯喹是一種廣泛使用的抗瘧藥，它的安全劑量范圍很窄，在有效治療濃度可引起QRS和QT時(shí)間延長(zhǎng)，稍大濃度即可引發(fā)室性異位節(jié)律和致命性心律失常。有研究表明這些副作用主要是其對(duì)IK1通道的抑制引起的［11-12］。Andersen-Tawil綜合征是形成IK1的Kir2.1通道基因KCNJ2突變所致，突變基因通過負(fù)顯性抑制效應(yīng)使通道功能降低，多數(shù)患者出現(xiàn)QT延長(zhǎng)伴有室性心律失常［13］；突變的Kir2.1通道基因轉(zhuǎn)染給在體成年豚鼠心肌細(xì)胞，可導(dǎo)致IK1減小，動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)，靜息電位減小并不穩(wěn)定和明顯的異常自律性［14］。IK1減弱還是心衰時(shí)心律失常發(fā)生的重要機(jī)制［9，15］。心肌缺血和心肌梗死時(shí)發(fā)生的心律失常也與IK1的下降有關(guān)［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，4種5-HT4受體激動(dòng)劑可通過改變心肌IK1的功能或表達(dá)而影響大鼠的心律。西沙必利和BZTZ明顯抑制或下調(diào)IK1通道，表現(xiàn)出高促心律失常風(fēng)險(xiǎn)；莫沙必利作為目前臨床使用的促胃腸動(dòng)力藥，僅輕度抑制心肌IK1但不影響IK1表達(dá)，無促心律失常風(fēng)險(xiǎn)；同屬5-HT4受體激動(dòng)劑的扎考必利與前三者分子結(jié)構(gòu)相似，但選擇性激動(dòng)大鼠心肌IK1，無促心律失常風(fēng)險(xiǎn)。提示對(duì)大鼠心室肌IK1抑制效應(yīng)越強(qiáng)的藥物其致心律失常風(fēng)險(xiǎn)越高，對(duì)IK1表達(dá)無明顯影響或適度增強(qiáng)IK1的藥物無致心律失常風(fēng)險(xiǎn)甚至具有抗心律失常效應(yīng)。本研究中，扎考必利作為IK1特異性激動(dòng)劑可以抑制西沙必利和BZTZ誘發(fā)的心律失常，表明適度激動(dòng)IK1具有抗心律失常效應(yīng)。理論上講，激動(dòng)IK1可增大靜息膜電位（超極化），增加復(fù)極儲(chǔ)備，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，有利于消除異常自律性和延遲后除極等觸發(fā)活動(dòng)。對(duì)于那些與IK1降低相關(guān)的心律失常，激動(dòng)IK1很可能是有效的抗心律失常策略。4種藥物的促心律失常風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)依次為BZTZ＞西沙必利＞莫沙必利和扎考必利。Zhang等［8］的研究還發(fā)現(xiàn)，扎考必利對(duì)大鼠心肌IK1的激動(dòng)效應(yīng)不依賴于5-HT3和5-HT4受體，這可能是西沙必利、莫沙必利、BZTZ和扎考必利具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和5-HT受體效應(yīng)但是對(duì)IK1作用不同的原因。此外，也不能排除藥物對(duì)其他心肌細(xì)胞膜離子通道或受體的作用，僅通過單一通道的影響來評(píng)估藥物致心律失常和抗心律失常效應(yīng)是具有局限性的。如在大鼠，西沙必利除了抑制IK外，還對(duì)ICa-L、INa、Ito有抑制作用，BZTZ亦可抑制Ito。但是鑒于抑制或下調(diào)IK1的促心律失常風(fēng)險(xiǎn)，并結(jié)合本研究結(jié)果 ，推測(cè)IK1可以作為篩選5-HT4受體激動(dòng)劑是否具有促心律失常作用的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。以IK1為靶點(diǎn)，可以從發(fā)病機(jī)制的角度，為篩選安全的5-HT4受體激動(dòng)劑和促胃腸動(dòng)力藥提供一種更高效、便捷的方法。

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Effect of four 5-hydroxytryptamine type 4 receptor agonists on rat cardiac IK1channels and proarrhythmic risk stratification

LIU Qing-hua1＊,LI Yu2＊,CAO Xiao-na2,ZHANG Li3,ZHAI Xu-wen1
(1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Beijing Sports University Hospital, Beijing 100084,China;3.Shanxi Provincial Children′s Hospital,Taiyuan 030013,China)

OBJECTlVETo compare the effect of four 5-hydroxytryptamine type 4(5-HT4)receptor agonists:cisapride,zacopride,macopride and 2-[1-(4-piperonyl)piperazinyl]-benzothiazole(BZTZ),on rat cardiac inward rectifier potassium channel(IK1)and heart rhythm.METHODSThe whole-cell configuration of patch-clamp technique was used to record effects of 5-HT4receptor agonists on IK1in enzymatic dissociated rat ventricular myocytes or Kir2.1 transfected HEK 293 cells.Western blotting was used to observe the expression of Kir2.1 channel exposed 24 h to agents in ventricular myocytes.Langendorff-perfused hearts were perfused with four agents respectively for 30 min.The electrocardiogram was recorded simultaneously.RESULTSBZTZ,cisapride and mosapride 0.1-10 μmol·L-1decreased IK1in a concentrationdependent manner.At the same concentration(1 μmol·L-1),BZTZ showed the most potent inhibition on IK1(P＜0.01),followed by cisapride.Mosapride showed slight inhibition efficiency.However,zacopride enhanced IK1(P＜0.01).In Kir2.1 heterologous expression systems,zacopride activated Kir2.1 current (P＜0.01)while mosapride had no effect.In ex vivo Langendorff-perfused hearts,BZTZ and cisapride 1 μmol·L-1elicited singnificant rhythm disturbances,and the total of premature ventricular beats(PVB)were 159±28 and 61±13.50%(4/8)(P＜0.05)and 25%(1/8)of the hearts exhibited ventricular tachycardia(VT), while 37.5%(3/8)and 12.5%(1/8)of the hearts exhibited ventricular fibrillation(VF),respectively.Mosapride and zacopride had no side effects on heart rhythm.Zacopride also suppressed BZTZ-or cisapride-induced arrhythmias.BZTZ had the strongest proarryhthmic potency among the 5-HT4agonists,followed by cisapride, mosapride and zacopride.CONCLUSlONIK1might be an independent risk factor for arrhythmogenesis and a new target for screening safe 5-HT4receptor agonists and gastrointestinal prokinetic agents.

inward rectifier K+channel;arrhythmia;5-hydroxytryptamine type 4 receptors;gastrointestinal prokinetic agent

The project supported by National Natural Science Foundation of China(31200864);and Research Project Supported by Shanxi Scholarship Council of China(2016-059)

LIU Qing-hua,E-mail:liuqh20041206@163.com,Tel:13753119195

R966,R972+.2

A

1000-3002-（2017）06-0534-07

2016-10-12接受日期：2017-05-02）

（本文編輯：賀云霞）

國(guó)家自然科學(xué)基金（31200864）；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2016-059）

劉清華，女，副教授，主要從事心血管生理和藥理學(xué)研究；李瑜，女，本科，主治醫(yī)師，主要從事心血管臨床及生理和藥理學(xué)研究。

劉清華，E-mail：liuqh20041206@163.com，Tel：13753119195

＊共同第一作者。

＊Co-first author.