鄧紫婷 何紅晨 肖登

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，重慶 400050

骨質(zhì)疏松癥在世界多發(fā)病中列第6位，是發(fā)達(dá)國家最重要的健康問題之一，也是發(fā)展中國家一個日益突出的問題。2001年發(fā)表的美國國立衛(wèi)生研究院關(guān)于骨質(zhì)疏松的預(yù)防、診斷和治療共識[1]，認(rèn)為本病的特征是骨強(qiáng)度損害，骨折的危險增加。骨強(qiáng)度主要反映骨密度(BMD)和骨質(zhì)量的完整性[2]，骨質(zhì)量包括骨結(jié)構(gòu)、骨轉(zhuǎn)換、骨損傷的積累(比如微骨折)、骨礦化和骨材料的特性。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物繁多，但是因為治療周期長且副作用多，患者多難以堅持，由此脈沖電磁場物理治療骨質(zhì)疏松，因其效果明顯，無明顯副作用從而得到患者認(rèn)可。但是臨床雖然觀察到脈沖電磁場治療骨質(zhì)疏松有效，卻并無明確治療骨質(zhì)疏松的治療機(jī)制，為此進(jìn)行了其治療機(jī)制的研究。

而原子顯微鏡由于探針的針尖尺寸只有原子大小, 因而其分辨率可以達(dá)到納米級[3]，能對從原子到分子尺寸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維成像和測量,這是掃描電子顯微鏡很難達(dá)到的[4]。因此我們利用原子力顯微鏡對骨組織進(jìn)行觀察，研究其生物力學(xué)性能[5]，闡明脈沖電磁場治療骨質(zhì)疏松時骨組織的表面超微結(jié)構(gòu)變化。

1 材料和方法

1.1 動物和藥品

清潔級SD大鼠60只(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供)，雌性,體重(200±20)g，鼠齡3個月。飼養(yǎng)環(huán)境室溫(20～25)℃，相對濕度50%左右，日照12 h，室內(nèi)通風(fēng)良好，飼料和飲水均由動物中心提供，大鼠飲食及飲水自由。所有實(shí)驗大鼠均采用籠養(yǎng)管理。

1.2 試劑和儀器

阿倫膦酸鈉：石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，70 mg/盒，批號：H20061303；脈沖電磁場治療儀：蘇州好博公司，型號：HB 320；原子力顯微鏡: 由中科院智能研究中心提供，型號：Bruker/Dimension edge。

1.3 分組和造模

按SPSS軟件產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表將其分成對照組(Sham組)、去卵巢組(OVX組)、阿倫膦酸鈉治療組(ALN組)、PEMFs治療組(PEMFs組)，每組大鼠15只。骨質(zhì)疏松模型的建立采用去雙側(cè)卵巢法。除Sham組外對其他各組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，手術(shù)方法如下[6]：5%水合氯醛按 0.6mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉完畢后，將SD大鼠 俯臥位固定于手術(shù)臺上，背部常規(guī)備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，經(jīng)腰背部切口進(jìn)入腹腔，切除兩側(cè)卵巢，仔細(xì)止血，沖洗后逐層縫合肌肉、皮下組織、皮膚，對合皮膚，用75%酒精、碘酒消毒皮膚。術(shù)后每天青霉素4萬U肌注，共5天。Sham組僅切除卵巢部分周圍脂肪。

1.4 給藥方法

造模結(jié)束后第30天開始分組干預(yù)，依據(jù)Meeh-Rubner公式計算大鼠的等效給藥劑量，用電子稱稱取所需量的阿倫膦酸鈉，用生理鹽水配置成相應(yīng)濃度，置于酒精燈上加熱溶解后，冷卻備用。ALN組給予阿倫膦酸鈉灌胃，劑量2 mg/(kg·d)，1次/d，治療30 d。PEMFs組的脈沖電磁場治療儀治療，治療參數(shù)為：3.8 mT，8 Hz，每天治療2次，每次40 min，治療30 d。Sham組和OVX組手術(shù)后正常喂養(yǎng)，不予任何處理。

1.5 觀察指標(biāo)

每周各取大鼠股骨頭部分進(jìn)行石蠟包埋后均勻切成厚約5 mm左右切片，將脫鈣脫蠟切片保存于60%～70%酒精玻璃缸，用AFM分別觀察各組骨組織的骨陷窩、骨小管及鈣磷晶體，并計算其表面粗糙度，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 AFM掃描方式

采用AFM觀察, 掃描速率512 Hz。采用8 nm長、彈性系數(shù)k為40 N/m的Si3N4微懸臂, 掃描范圍5 μm×5 μm至1 μm×1 μm, 以輕敲模式(tapping mode)在大氣和室溫下直接觀察標(biāo)本。用倒置相差顯微鏡觀察股骨頸情況并選擇合適的掃描區(qū)域，每組隨機(jī)選擇3個標(biāo)本進(jìn)行掃描，每個標(biāo)本分別隨機(jī)選擇3 個不同的部位進(jìn)行5 μm×5 μm范圍的掃描；每個部位選擇1個區(qū)域進(jìn)行1 μm×1 μm掃描。當(dāng)掃描范圍為5 μm×5 μm時, 圖像采集為恒力模式(height mode)；掃描范圍為1 μm×1 μm時, 圖像采集為相位模式(phase mode)及恒力模式(height mode)。

骨組織表面粗糙度分析方法是隨機(jī)選擇每組的圖像(1 μm)各9 張, 且每張圖像隨機(jī)選取3 個不同部位, 應(yīng)用分析軟件(Version5.12R2;Digital Instrμments)進(jìn)行分析。并應(yīng)用系統(tǒng)軟件對1μm的圖像進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的立體重建。所有采集圖像均通過自動平滑(flatten auto)處理以消除慢掃描方向的低頻噪音。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨組織的AFM超微結(jié)構(gòu)像

圖1 骨組織的AFM超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of bone tissue by using atomic force microscopy

當(dāng)掃描范圍為5 μm ×5 μm時, AFM可以顯示, 對照組(Sham組)組織表面形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)示：鈣磷晶體呈小柱狀排列，骨小管溝通骨陷窩，骨陷窩為不規(guī)則橢圓形結(jié)構(gòu)，長軸直徑為0.3～1.2 μm，每個骨陷窩有10～60條骨小管與其交通，相鄰之間的骨陷窩間隔為0.2～0.5 μm，鈣磷晶體排列呈小柱狀，環(huán)繞著哈佛系統(tǒng)排列，單個晶體大小為0.06～0.2 μm,但仍有少數(shù)晶體大小為0.04 μm(圖1)。當(dāng)掃描范圍縮小至1 μm ×1 μm時, 組織表面變得凹凸不平, 其中可見許多顆粒狀物質(zhì), 呈柱狀排列, 部分融合呈片狀，可見大小不等的凹陷結(jié)構(gòu)域(圖1)。

去卵巢組(OVX組)可見骨小管直徑大小不一，骨陷窩數(shù)量明顯增加，成不規(guī)則橢圓形結(jié)構(gòu)，大部分融合為一體。鈣磷晶體大小不等，排列紊亂，部分呈團(tuán)狀排列，單個晶體大小為0.03～0.15 μm(圖1)。

阿倫磷酸鈉藥物治療組(ALN組)可見鈣磷晶體環(huán)繞著哈佛系統(tǒng)較為規(guī)律的排列，骨陷窩數(shù)量有所增多，成不規(guī)則橢圓形結(jié)構(gòu)，少部分有融合現(xiàn)象，每個骨陷窩有骨小管與其交通，排列不規(guī)則(圖1)。

PEMFs治療組(PEMFs組)鈣磷晶體部分呈小柱狀排列，有部分呈團(tuán)狀分布，大小不等；部分骨小管溝通骨陷窩，骨陷窩為不規(guī)則橢圓形結(jié)構(gòu)，數(shù)量增多，長軸直徑為0.5～2.2 μm，骨陷窩排列紊亂，部分融合成片(圖1)。

2.2 骨組織表面粗造度

模型組骨組織表面粗糙度明顯高于對照組(P<0.01), 提示造模成功，ALN組表面粗糙度明顯低于OVX組(P<0.05)，PEMFs組的表面粗糙度與OVX組相比，有明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而PEMFs組與 ALN組比較，其表面粗糙度無明顯差異(P>0.05)(表1、圖2)。

表1 各組大鼠骨組織表面粗糙度(Rq)分析(μm，±s)Table 1 Analysis of bone surface roughness (Rq) of rats in each group(μm，±s)

注：Sham組與OVX組比較，aP<0.01； Sham組與ALN組比較，bP>0.05；Sham組與PEMFs比較，cP>0.05；ALN與OVX組比較，dP<0.01；PEMFs與OVX組比較，eP<0.05；PEMFs與ALN組比較，fP>0.05

圖2 各組大鼠骨組織表面粗糙度Fig.2 Bone surface roughness of rats in each groupSham組與OVX組比較，aP<0.01； Sham組與ALN組比較，bP>0.05；Sham組與PEMFs比較，cP>0.05；ALN與OVX組比較，dP<0.01；PEMFs與OVX組比較，eP<0.05；PEMFs與ALN組比較，fP>0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是一種以骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨骼脆性增加，容易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。目前我國60歲以上老齡人口估計有1.73 億，是世界上老年人口絕對數(shù)量最多的國家。據(jù)我國大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查顯示: 50 歲以上人群以椎體和股骨頸骨密度值為基礎(chǔ)的骨質(zhì)疏松癥總患病率女性為20.7%，男性為14.4%， 60歲以上人群中骨質(zhì)疏松癥的患病率明顯增高，女性尤為突出[7]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病率逐漸上升，使骨質(zhì)疏松成為了我國的公共健康問題。

目前治療骨質(zhì)疏松的藥物頗多，但其副作用及治療費(fèi)用使許多患者無法長期堅持治療，而脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields, PEMFs)是由電流通過赫爾姆茲線圈所產(chǎn)生的具有脈沖間歇的磁場效應(yīng)，最早用來治療骨折延遲愈合及骨不連等，用于骨質(zhì)疏松的治療起源于 Bassett，他總結(jié)了 20 多年 PEMFs 治療的實(shí)驗研究，并用 Wolff 定律歸納其機(jī)理，認(rèn)為生物電在骨的代謝和重建中具有十分重要的意義，預(yù)言 PEMFs治療骨質(zhì)疏松具有良好的應(yīng)用前景[8]。其具有安全無創(chuàng)傷、副作用少、治療便捷、依從性好等多個優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過大量的動物實(shí)驗研究及臨床應(yīng)用，人們對脈沖電磁場的作用有了更加深入的認(rèn)識。

在臨床研究中，劉穎等[9]通過40例患者觀察低頻脈沖電磁場與阿侖膦酸鈉治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效比較發(fā)現(xiàn)，與阿侖膦酸鈉治療比較，短期內(nèi)脈沖治療在緩解疼痛，提高骨質(zhì)量和增加肌力方面具有與阿侖膦酸鈉相同的效應(yīng)，尤其是提高腰背肌肌力優(yōu)于阿侖膦酸鈉。劉勇華等[10]通過對120例患者進(jìn)行脈沖電磁場治療骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)脈沖電磁場可緩解原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的骨痛，效果較為顯著，能夠明顯改善患者的日常生活活動能力，可提高骨密度。

而基礎(chǔ)研究中人們發(fā)現(xiàn)低頻脈沖電磁場對于細(xì)胞的分化增殖具有促進(jìn)作用。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn) PEMFs 通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，而非增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化來促進(jìn)骨形成。周君等[12]通過脈沖電磁場聯(lián)合電針療法對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，脈沖電磁場在增加腰椎椎體骨密度，改善腰椎椎體骨生物力學(xué)性能方面優(yōu)于脈沖電磁場或電針療法單獨(dú)使用。謝肇等[13]發(fā)現(xiàn)脈沖電磁場對去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，沒有出現(xiàn)明顯的凋亡情況，但是使破骨細(xì)胞的活性減弱，而且可以見到明顯凋亡現(xiàn)象。并探討了治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。宋昆等[14]發(fā)現(xiàn)脈沖電磁場可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和鈣鹽分泌，從而加速傷骨愈合、加快骨組織代謝，同時應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)探索了電磁場對成骨細(xì)胞的作用機(jī)制。Querido等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過脈沖電磁場刺激后，聚集在成骨細(xì)胞的礦化增加，再通過利用掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡以及透射電子顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的特點(diǎn)為低結(jié)晶羥基磷灰石。

目前已經(jīng)對脈沖電磁場治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制進(jìn)行了多方面探討，已經(jīng)取得進(jìn)展，其中包括對其進(jìn)行宏觀生物力學(xué)的研究，證明脈沖電磁場對于骨質(zhì)疏松大鼠的生物力學(xué)性能有明顯療效。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，通過觀察骨組織中超微結(jié)構(gòu)可以獲得其對骨的力學(xué)和生理性能的影響，從而提高對骨質(zhì)疏松及骨折風(fēng)險預(yù)測的準(zhǔn)確性[16]。研究表明，微計算機(jī)斷層掃描技術(shù)(micro-computed tomography，micro-CT)已能準(zhǔn)確獲得骨細(xì)觀結(jié)構(gòu)參數(shù)，但無法完全獲得骨表面的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)[17]。掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)則被證實(shí)能有效地觀察到骨表面的活性狀態(tài)，并確定骨結(jié)構(gòu)的完整性[18]。而為了獲得骨結(jié)構(gòu)的微觀表征，研究者又將原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)應(yīng)用于骨的各種研究中[19-22]。Milovanovic等[21]使用AFM觀測到老齡女性股骨頸松質(zhì)骨的礦物顆粒尺寸要大于年輕女性，從而導(dǎo)致老齡女性松質(zhì)骨的彈性降低，骨折發(fā)生率增加。Zhang等[24]通過間歇性高頻率低載荷的全身振動對大鼠后肢廢用導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松進(jìn)行試驗，試驗發(fā)現(xiàn)骨宏觀力學(xué)性能的差異主要是由其微觀結(jié)構(gòu)的變化而引起，并非是因為骨材料本身發(fā)生了變化。而間歇7 天的高頻率低載荷全身振動能有效地改善了骨的宏觀生物力學(xué)特性和微觀結(jié)構(gòu)。Lin等[25]通過AFM可清晰觀察到牛的密質(zhì)骨的微觀結(jié)構(gòu)，清晰顯示了骨陷窩-骨小管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在縱向、橫向的大小尺寸。而陳斌等通過AFM對新鮮人尸體肱骨的觀察發(fā)現(xiàn)，在AFM下，骨組織中鈣磷晶體呈柱狀排列，骨小管溝通骨陷窩，骨小管直徑100～300 nm，骨陷窩為橢圓形結(jié)構(gòu)，長軸直徑4.1～10.5 μm,在礦化區(qū)膠原蛋白纖維增厚，呈小盤疊加形態(tài)。

本實(shí)驗通過原子力顯微鏡觀察大鼠骨組織，根據(jù)三維高度圖及相位圖顯示，Sham組可見骨小梁中骨陷窩規(guī)律排列，骨小管與之相溝通，形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在骨陷窩及骨小管周圍有大量鈣磷晶體呈柱狀排列，骨陷窩及骨小管圍繞哈弗管呈同心圓排列，起穩(wěn)定骨細(xì)胞及營養(yǎng)支持作用，這與Lin、Zhang等觀察到的相一致。而在OVX組可明顯觀察到骨陷窩形態(tài)大小變化，而其表面粗糙度與Sham組比較具有顯著差異(P<0.01)，即造模成功，表明經(jīng)去卵巢手術(shù)后，由于雌激素水平低下，改變了大鼠的股骨頸骨組織表面超微結(jié)構(gòu)，從而改變了骨組織的力學(xué)性能，為骨質(zhì)疏松的形成奠定了一定理論基礎(chǔ)。PEMFs組與OVX組比較，PEMFs組可見骨陷窩呈不規(guī)則橢圓形，分布不規(guī)則，且鈣磷晶體排列較為紊亂，兩組之間的表面粗糙度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，從力學(xué)特性角度反應(yīng)脈沖電磁場治療組大鼠相對于骨質(zhì)疏松組大鼠的骨重建速度較快[26]，即脈沖電磁場對于骨質(zhì)疏松的治療是有效的。而ALN組與PEMFs組的骨組織在三維高度圖及相位圖下均可見不同程度骨陷窩形態(tài)大小變化，兩組表面粗糙度對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，即脈沖電磁場相對于阿侖膦酸鈉治療骨質(zhì)疏松的療效沒有確切差異性。

總之本實(shí)驗利用AFM顯示, 脈沖電磁場治療大鼠骨質(zhì)疏松癥與阿侖膦酸鈉治療骨質(zhì)疏松癥的療效相當(dāng)，而AFM作為一種簡單方便的研究方案可以為脈沖電磁場的治療骨質(zhì)疏松時骨組織的超微形態(tài)學(xué)變化提供可靠的依據(jù)。