謝輝

湖北省荊門市第一人民醫(yī)院創(chuàng)傷手足外科，湖北 荊門 448000

骨質(zhì)疏松骨折已經(jīng)成為公共衛(wèi)生問(wèn)題，約有40%～50%的女性和13%～22%的男性一生中出現(xiàn)骨質(zhì)疏松骨折，防治骨質(zhì)疏松對(duì)臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)[1]。由于低骨密度(BMD)，骨強(qiáng)度降低，骨組織脆性增加，骨質(zhì)疏松性骨折延遲愈合，不愈合等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[2]。經(jīng)典Wnt信號(hào)/β-聯(lián)蛋白途徑在骨折的愈合中發(fā)揮重要的作用已被人們熟知，骨硬化蛋白(Scl)，是由Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)中骨細(xì)胞分泌的糖蛋白的抑制劑，已被證明是骨量和骨形成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)物[3]。最近的研究[4]表明，骨硬化蛋白單克隆抗體(Scl-Ab)有助于增加去卵巢(OVX)大鼠的骨量。綜上所述，我們假設(shè)，Scl-Ab也可能有助于骨折部位增加骨量，骨強(qiáng)度和骨形成促進(jìn)OVX大鼠骨折的愈合。

本研究通過(guò)使用骨硬化蛋白單克隆抗體來(lái)治療去卵巢大鼠股骨干骨折，觀察其療效，為臨床上此抗體的使用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

骨硬化蛋白單克隆抗體(MSD 公司)，Micro-CT (SkyScan1176，荷蘭)，手術(shù)操作器械(美國(guó)史塞克醫(yī)療器械公司)。鈣黃綠素 (sigma, 美國(guó))，硬組織切片機(jī)(EXAKT300，德國(guó))，顯微鏡(ZEISS Axio Imager M1，德國(guó))，Image-Pro Plus全自動(dòng)圖像分析儀(Media Cybernetics，美國(guó))，骨密度測(cè)量?jī)x(法國(guó)DMS公司，Lexxos)。

1.2 方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立：30只健康的雌性Sprague-Dawley大鼠(3月齡，體重 220～240 g。由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)用于去卵巢(OVX，n=25)制作骨質(zhì)疏松模型和假手術(shù)(Sham,n=5)。手術(shù)開始前，所有大鼠稱重，根據(jù)體重，適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，于大鼠背部正中線中下 1/3處作一長(zhǎng)約 2 cm 縱行切口，向兩側(cè)鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5 cm處鈍性分開肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織，輕輕提起卵巢，于輸卵管卵巢交界處絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。

1.2.2 股骨干骨折模型的建立：適量腹腔注射10% 水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后，常規(guī)消毒，取左下肢髕骨外側(cè)緣縱行切口，長(zhǎng)約 1 cm，逐層切開皮膚及部分股四頭肌腱性組織，屈曲膝關(guān)節(jié)并向內(nèi)側(cè)脫位髕骨，充分顯露股骨髁間凹。從股骨髁間凹處逆行插入 1 根 5 mL注射器針頭沿髓腔至股骨粗隆間。剪斷多余的針頭，并將其遠(yuǎn)端埋于股骨髁間骨皮質(zhì)下。碘伏及生理鹽水反復(fù)沖洗切口后，使用 3～0 絲線逐層縫合切口。 將動(dòng)物左下肢外展內(nèi)旋位固定于造模支架上， 通過(guò)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)的原理打擊大腿中部，致股骨中斷橫行骨折。

1.2.3 術(shù)后護(hù)理及藥物治療：術(shù)后前3 d給予青霉素肌肉注射(2. 5 萬(wàn)U/kg)預(yù)防感染。正常環(huán)境下飼養(yǎng)12 w后各組取5只大鼠處死股骨行骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)來(lái)檢驗(yàn)骨質(zhì)疏松建立模型建立情況。隨后所有的去卵巢(OVX)大鼠隨機(jī)的分成兩組：OVX組、Scl-Ab組。術(shù)后第1天開始給予藥物治療：Scl-Ab組：Scl-Ab皮下注射(劑量25 mg/kg，每w 2次)，OVX組注射相同劑量的生理鹽水，直至8 w，每周稱量大鼠體重，根據(jù)體重變化來(lái)調(diào)整藥物劑量。所有大鼠在處死前第 13天以及處死前第3天, 分別腹腔內(nèi)注射15 mg/kg劑量的鈣黃綠素。本實(shí)驗(yàn)所使用的藥物劑量參考以前發(fā)表的治療骨質(zhì)疏松效果明顯的文獻(xiàn)中所使用劑量[5]。

1.2.4 Micro-CT檢測(cè)：將骨折術(shù)后8w股骨標(biāo)本置于掃描床上，掃描參數(shù)設(shè)置:電壓50 kV，電流500 μA，掃描方式為360°旋轉(zhuǎn)，曝光時(shí)間250 ms，圖像平面分辨率1024×1024。每次掃描約持續(xù)10 min，掃描完成后，選擇圓柱形的骨折區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)(region of interest， ROI)，得到骨折端新生骨組織的三維圖像，并用Micro-CT內(nèi)置軟件(CT An software)進(jìn)行定量分析，獲得大鼠骨折區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積分?jǐn)?shù) (bone volume/total volume， BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb． Th)、骨小粱數(shù)量(trabeculae number， Tb． N)、骨小粱分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)。

1.2.5 骨折處組織切片：待所有股骨經(jīng)過(guò)Micro-CT檢測(cè)后，去掉股骨內(nèi)置針頭后，部分標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，甲基丙烯酸甲酯包埋。包埋塊修整后置于硬組織切片機(jī)沿脛骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度約為30～40 μm，切片在熒光顯微鏡及Image-Pro Plus 6.0 全自動(dòng)圖像分析儀對(duì)骨礦化沉積率(MAR) 進(jìn)行計(jì)算。剩下的部分標(biāo)本放置在 EDTA 脫鈣液中浸泡，每3～4天換液1 次，連續(xù)脫鈣4 w，X 線檢測(cè)是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋， 切片，HE染色，OLYMPUS BX5l多功能顯微鏡下觀察新生骨生長(zhǎng)情況，骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)及分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)對(duì)大鼠的影響

截止到實(shí)驗(yàn)截止時(shí)間，有2只大鼠由于手術(shù)不當(dāng)、麻醉不當(dāng)和傷口感染死亡，它們其中1只屬于OVX組，一只屬于Scl-Ab，最終共有18只去勢(shì)大鼠進(jìn)入最終試驗(yàn)結(jié)果評(píng)估。術(shù)后12 w時(shí)兩組大鼠股骨的骨密度變化骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)所得，Sham組大鼠的股骨骨密度為233.21±29.78 mg/cm2，而OVX組大鼠股骨骨密度為167.24±27.31 mg/cm2。相對(duì)Sham組，OVX組大鼠的骨密度下降42.59%(P<0.05)，結(jié)果表明我們的骨質(zhì)疏松模型建立是成功的。

2.2 Micro- CT圖片及骨微觀參數(shù)檢測(cè)

我們通過(guò)Micro- CT對(duì)骨折端感興趣區(qū)域進(jìn)行掃描的結(jié)果如圖1所示，通過(guò)內(nèi)置軟件計(jì)算的骨微觀參數(shù)如表1所示。我們可以通過(guò)觀察圖1 明顯的發(fā)現(xiàn)相對(duì)而言Scl-Ab組骨小梁的數(shù)量明顯多于OVX組，而且骨小梁聯(lián)系緊密，骨小梁更粗。骨微觀參數(shù)更加明顯的表明Scl-Ab組有最高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和最低Tb.Sp，而OVX組有最高的Tb.Sp和最低BV/TV、Tb.Th、Tb.N。和OVX組比較，Scl-Ab組骨微觀參數(shù)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些表明聯(lián)合使用Scl-Ab可以明顯增加去卵巢大鼠骨折端新生骨組織的生成，加速骨折的愈合。

圖1 藥物治療8 w時(shí)OVX組及Scl-Ab組大鼠股骨干骨折端Micro-CT掃描結(jié)果Fig.1 Micro-CT results of the femoral shaft fracture site in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatment

ParameterScl-AbOVXTb.N3.234±0.115*2.124±0.090Tb.Th0.198±0.016*0.118±0.011BV/TV0.534 ±0.013*0.178±0.016Tb. Sp0.412±0.037*0.657±0.129

注：與OVX組比較。*P<0.05

2.3 組織切片觀察結(jié)果

大鼠左側(cè)股骨切片經(jīng)過(guò)HE染色結(jié)果如圖2.A所示，我們可以清楚發(fā)現(xiàn)Scl-Ab組骨折處新生骨的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于OVX組，且新生骨之間聯(lián)系緊密，排列有規(guī)律，這表明Scl-Ab明顯加速骨折端新生骨組織的形成，HE切片的觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Micro-CT的結(jié)果。熒光共聚焦顯微鏡的觀察的結(jié)果如圖2.B所示，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0 計(jì)算OVX組、Scl-Ab組骨礦化沉積率(MAR)結(jié)果如下：0.80±0.09、1.56±0.10；通過(guò)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)表明各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這表明聯(lián)合使用Scl-Ab可以加速骨折端新生骨組織的礦化。

圖2 A. 藥物治療8周時(shí)OVX組及Scl-Ab組骨痂HE染色切片B. 藥物治療8周時(shí)OVX組及Scl-Ab組骨痂礦化情況Fig.2 A. HE staining in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatmentB. Mineralization of the callus in OVX and Scl-Ab group after 8 weeks of the treatment

3 討論

本研究通過(guò)去卵巢手術(shù)來(lái)建立骨質(zhì)疏松模型，正常狀況下飼養(yǎng)3月后通過(guò)檢測(cè)股骨骨密度變化情況來(lái)確保骨質(zhì)疏松建立是成功的；隨后通過(guò)三點(diǎn)彎曲原理建立閉合股骨中斷橫行骨折，通過(guò)使用Scl-Ab來(lái)治療去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松骨折，Scl-Ab使用8w后處死大鼠取股骨行Micro-CT、硬組織切片等評(píng)估；我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Scl-Ab可以明顯增加去卵巢大鼠股骨干骨折處新生骨組織的生成，加速骨折的愈合以及骨質(zhì)的礦化。

本實(shí)驗(yàn)主要研究的是原發(fā)性骨質(zhì)疏松狀態(tài)下的骨折，原發(fā)性骨質(zhì)疏松分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要由于雌激素的不足，因此，骨形成較快，但破骨更快，屬于高轉(zhuǎn)化型。老年型骨質(zhì)疏松，骨量丟失較慢，屬于低轉(zhuǎn)化型[6]。但無(wú)論哪種骨質(zhì)疏松癥，骨形成和骨吸收的平衡打破了，都將影響骨質(zhì)最終導(dǎo)致一系列的病理性骨折如做常見(jiàn)的骨質(zhì)疏松骨折，因此其骨折愈合能力大大下降。目前可以促進(jìn)骨質(zhì)疏松骨折愈合的藥物繁多，但均存在各自的局限性。雖然雙膦酸鹽類、甲狀旁腺素類藥、地諾單抗在治療骨質(zhì)疏松骨折中都有不錯(cuò)的療效，但是常常會(huì)出現(xiàn)一些不利因素影響其臨床應(yīng)用，如雙膦酸鹽類人體吸收率低，不適用于有血栓栓塞性疾病或腎功能不全者[7]；地諾單抗使用時(shí)出現(xiàn)下頜骨壞死率[8]；甲狀旁腺素需皮下注射，應(yīng)用不便，且不可用于骨骺線尚未閉合的青少年患者[7]。

本實(shí)驗(yàn)選用的治療骨質(zhì)疏松骨折的藥物Scl-Ab在治療骨質(zhì)疏松癥也有著不錯(cuò)的效果，是目前治療骨質(zhì)疏松癥一種非常有潛力的一種藥物[4]。Scl是由SOST基因編碼，具有通過(guò)Wnt通路負(fù)向調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白活動(dòng)及骨代謝，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原因之一。Scl-Ab可以可拮抗骨硬化蛋白對(duì)骨形成的負(fù)向調(diào)節(jié)作用，在抑制骨量丟失的同時(shí)促進(jìn)骨生成。在本實(shí)驗(yàn)中的Scl-Ab組8w時(shí),可以看見(jiàn)大量排列整齊且成熟的編織骨形成，且骨組織之間聯(lián)系緊密,而OVX組股骨干骨折處新生骨組織排列紊亂稀疏,且骨組織之間聯(lián)系不緊密.同時(shí),本試驗(yàn)還利用Micro-CT測(cè)定各組的新骨圍觀, Scl-Ab組的新骨密度要明顯高于OVX組 (P<0.05)。通過(guò)Micro-CT對(duì)骨微觀結(jié)構(gòu)的觀察中，發(fā)現(xiàn)Scl-Ab組與OVX組比較中，在骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)都增高(均P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)降低(P<0.05)，表明Scl-Ab在增加骨折端骨量的同時(shí)也改善了骨質(zhì)量。硬組織切片進(jìn)一步證實(shí)Micro-CT的結(jié)果，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Scl-Ab明顯可以加速新生骨組織的礦化，增加骨質(zhì)強(qiáng)度。

本次試驗(yàn)也有其局限性，首先我們實(shí)驗(yàn)使用的大鼠數(shù)量有限，且時(shí)間較短，8w之后動(dòng)物骨質(zhì)疏松的具體情況不知。我們沒(méi)有從生化角度進(jìn)一步觀察Scl-Ab加速骨折愈合的具體改變，同時(shí)也沒(méi)有進(jìn)一步探索機(jī)制。但是這次試驗(yàn)從體內(nèi)很好的證實(shí)Scl-Ab可以促進(jìn)骨折端骨量的增加、加速骨組織的礦化及加速骨質(zhì)疏松骨折的愈合，為其在臨床上骨質(zhì)疏松骨折的愈合治療使用提供了理論基礎(chǔ)。