高世蘭，張曉娜，胡方杰，李積東，蒲小燕，永 勝

(青海大學醫(yī)學院，西寧 810001)

低氧對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力及氧依賴殺傷功能的影響*

高世蘭，張曉娜，胡方杰，李積東，蒲小燕，永 勝§

(青海大學醫(yī)學院，西寧 810001)

目的 探討低氧對小鼠腹腔巨噬細胞(Mφ)吞噬殺傷能力，IL-6、TNF-α分泌功能的影響。方法 ①用流式細胞儀檢測小鼠腹腔Mφ對FITC標記金黃色葡萄球菌的吞噬能力；②用雙乙?；葻晒馑?DCFH-DA)熒光探針法檢測Mφ呼吸爆發(fā)功能；③用ELISA試劑盒檢測小鼠Mφ培養(yǎng)上清中的NO濃度；④用ELISA試劑盒檢測小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中的IL-6、TNF-α濃度。結(jié)果 低氧暴露30 d后，模擬海拔5000 m實驗組小鼠與常氧對照組(海拔400m)相比，小鼠腹腔Mφ吞噬能力、呼吸爆發(fā)能力及NO釋放量顯著降低(P<0.05)，細胞培養(yǎng)上清中的IL-6、TNF-α的濃度明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 模擬海拔5000 m低氧暴露30 d后，Mφ的吞噬能力和氧依賴殺傷功能降低，Mφ分泌IL-6、TNF-α的水平升高。說明低氧在一定程度上降低Mφ抗原清除能力并引發(fā)炎性反應(yīng)。

低氧 Mφ 吞噬能力呼吸爆發(fā) NO IL-6 TNF-α

急進高原時，機體免疫功能發(fā)生改變，表現(xiàn)為T細胞的重新分布，免疫球蛋白、淋巴細胞增殖及細胞因子分泌水平變化[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，模擬海拔8000 m，低氧暴露下的小鼠脾T淋巴細胞增值能力降低，脾CD3+、CD4+、CD8+細胞數(shù)減少；大鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞活化水平均下降，而B淋巴細胞增殖功能未見明顯變化[3]。在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的T淋巴細胞的成熟延緩，細胞因子的分泌發(fā)生改變[4-5]。有關(guān)低氧環(huán)境對機體免疫損傷的研究是醫(yī)學熱點難點之一，因此有關(guān)低氧損傷的免疫機制及其防治措施的研究越來越受到關(guān)注。目前有關(guān)低氧對機體免疫系統(tǒng)的研究多側(cè)重于淋巴細胞，但對Mφ功能改變的報道甚少。Mφ是參與固有免疫應(yīng)答的重要細胞，具有吞噬殺傷、抗原提呈、腫瘤抑制、生物活性物質(zhì)分泌等多種功能[6]。本研究模擬海拔5000 m環(huán)境，觀察低氧暴露下的小鼠Mφ功能改變，探討低氧條件對機體固有免疫細胞-Mφ吞噬殺傷以及分泌細胞因子功能的影響，為低氧對固有免疫的影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物

健康雄性BALB/c小鼠，4～6周齡，購買于西安交大醫(yī)學院，合格證號：SCXK(陜2007-001)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

無菌操作臺(ZHJH-C2019C，上海智城分析儀器制造有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma，美國)；小型臺式離心機(Eppendorf 5148R，德國)；酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-RAD xMark，美國)；恒溫搖床(ZD-85，精達儀器制造廠) ；低壓氧艙(DYC-3000，貴州航空風雷軍械有限責任公司)；流式細胞儀(BD FACS Calibur，美國)。

1.2.2 試劑

脂多糖(LPS，Sigma公司)；RPMI-1640(索萊寶公司，北京)；PBS 緩沖液(北京索萊寶公司)；IL-6、TNF-a、NOELISA試劑盒(TSZ，美國)；異硫氰酸熒光素(FITC，ebioscienc美國)；雙乙酰基二氯熒光素(DCFH-DA，Sigma公司)；N-甲酞-甲硫氨酞-亮氨酞苯丙氨酸(fMLP，Sigma公司)；豆蔻酰佛波醇乙酷(PMA，Sigma公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 低氧動物模型建立

小鼠常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后分兩組。低氧實驗組小鼠飼養(yǎng)于青海大學醫(yī)學院高原醫(yī)學中心低壓氧艙(模擬海拔5000m)，常氧對照組小鼠飼養(yǎng)于西安交大醫(yī)學院常規(guī)動物室(海拔400m)，兩組小鼠在18 ℃～22 ℃室溫條件下分籠喂養(yǎng)30 d。

1.3.2 Mφ吞噬能力檢測

1.3.2.1 小鼠腹腔Mφ制備：參照文獻方法[7]，分離獲取腹腔Mφ(細胞濃度調(diào)整至1×106個/mL)。

1.3.2.2 FITC標記細菌的制備：參照文獻方法[8](細胞濃度調(diào)整至1×106個/mL)。

1.3.2.3 吞噬能力檢測：參照文獻方法[8]，細胞用流式細胞儀檢測，用 FITC標記細胞的陽性細胞百分率表示Mφ吞噬率，陽性細胞平均熒光強度(x-Mean)代表Mφ吞噬能力(吞噬指數(shù))[9]，每個樣本均檢測10000個細胞。

1.3.3 Mφ呼吸爆發(fā)檢測

1.3.3.1 探針DCFH-DA裝載：參照文獻方法[8](細胞濃度調(diào)整至1×106個/mL)。

1.3.3.2 呼吸爆發(fā)能力檢測：參照文獻方法[8]，用FL1直方圖陽性細胞平均熒光強度(x-Mean)表示ROS水平(圖1)[10]。

1.3.4 小鼠Mφ培養(yǎng)上清中的NO水平檢測

將1×106個/mL Mφ細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(100μL/孔)，每孔加入100 μL LPS (5、10、20、40μg/mL，設(shè)未刺激對照組)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用NO檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清。檢測嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.5 小鼠Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的釋放水平檢測

將1×106個/mL Mφ細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(100μL/孔)，每孔加入100 μL LPS(終濃度為10μg/mL)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用IL-6、TNF-α試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清。檢測嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

常氧組 低氧組

Figure 1 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages respiratory burst in mice

2 結(jié)果

2.1 低氧對Mφ吞噬能力的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對照組相比，低氧組小鼠腹腔Mφ的吞噬率以及吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.01)，說明低氧暴露致使小鼠Mφ吞噬抗原異物功能降低。數(shù)據(jù)詳見表1。

Table 1 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages phagocytosis in ±s)

2.2 低氧對Mφ呼吸爆發(fā)功能的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對照組相比，低氧實驗組小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著降低(P<0.01)，說明低氧暴露使小鼠腹腔Mφ氧依賴殺傷功能降低。組內(nèi)比較，刺激物fMLP、PMA濃度為0.1～10 μmo1/L時與未加刺激物比較，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著升高(P<0.01)；刺激物fMLP、PMA濃度為1～10 μmo1/L時與0.1 μmo1/L比較，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著升高(P<0.01)；刺激物fMLP、PMA濃度為10 μmo1/L時與1 μmo1/L比較，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著升高(P<0.01)。說明隨著刺激物濃度的增加，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平也隨之升高。數(shù)據(jù)詳見表2、3。

Table 2 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages respiratory burst in ±s)

*：compared with 0 μmo1/L groupP<0.01；#，compared with 0.1 μmo1/L groupP<0.01；△，compared with 1 μmo1/L groupP<0.01.

Table 3 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages respiratory burst in ±s)

*：compared with 0 μmo1/L groupP<0.01；#，compared with 0.1 μmo1/L groupP<0.01；△，compared with 1 μmo1/L groupP<0.01.

2.3 低氧對LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔MφNO產(chǎn)生的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對照組相比，低氧實驗組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著降低(P<0.01)，說明低氧暴露使小鼠腹腔Mφ氧依賴殺傷功能降低。組內(nèi)比較，刺激物LPS濃度為(5～40)μg/mL時與未加刺激物比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)；刺激物LPS濃度為(10～40)μg/mL時與5 μg/mL比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)；刺激物LPS濃度為(20～40)μg/mL時與10 μg/mL比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)；刺激物LPS濃度為40 μg/mL時與20 μg/mL比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)。說明隨著刺激物濃度的增加，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度也隨之增加。數(shù)據(jù)詳見表4。

*：compared with 0 μg/mL groupP<0.01；#，compared with 5 μg/mL groupP<0.01；△，compared with 10 μg/mL groupP<0.01；□，compared with 20 μg/mL groupP<0.01.

2.4 低氧對Mφ分泌IL-6、TNF-α的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對照組相比，低氧實驗組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度顯著上升(P<0.01)。說明模擬海拔5000 m低氧暴露可使小鼠Mφ分泌細胞因子的能力發(fā)生改變。組內(nèi)比較，刺激物LPS濃度為10 μg/mL時與未加刺激物比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度顯著增加(P<0.01)。數(shù)據(jù)詳見表5。

組別nIL-6LPS0μg/mLLPS10μg/mLTNF-αLPS0μg/mLLPS10μg/mL常氧組1034．2±3．345．3±4．5?48．7±3．569．4±8．2?低氧組1049．2±5．887．6±7．6?70．4±4．1112．6±25．2?t7．09415．21612．724 5．142P<0．001<0．001<0．001 <0．001

*：compared with 0 μg/mL groupP<0.01.

3 討論

研究表明，低氧應(yīng)激造成免疫功能穩(wěn)態(tài)的破壞，出現(xiàn)免疫抑制、機體易感性增加[1，11-12]。據(jù)文獻報道，高原肺水腫患者外周血中白細胞和中性粒細胞明顯增高，并且血漿腫瘤壞死因-α(TNF-α)、IL-6、內(nèi)皮素-1(ET-1)、CRP含量亦顯著增高[13-14]。重癥急性高原病患者的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8含量均明顯高于高原健康人群[15]。以上研究說明低氧可導(dǎo)致機體的防御功能受損。固有免疫系統(tǒng)是機體防御病原體侵襲的第一道防線，固有免疫細胞能吞噬、分解生物大分子，殺滅病原體。Mφ是固有免疫應(yīng)答中重要的細胞成分，具有吞噬殺傷病原體、提呈抗原、分泌細胞因子及抑制腫瘤等多種功能，構(gòu)成了機體非特異防御的主要基礎(chǔ)[16]。Mφ通過其表面抗原識別受體(如Fc受體)識別抗原異物并促進其吞噬[17]，吞入細胞內(nèi)的抗原異物通過 “呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生大量活性氧(ROS，reactive oxygen species)這類高活性的殺菌物質(zhì)清除[18]，另外活化的Mφ所產(chǎn)生的誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)可催化L-精氨酸與氧分子反應(yīng)產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)，NO與過氧化氫(H2O2)或過氧化物酶結(jié)合產(chǎn)生過亞硝酸鹽基，殺傷清除細菌。有研究表明，高原低氧可使人外周血中性粒細胞NADPH活性降低，從而影響其免疫功能[19]。據(jù)文獻報道，低氧抑制MφNADPH 氧化酶的活性[20]。另外，低氧導(dǎo)致Mφ的吞噬能力降低[21-22]，清除金黃色葡萄球菌的功能受到抑制[23]。Mφ分泌IL-6、TNF-α等多種細胞因子，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展[24]。低氧可引起高原人群血清中IL-6、TNF-α的上升[25]。研究表明，肺動脈高壓大鼠模型中，低壓低氧致使大鼠血清中TNF-α、IL-6分泌增加[26]。據(jù)報道，活化的Mφ可分泌IL-6、TNF-α促炎癥因子而引起廣泛的組織損傷、多器官炎性反應(yīng)[6，27]。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α具有活化Mφ、增強Mφ殺傷功能、提高中性粒細胞吞噬能力及增強NK細胞的細胞毒作用[16]。本實驗在低氧暴露下，用fMLP、PMA作為刺激劑，觀察Mφ吞噬殺傷功能變化；用LPS作為Mφ的刺激劑，觀察Mφ分泌炎性因子IL-6、TNF-α以及NO的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模擬海拔5000 m高原低氧暴露30 d后，小鼠腹腔Mφ吞噬能力及氧依賴殺傷功能明顯低于常氧對照組，而分泌IL-6、TNF-α水平顯著高于對照組。相同濃度刺激物LPS作用下，NO的分泌水平隨著刺激濃度的增加而增加。

本研究顯示，模擬海拔5000 m低氧暴露可導(dǎo)致小鼠腹腔Mφ吞噬殺傷功能降低、分泌細胞因子能力增加，使清除抗原能力降低，引發(fā)炎性反應(yīng)，抑制Mφ免疫功能。

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Effects of Plateau Hypoxia on Phagocytosis and Oxygen-dependent Catalyticactivity of Peritoneal Macrophages in Mice

GAO Shi-lan，ZHANG Xiao-na，HU Fang-jie，LI Ji-dong，PU Xiao-yan，YONG Sheng§

(Qinghai University Medical College，Xining，810001，China)

Objective To explore the influences of hypoxia on the phagocytosis and cytolyticactivity as well as secretion variation of Interleukin-6(IL-6)and Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)of peritoneal macrophages in mice.Methods (1)Using flow cytometry to detect the phagocytosis and cytolyticactivity of peritoneal macrophages to staphylococcus aureus marked with fluorescein isothiocyanate(FITC).(2)The respiratory burst level of the cultured macrophage in mice was detected with 2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)fluorescent probe method.(3)The concentration of nitric oxide(NO)of the cultured macrophage supernatant in mice was determined with ELISA kits.(4)The concentration of IL-6 and TNF-α of the cultured macrophage supernatant in mice was also measured with ELISA kits.Results Compared with the normoxic control group(400m)，the hypoxia group(5000m)exposed under simulated altitude of 5000 m for 30 days，all of the phagocytosis，respiratory burst level and NO release decreased(P<0.05)，while the concentration of IL-6 and TNF-α in the Mφ supernatant of the hypoxia group were significantly increased(P<0.05).Conclusion After exposed to hypoxia at simulated altitude of 5000 m for 30 days，the phagocytosis and cytolyticactivity of mice are suppressed and the cytokines secretion level of IL-6 and TNF-α in Mφ are increased.It suggests that plateau hypoxia can suppress the antigen clear functions of Mφ and induce inflammatory reactions in mice.

Hypoxia Macrophages Phagocytosis Respiratory burst IL-6 TNF-α

﹡：國家自然科學基金項目(81060249)；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2014-ZJ-715，2015-ZJ-741)；§：通信作者，博士，副教授，E-mail：yongsheng@qhu.edu.cn 高世蘭(1992～)，女，藏族，青海籍，免疫學在讀碩士研究生

R392

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.008

2016-11-09