李生強(qiáng) 馮爾宥 謝冰穎 謝麗華 陳娟 許惠娟 葛繼榮*

1. 福建省中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室，福建 福州 350003 2. 廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，福建 福州 350007

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是老年人中的常見病、多發(fā)病，是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病。中醫(yī)學(xué)把骨質(zhì)疏松癥歸為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇[1]，主要是由于腎精不足、骨失滋養(yǎng)導(dǎo)致的全身骨骼的慢性退行性疾病，腎虛是其核心病機(jī)。在臨床上以腎陰虛證、腎陽虛證及陰陽兩虛證較為常見[2]。腎陽，又稱命門之火，為人體陽氣之根本，腎陽虛的程度與疾病的發(fā)生發(fā)展有緊密的聯(lián)系，但腎陽虛證的本質(zhì)仍有待進(jìn)一步研究。

高通量組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為中醫(yī)證本質(zhì)的研究提供了新的技術(shù)平臺(tái)。課題組前期已從外周血入手，采用芯片技術(shù)分析骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證的基因表達(dá)譜特征。本實(shí)驗(yàn)采用人全基因組表達(dá)譜芯片檢測骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證的骨組織基因表達(dá)譜，與骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證組、骨質(zhì)疏松癥無腎虛證組和正常骨密度對(duì)照組比較，篩選骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證與其他3組的共同差異基因，探討腎陽虛證相關(guān)基因的信息學(xué)特征。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

從福州市第二醫(yī)院門診隨機(jī)選擇即將進(jìn)行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者，檢測骨密度，依據(jù)中醫(yī)辨證分型，將原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者分為腎陽虛證組3例、腎陰虛證組3例、無腎虛證組3例，正常骨密度對(duì)照組3例，共12例，年齡52～68歲，平均(62.35±4.64)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)者，參照《中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標(biāo)準(zhǔn)(第二稿)》[3]；②符合中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)者，參照全國中西醫(yī)結(jié)合虛證與老年病研究專業(yè)委員會(huì)1986年制定的《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》[4]；③患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不符合西醫(yī)診斷及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)者；②繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥者；③合并有心腦血管、胃腸道等嚴(yán)重疾病者；④肝、腎功能檢查異常者。

1.2 主要儀器和試劑

雙能X射線骨密度儀(美國Hologic Discovery WI)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，RNEASY Mini Kit(QIAGEN公司)，人4×44K全基因表達(dá)譜芯片(Agilent公司)，核酸檢測儀Nanodrop ND-1000 (美國Thermo scientific公司)，芯片雜交爐(Agilent公司)，基因芯片掃描儀Agilent DNA Microarray Scanner(Agilent公司)。

1.3 骨密度測定

采用美國Hologic Discovery WI型雙能X線骨密度儀(精度：<1%)檢測患者腰椎正位(L2-4)、大轉(zhuǎn)子和Ward’s區(qū)骨密度(g/cm2)。

1.4 RNA提取及質(zhì)量驗(yàn)證

從髖關(guān)節(jié)置換術(shù)取下的人股骨頭中，取硬質(zhì)骨1 g，迅速置于液氮中保存。使用Trizol一步法提取人骨組織中的總RNA，通過Nanodrop ND-1000讀取260 nm和280 nm處的吸光度值(A)，測定RNA溶液的純度。經(jīng)l%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。

1.5 cDNA/aRNA樣品合成和標(biāo)記

總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit純化，用Ambion的RNA Fragmentation Reagents對(duì)標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。

1.6 基因芯片雜交及掃描

采用美國Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4×44K基因)，在芯片雜交爐中65 ℃雜交17 h，然后洗脫、染色。最后用Agilent DNA Microarray Scanner掃描儀掃描。

1.7 芯片數(shù)據(jù)處理與分析

雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對(duì)于兩組比值的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。共同差異表達(dá)基因是在獲得多組差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上，采用Excel的函數(shù)vlookup進(jìn)行分析獲得。最后通過NCBI、OMIM、DAVID、KEGG等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行相關(guān)功能分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證差異表達(dá)基因的篩選

骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證組與正常對(duì)照組相比，篩選差異表達(dá)基因2631條，其中表達(dá)上調(diào)1118條，表達(dá)下調(diào)1513條；骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證組與腎陰虛證組相比，篩選差異表達(dá)基因3976條，其中表達(dá)上調(diào)1622條，表達(dá)下調(diào)2354條；骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證組與無腎虛證組相比，篩選差異表達(dá)基因6184條，其中表達(dá)上調(diào)2581條，表達(dá)下調(diào)3603條。骨質(zhì)疏松癥腎陽證組與其他3組的差異基因中，1037條為共同差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)的基因?yàn)槟I陽虛證的特異表達(dá)基因，其中上調(diào)的有486條，下調(diào)的有551條。按功能對(duì)其進(jìn)行大致分類，可分為免疫相關(guān)、通道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、骨鈣代謝相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等幾類(見表1)。

表1 原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證與其他3組骨組織比較部分差異基因Table 1 Differentiated genes in the bone tissue in primary osteoporosis with kidney-yang deficiency syndrome

2.2 骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證組與其他3組比較的共同差異表達(dá)基因GO基因信息學(xué)分析

對(duì)1087條差異表達(dá)基因進(jìn)行GO基因信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因參與了137個(gè)生物學(xué)代謝途徑，其中主要包括：參與生物過程調(diào)節(jié)，如發(fā)育過程調(diào)節(jié)、多細(xì)胞機(jī)體調(diào)節(jié)、生物合成過程調(diào)節(jié)；參與分子功能，如生長因子結(jié)合，多糖、激素受體結(jié)合等。此外，這些差異基因還是細(xì)胞的重要化學(xué)組成，如細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外區(qū)域等。

2.3 骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證差異表達(dá)基因Pathway分析

在kegg網(wǎng)站對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些基因參與了22條信號(hào)通路，補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、Hedgehog、TGF-beta、細(xì)胞周期、維生素消化與吸收、神經(jīng)活性的配體-受體相互作用等22條信號(hào)通路。

3 討論

“證”是中醫(yī)對(duì)疾病某一階段機(jī)體整體反應(yīng)狀態(tài)的病理概括[5]，它是整體病理狀態(tài)的反映，是復(fù)雜交錯(cuò)動(dòng)態(tài)變化的?！白C”是辨證論治的起點(diǎn)和核心，證本質(zhì)的研究是中醫(yī)現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，如能獲得突破性進(jìn)展，必將使中醫(yī)理論研究取得質(zhì)的飛躍。

過去幾十年，國內(nèi)學(xué)者從生化指標(biāo)、基因多態(tài)性、單基因表達(dá)等方面進(jìn)行腎陽虛證本質(zhì)研究，取得了一定成績。但由于研究手段、規(guī)模的限制，至今未能取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展?；蛐酒冉M學(xué)技術(shù)的發(fā)展為中醫(yī)微觀整體提供了強(qiáng)大的工具。沈自伊院士[6]提出，遵循中醫(yī)學(xué)研究本身的內(nèi)在規(guī)律，充分利用功能基因組學(xué)的研究成果，建立中醫(yī)證的表達(dá)譜，將是21世紀(jì)中醫(yī)藥學(xué)的主要發(fā)展趨勢。沈自伊院士采用以藥測證的方式對(duì)腎虛和腎陽虛大鼠的下丘腦、腎上腺、垂體及淋巴細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較研究，認(rèn)為腎陽虛證的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是甲狀腺激素促進(jìn)能量代謝的氧化磷酸化過程[7]。

與血液分離白細(xì)胞相比，從骨組織中直接提取總RNA研究骨質(zhì)疏松癥更能整體、客觀地反映骨組織內(nèi)基因表達(dá)的情況，更能了解活體中的骨代謝狀態(tài)。因此，本研究采用病證結(jié)合的方式，以全基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證進(jìn)行其分子實(shí)質(zhì)的探索。與前期課題組從血液細(xì)胞進(jìn)行研究的腎陰虛證、腎陽虛證基因芯片結(jié)果[8-9]相比，骨組織基因芯片差異表達(dá)的基因數(shù)目更多，涉及的信號(hào)通路也更多，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證的相關(guān)基因與與補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、Hedgehog、TGF-beta、細(xì)胞周期等多種信號(hào)通路均相關(guān)。

3.1 免疫功能相關(guān)基因

差異基因中參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的基因有：C2、C3、C6、IL7、MAL2、LSP1、VPREB1、CD52、BCL11A等。前面6條基因表達(dá)均呈下調(diào)趨勢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腎陽虛證免疫代謝相關(guān)基因表達(dá)水平下調(diào)，提示骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證患者免疫水平降低，這一點(diǎn)與筆者前期腎陰虛證的發(fā)現(xiàn)是一致的[8]，但參與免疫功能的基因并不相同。已有許多研究表明，免疫力低下是腎陽虛證的表現(xiàn)之一。譚從娥[10]從腎陽虛證患者外周血入手，篩選到腎陽虛證顯著表達(dá)基因70條，其中18條與免疫相關(guān)，認(rèn)為腎陽虛證患者存在免疫功能異常，免疫功能基因的異常表達(dá)是腎陽虛證發(fā)生的分子基礎(chǔ)之一。后譚從娥又以方測證的思路，采用右歸丸治療，建立右歸丸療效相關(guān)的差異表達(dá)基因功能網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)為調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能是右歸丸治療腎陽虛證的重要療效機(jī)理之一[11]。本研究免疫相關(guān)的9條基因中，除6條基因表達(dá)下調(diào)外，另外3條基因表達(dá)上調(diào)，提示腎陽虛患者存在體內(nèi)免疫功能紊亂。

3.2 通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因

與通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的基因有：TMEM90B、SLC5A6、SLCO1C1、SLCO4A1、SLC6A16、SLC11A1、SLC22A15、TM7SF4、KCTD15、P4HTM等。鈉鈣交換蛋白是廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜上的一種離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過將細(xì)胞內(nèi)的Ca2+泵出以及反向轉(zhuǎn)運(yùn)將細(xì)胞外的Ca2+泵入維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)態(tài)，從而滿足細(xì)胞功能活動(dòng)對(duì)Ca2+的需求[12]。鉀離子通道四聚化結(jié)構(gòu)域KCTD15 基因?qū)儆贙CTD 家族成員之一[13]，其基因功能與生物膜和細(xì)胞骨架有關(guān)，且能夠影響細(xì)胞能量代謝過程期。階段敲低 KCTD15 基因能抑制3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞分化[14]，說明它可能影響間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。編碼通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因出現(xiàn)下調(diào)，表明腎陽虛患者離子交換與運(yùn)輸均出現(xiàn)了紊亂，影響了骨代謝。

3.3 骨鈣代謝相關(guān)基因

與骨代謝相關(guān)的基因有：ESRRA、PCDHB5、PCDHB6、PCDHB15、MAST4、BMP4、BMP8A、OGN、POSTN、S100A9、PRG2、MICAL1等。PCDHB5,6,15是原黏粘蛋白beta家族簇成員，這些神經(jīng)類細(xì)胞黏粘蛋白是膜蛋白，其具體功能未知，但是它們有可能在特定的細(xì)胞與細(xì)胞間的神經(jīng)連接的建立上發(fā)揮關(guān)鍵作用。BMP4,8A是BMP家族成員，屬于TGF-beta超家族，與骨的代謝具有十分密切的關(guān)系[15]，在卵巢切除骨質(zhì)疏松癥大鼠模型中，BMP4蛋白水平降低。它們在人類軟骨內(nèi)成骨形成的發(fā)病中起著重要的作用，還參與肌肉發(fā)育、骨礦化等過程。POSTN在許多組織中都存在，作為成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種黏附分子，POSTN 可促進(jìn)成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞在骨膜聚集、分化[16]。此外，它還被認(rèn)為是機(jī)械應(yīng)力相關(guān)基因[17]，腎陽虛證組PCDHB5,6、BMP4以及POSTN表達(dá)水平均降低，影響了成骨細(xì)胞的分化，加速骨的流失。

總之，本研究在骨質(zhì)疏松癥與中醫(yī)證型相結(jié)合的基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證的基因表達(dá)譜。結(jié)果表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證與免疫、骨鈣代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)，與其他疾病的腎陽虛證有相似之處，但也有自己的特點(diǎn)，這可能與筆者取材來自骨組織有關(guān)。腎陽虛證患者多免疫力低下的分子實(shí)質(zhì)可能與免疫功能相關(guān)基因表達(dá)下降相關(guān)；而在其他骨鈣代謝、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)基因方面，也表現(xiàn)出基因表達(dá)的紊亂。本研究只是對(duì)原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證關(guān)聯(lián)基因的初步探討，今后筆者將以“異病同證”為思路，同時(shí)從其他疾病的腎陽虛證入手，進(jìn)一步探討腎陽虛證的分子內(nèi)涵。