何夢(mèng)嬌 江俊 鄭寶玉 許雄程 吳玉銘 林敏魁 陳玉玲 駱凱*

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，福建 福州 350002 2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，浙江 溫州 325027 3.福建省高?？谇会t(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量及骨密度減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的骨代謝疾病，可導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折，嚴(yán)重危害廣大中老年人的健康和生活質(zhì)量[1]。如何實(shí)現(xiàn)OP患者骨組織的再生是學(xué)者們研究的重點(diǎn)。組織工程技術(shù)利用種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞、生長(zhǎng)因子的共同協(xié)同作用以實(shí)現(xiàn)功能性組織再生。但由于支架材料存在潛在的免疫源性、較低的生物活性、不匹配的降解速率以及難以控制的細(xì)胞與材料間的交互作用等缺點(diǎn)使其在臨床上的應(yīng)用受到限制[2]。為此，學(xué)者們提出了細(xì)胞膜片技術(shù)(cell sheet technology，CST)。采用CST無需使用支架材料，可無創(chuàng)性地獲取細(xì)胞，避免了酶消化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的損傷，不僅保留了完整的細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)還保留了重要離子通道和生長(zhǎng)因子受體等，可以促進(jìn)細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的相互作用[3]。近年來，CST已廣泛應(yīng)用于組織與器官重建，包括腎[4]、心肌組織[5]、角膜[6]、牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體[7]、皮膚[8]等。

本研究利用絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)大鼠模型的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)為種子細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜片并研究其生物學(xué)特性，為探討OP狀態(tài)下BMSCs膜片應(yīng)用于組織再生的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

同批次3月齡雌性未孕Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250～290 g，SPF級(jí)，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(閩)2012-0001。

1.2 主要試劑與儀器

低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；0.25%胰蛋白酶、谷氨酰胺(Gibico BRL，美國(guó))；DMSO、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國(guó))；成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(賽業(yè)，廣州)；兔抗大鼠Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ, COL-Ⅰ)、兔抗大鼠纖維連接蛋白(fibronectin, FN)(Abcam，美國(guó))；即用型非生物素免疫組化EliVisionTMplus檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒(邁新，福州)；HEAL FORCE 超凈工作臺(tái)(力申科學(xué)儀器有限公司，上海)；離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國(guó))；熒光倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 SD大鼠PMOP模型的建立及鑒定

參照課題組方法[9]隨機(jī)將SD大鼠分為卵巢切除術(shù)組(ovariectomy，OVX)和假手術(shù)組(sham-operated，Sham)，每組各10只。OVX組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)，Sham組僅切取卵巢附近與卵巢大小相近的脂肪組織。術(shù)后根據(jù)組別分籠常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后6周、術(shù)后12周比較兩組大鼠體型及體重，并取單側(cè)股骨作病理切片比較分析，以確認(rèn)建立SD大鼠骨質(zhì)疏松癥模型。

1.4 O-rBMSCs體外分離培養(yǎng)

采用全骨髓貼壁分離法[10]分離培養(yǎng)O-rBMSCs。全麻下消毒、鋪巾，迅速取出完整股骨及脛骨，無菌條件下以10mLDMEM低糖培養(yǎng)液從兩端交替沖洗骨髓腔收集骨髓沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，DMEM低糖培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L，10%FBS)重懸，置于37 ℃、5 %CO2、飽和濕度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3 d首次半量換液，之后每隔3 d換液 1 次。待細(xì)胞密度至80% ～ 90%融合時(shí)以0.25%胰蛋白酶+0.1 % EDTA消化傳代，實(shí)驗(yàn)選擇3代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行。

1.5 O-rBMSCs成骨及成脂誘導(dǎo)分化

O-rBMSCs按每孔1×105個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，成骨誘導(dǎo)組更換為成骨誘導(dǎo)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入50 μg/mL 維生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油，10 nmol/L地塞米松)，成脂誘導(dǎo)組更換為成脂誘導(dǎo)液，每3 d換液，于誘導(dǎo)21 d后棄原培養(yǎng)液，固定，成骨誘導(dǎo)組行茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)，成脂誘導(dǎo)組行油紅O染色觀察脂滴。

1.6 O-rBMSCs膜片的構(gòu)建

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第2代或第3代O-rBMSCs，按2×105/孔密度接種于六孔板，加入膜片誘導(dǎo)培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入50 μg/mL 維生素C)，2～3 d更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)10 d左右用細(xì)胞刮刀沿培養(yǎng)皿邊緣小心分離獲得細(xì)胞膜片。

1.7 O-rBMSCs膜片形態(tài)學(xué)觀察

選取完整的O-rBMSCs膜片，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，浸蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察膜片結(jié)構(gòu)。部分膜片經(jīng)2.5% 戊二醛固定，梯度酒精脫水，干燥，噴金，掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察標(biāo)本表面形貌及層面結(jié)構(gòu)。部分膜片經(jīng)2.5% 戊二醛固定，1%鋨酸固定，梯度酒精脫水后環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察細(xì)胞膜片超微結(jié)構(gòu)。

1.8 O-rBMSCs膜片免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟，過氧化氫溶液室溫孵育消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，4 ℃下孵育一抗COL-Ⅰ(抗體稀釋度1∶500)、FN(抗體稀釋度1∶800)，室溫下孵育生物素標(biāo)記二抗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素抗生物素蛋白—過氧化酶DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精逐級(jí)脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠PMOP模型建立

術(shù)后6周、術(shù)后12周，OVX大鼠體重明顯大于Sham組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。術(shù)后12周，OVX組大鼠的體型明顯大于Sham組大鼠，行動(dòng)較遲緩，毛色較暗沉。股骨遠(yuǎn)端骨組織HE染色顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠的股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨吸收明顯，骨小梁斷裂且數(shù)目明顯減少，骨小梁變細(xì)從而使得骨髓腔面積變大(圖2)，提示骨質(zhì)疏松造模成功。

圖1 兩組大鼠手術(shù)前后體重比較(** P <0.01)Fig.1 Comparison of body weight before and after ovariectomy in the two groups of rats(**P<0.01)

圖2 卵巢切除術(shù)后12w兩組大鼠股骨組織學(xué)形態(tài)比較(標(biāo)尺 200 μm)A: Sham組B: OVX組Fig.2 Comparison of femur histological morphology after ovariectomy between the two groups of rats (Bars 200 μm)A: Sham group；B: OVX group

2.2 O-rBMSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

PMOP大鼠骨髓沖洗液可見大量的油脂浮于表面，經(jīng)離心后可基本棄去。3 d半量換液后，倒置顯微鏡下仍可見較多的紅細(xì)胞和光亮的圓形細(xì)胞，隱約可見少量貼壁細(xì)胞，呈短梭形或紡錘形，脂滴較多(圖3A)。培養(yǎng)7 d左右，細(xì)胞呈纖維集落樣生長(zhǎng)，形態(tài)多為多角形，邊緣粗糙(圖3B)。培養(yǎng)14 d左右即可達(dá)到80%融合并可傳代。

2.3 O-rBMSCs誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

O-rBMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形、立方形，細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)明顯，局部可見高亮的礦化結(jié)節(jié)點(diǎn)，經(jīng)茜素紅染色后可見紅色結(jié)節(jié)形成(圖3C)。O-rBMSCs 經(jīng)成脂誘導(dǎo)21 d后，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)轭悎A形，類圓形細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量脂滴形成，經(jīng)油紅O染色后，可見紅色脂滴(圖3D)。

圖3 O-rBMSCs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化(標(biāo)尺 100 μm)A：O-rBMSCs原代培養(yǎng)3 d；B：O-rBMSCs原代培養(yǎng)7 d；C：O-rBMSCs茜素紅染色；D：O-rBMSCs油紅O染色Fig.3 The culture and induction of O-rBMSCs in vitro (Bars 100 μm)A: O-rBMSCs primary culture 3 d.B: O-rBMSCs primary culture 7 d.C:O-rBMSCs Alizarin red staining.D: O-rBMSCs Oil red O staining

2.4 O-rBMSCs膜片的形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化染色結(jié)果

連續(xù)培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞膜片即可形成，6孔板底部可見白色膜樣結(jié)構(gòu)，邊緣卷曲(圖4B)。顯微鏡下見細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，于邊緣逐漸向中心收縮。用細(xì)胞刮刀由邊緣向中心刮取即可獲取完整細(xì)胞膜片(圖4A)，刮取后膜片自行收縮，置于PBS中可伸展開，具有較好的彈性及機(jī)械性能。HE染色顯示O-rBMSCs膜片由2～3層細(xì)胞及豐富的細(xì)胞外基質(zhì)組成(圖4C)。掃描電鏡觀察可見膜片中細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)，可見大量的細(xì)胞外基質(zhì)存在于細(xì)胞間(圖4D)。透射電鏡觀察可見細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(圖4E箭頭所示)以及細(xì)胞間連接(圖4F箭頭所示)。免疫組化染色結(jié)果顯示，O-rBMSCs膜片高表達(dá)COL-Ⅰ及FN(圖5)。

圖5 O-rBMSCs膜片免疫組織化學(xué)染色(標(biāo)尺50 μm)A：陰性對(duì)照組；B：COL-Ⅰ蛋白表達(dá)情況；C：FN蛋白表達(dá)情況Fig.5 Immunohistochemical staining of O-rBMSC sheet (Bars 50 μm).A: Negative control group.B: The expression of COL-Ⅰ.C: The expression of FN

圖4 O-rBMSCs膜片形態(tài)學(xué)觀察A：O-rBMSCs膜片外觀觀察；B：O-rBMSCs膜片顯微鏡觀察(標(biāo)尺500 μm) ；C：O-rBMSCs膜片HE染色觀察(標(biāo)尺50 μm) ；D：O-rBMSCs膜片掃描電鏡觀察(箭頭所指為細(xì)胞外基質(zhì)) ；E：O-rBMSCs膜片透射電鏡觀察(箭頭所指為細(xì)胞外基質(zhì))；F：O-rBMSCs膜片透射電鏡觀察(箭頭所指為細(xì)胞間連接)Fig.4 Morphological observation of O-rBMSC sheet.A: Appearance image of O-rBMSC sheet.B: Microscope image ofO-rBMSC sheet (Bars 500 μm).C: HE staining image ofO-rBMSC sheet (Bars 50 μm).D: SEM image ofO-rBMSC sheet (Arrows indicate the ECM).E: TEM image ofO-rBMSC sheet (Arrows indicate the ECM).F: TEM image ofO-rBMSC sheet (Arrows indicate the intercellular junction)

3 討論

隨著社會(huì)人口的老齡化，OP發(fā)病率和患病率顯著升高，不僅影響中老年人的生活質(zhì)量，也給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，是影響中老年人健康的重大公共衛(wèi)生問題之一。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Ⅰ型)、老年性骨質(zhì)疏松癥(Ⅱ型)和特發(fā)性骨質(zhì)疏松(包括青少年型)三種。目前，卵巢切除法構(gòu)建的動(dòng)物模型是OP防治研究的一種重要方法，去卵巢的雌性大鼠模型已成為研究PMOP的經(jīng)典模型之一[11]。本研究采用去勢(shì)法構(gòu)建大鼠PMOP模型，術(shù)后12周，OVX組大鼠體型及體重明顯大于Sham組，股骨遠(yuǎn)端骨組織染色可見骨小梁數(shù)目明顯減少，骨小梁變薄，該結(jié)果提示PMOP模型構(gòu)建成功。

目前，OP治療多采用抗骨吸收藥物(如雙膦酸鹽)和促骨形成藥物(如甲狀旁腺素)以抑制破骨細(xì)胞吸收和促進(jìn)骨形成[12]。然而，已有研究報(bào)道OP患者應(yīng)用此類藥物后由于骨重建功能障礙而引起藥物相關(guān)性頜骨壞死等不良反應(yīng)[13, 14]。一些臨床前研究表明干細(xì)胞療法對(duì)OP有積極的治療意義，BMSCs移植被認(rèn)為是很有潛力的治療方法[15, 16]。BMSCs具有自我更新及多向分化潛能，在維持骨量、骨強(qiáng)度及骨結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮重要作用。BMSCs來源豐富，采集方便，易于體外分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)及擴(kuò)增。作為同源細(xì)胞治療，無免疫原性，便于自體回植，可實(shí)現(xiàn)骨組織的再生，是組織工程研究理想的種子細(xì)胞。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)PMOP大鼠BMSCs經(jīng)瘦素基因修飾后可顯著提高細(xì)胞的體內(nèi)外成骨能力，該結(jié)果為OP狀態(tài)下BMSCs的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[10]。

CST是通過體外連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞使其復(fù)層生長(zhǎng)，形成由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的膜片。構(gòu)建細(xì)胞膜片的方法多種多樣，目前較為常用的有溫度敏感性培養(yǎng)皿法[17]和維生素C連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)法[18]。維生素C是人體健康的必需營(yíng)養(yǎng)素，在膠原和其他胞外基質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。維生素C連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)法簡(jiǎn)單易行，無需特殊材料或方法，獲得的細(xì)胞膜片由多層細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，一定的厚度賦予膜片相應(yīng)的彈性和較穩(wěn)定的機(jī)械性能。Wei等[18]研究表明維生素C可誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)端粒酶活性，上調(diào)胞外基質(zhì)、促進(jìn)干細(xì)胞表面標(biāo)志物和成骨分化標(biāo)志物的表達(dá)，提高PDLSCs增殖和成骨分化能力。在小型豬牙周缺損模型上采用維生素C誘導(dǎo)的PDLSCs膜片可促進(jìn)牙周組織再生。Zhang等[19]以50 μg/mL的維生素C構(gòu)建PDLDCs膜片、下頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(jaw bone marrow-derived mesenchemal stem cells, JBMMSCs)膜片及PDLSCs-JBMMScs復(fù)合細(xì)胞膜片，探討兩種不同來源細(xì)胞膜片的相互作用，研究證明復(fù)合細(xì)胞膜片高表達(dá)成骨及胞外基質(zhì)相關(guān)基因及蛋白，體內(nèi)形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)與天然牙周組織更為相似。上述結(jié)果提示維生素C誘導(dǎo)CST將為組織再生工程提供一個(gè)簡(jiǎn)單可行的方法。

在BMSCs膜片構(gòu)建方面，See等[20]通過連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)成功制備BMSCs膜片，膜片內(nèi)的BMSCs有較好活力且分泌大量胞外基質(zhì)，膜片經(jīng)誘導(dǎo)分化后可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化，提示BMSCs膜片有望用于組織再生治療。Nakamura等[21]以地塞米松和維生素C誘導(dǎo)BMSCs膜片形成，植入大鼠股骨骨折缺損模型，結(jié)果顯示該膜片可促進(jìn)骨折的愈合。其他學(xué)者[22]研究還發(fā)現(xiàn)BMSCs膜片與煅燒牛骨復(fù)合構(gòu)建3D支架結(jié)構(gòu)，移植到骨質(zhì)疏松大鼠顱骨臨界骨缺損(直徑8 mm)后，3D結(jié)構(gòu)中的BMSCs膜片仍具有活力且參與新骨的形成。Wang等[23]將負(fù)載microRNA-21的殼聚糖/透明質(zhì)酸納米顆粒包裹在培養(yǎng)皿上后，以維生素C誘導(dǎo)的方法在此培養(yǎng)皿上可構(gòu)建出BMSCs膜片，一系列檢測(cè)表明miRNA-21可顯著促進(jìn)BMSCs膜片的體外成骨分化能力。但上述研究中所采用的種子細(xì)胞均為健康狀態(tài)，以O(shè)P態(tài)下BMSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞膜片的相關(guān)研究目前還鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用50 μg/mL的維生素C體外連續(xù)培養(yǎng)PMOP大鼠BMSCs 10 d左右，構(gòu)建出完整的O-rBMSCs膜片。該膜片刮取后可自行收縮，置于PBS中可伸展開，具有較好的彈性及機(jī)械性能。HE染色顯示O-rBMSCs膜片由2～3層細(xì)胞及豐富的細(xì)胞外基質(zhì)組成。掃描電鏡觀察可見膜片中細(xì)胞由細(xì)胞外基質(zhì)包埋。透射電鏡觀察可見細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞間連接。

細(xì)胞外基質(zhì)是由多種蛋白和多聚糖構(gòu)成的精細(xì)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其基本成分包括COL-Ⅰ、FN及層黏連蛋白(laminin, LN)等。COL-Ⅰ是細(xì)胞黏附的主要支架，也是新形成組織的主要成分[24]。在膜片中還作為細(xì)胞間相互連接的載體。FN是多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)整合的關(guān)鍵因子，連接細(xì)胞表面受體(如整合素)和多種化合物(如膠原、蛋白多糖及其他粘附分子)。同時(shí)FN在原纖蛋白-1的整合中發(fā)揮重要作用[25]。本研究免疫組織化學(xué)染色顯示，O-rBMSCs膜片高表達(dá)COL-Ⅰ、FN等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，提示O-rBMSCs膜片具有生物學(xué)功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建大鼠PMOP模型、分離培養(yǎng)O-rBMSCs的基礎(chǔ)上，利用維生素C連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d左右成功構(gòu)建了O-rBMSCs膜片，該膜片由多層細(xì)胞和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)組成，具有較好的彈性及機(jī)械性能，說明這是一套較為穩(wěn)定的在體外構(gòu)建O-rBMSCs膜片的方法。同時(shí)，該膜片高表達(dá)COL-Ⅰ、FN等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白。但是，確定O-rBMSCs膜片形成的最適維生素C濃度以及O-rBMSCs膜片的體內(nèi)成骨能力需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以探討。