訾慧 孫麗 蔣寧 林庶茹 鄭洪新

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110847

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加以致易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的增殖抑制、分化程度降低是造成骨質(zhì)疏松的重要原因。現(xiàn)階段OP治療主要以雌激素、鈣劑、活性維生素D、降鈣素和氟化物等為常用藥物，雖然對(duì)OP有一定療效，但存在不良反應(yīng)大及患者不能長(zhǎng)期耐受等缺點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，主骨生髓，髓藏于骨腔內(nèi)，滋養(yǎng)骨骼，骨的生長(zhǎng)發(fā)育依賴(lài)腎氣的滋養(yǎng)與推動(dòng)。中醫(yī)臨床和實(shí)驗(yàn)證明中醫(yī)藥治療原發(fā)性O(shè)P療效顯著，淫羊藿為中醫(yī)臨床治療骨質(zhì)疏松或促進(jìn)骨折愈合常用中藥。

淫羊藿，辛、甘，溫，歸腎、肝經(jīng)。具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，祛風(fēng)除濕功效。淫羊藿苷(ICA)為淫羊藿主要活性成分，現(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道其具有明顯的促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收的活性[1]。筆者前期的研究表明[2]，ICA經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)腸道細(xì)菌分解后會(huì)產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物如淫羊藿次苷I(IcarisideⅠ)，淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ)、淫羊藿素(Icaritin)等，在腎、肝、脾、肌肉等組織中分布濃度較高，并且與其代謝產(chǎn)物共存于組織中。另有報(bào)道ICA在體內(nèi)的生物利用度較低[3]。IcarisideⅠ作為ICA主要體內(nèi)代謝產(chǎn)物，在對(duì)抗骨質(zhì)疏松促進(jìn)OB分化方面的實(shí)驗(yàn)研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對(duì)象，在體外誘導(dǎo)其成骨方向分化過(guò)程中，加入ICA、IcarisideⅠ，比較研究ICA及其主要代謝產(chǎn)物IcarisideⅠ對(duì) rBMSCs成骨性分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco, USA)；甘油磷酸鈉、磷酸化抗壞血酸(ASAP)、地塞米松、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自Sigma公司；類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；MEM-α細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBCO 12571-063)、RNA提取試劑盒(QIAGEN74316)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BIO-RAD170-8890)、堿性磷酸酶ALP測(cè)定試劑盒(AE91640Ra, 批號(hào)：201512)；骨鈣素BGP檢測(cè)試劑盒(AE90937Ra,批號(hào)：201512)；Ⅰ型膠原蛋白ELISA測(cè)定試劑盒(AE90739Ra，201512)；RNAisoReagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、EasyDilution稀釋液均購(gòu)自TaAaRa公司，引物由TaAaRa公司設(shè)計(jì)合成。

藥品：ICA購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110737-200415；IcarisideⅠ購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：121020。純度均大于 98%。

1.1.2儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(THERMO FORMA 3110)、酶標(biāo)儀(BIO-TECK Synergy H1)、凝膠成像儀(BIO-RAD，AIK9585) 預(yù)制膠 (BIO-RAD，Mini-PROTEANTMTGX)。熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P，德國(guó)安捷倫)；蛋白核酸分析儀(DU640，美國(guó)貝克曼)；低溫高速離心機(jī)(MR1822，法國(guó)Jouan SA)

1.2 方法

1.2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及分組

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞rBMSCs(購(gòu)自廣州賽業(yè)有限公司)，采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代。

實(shí)驗(yàn)分組：①空白組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液：DMEM +10 mL/dL胎牛血清(含 100 U/mL青、鏈霉素)；②陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液對(duì)照組：成骨誘導(dǎo)液：DMEM +10 mL/dL胎牛血清(含 100 U/mL青、鏈霉素)+0.1mol/L地塞米松+50 μg/mL維生素C+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。③ICA組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ICA1×10-5mol/L；④IcarisideⅠ組：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ IcarisideⅠ1×10-5mol/L。

1.2.2堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定

于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第6、9、12天測(cè)定ALP活性，具體方法如下：棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各0.3 mL混勻，37 ℃水浴15 min，加入0.9 mL顯色液，顯色后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定507 nm處光密度D(λ)值，空白調(diào)零，檢測(cè)酚標(biāo)準(zhǔn)及樣本的D(λ)值，根據(jù)公式換算為金氏單位。

1.2.3骨鈣素(BGP)含量的測(cè)定

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后每3 d換液1次，每次換液時(shí)留取1 mL舊培養(yǎng)液，于-20 ℃保存，于成骨性誘導(dǎo)培養(yǎng)第6、9、12天，采用ELISA法檢測(cè)BGP的分泌量，以μg/孔表示。

1.2.4RT-RealTime PCR分析

藥物干預(yù)48 h，提取細(xì)胞RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因(ALP、BGP、Osterix和Runx-2) 表達(dá)量。

所用引物均委托TaKaRa(大連)公司根據(jù)GeneBank所發(fā)布的序列設(shè)計(jì)并合成(表1)?？俁NA的提取采用Trizol一步法進(jìn)行, 使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)吸光度。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus試劑盒，以Stratagene Mx3000p熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄體系、PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件均參照說(shuō)明書(shū)設(shè)定。以標(biāo)本中所提取的高濃度RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)等比稀釋后，進(jìn)行PCR反應(yīng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。經(jīng)內(nèi)參校正，求得目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-Real Time PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-Real Time PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)ALP活性的影響

檢測(cè)各組在第6、9、12 天ALP的活性及含量, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在第12天達(dá)到了高峰值。結(jié)果如圖1所示。

圖1 成骨性誘導(dǎo)后不同時(shí)間四組間ALP活性對(duì)比(n=8)注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組比較，▼▼P<0.01；與ICA組比較,△△P<0.01與空白對(duì)照組比較，除ICA組第9天外，各組ALP的活性及含量均顯著高于空白對(duì)照組(**P <0.01)；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液對(duì)照組比較，各組結(jié)果均有顯著差異(▼▼P<0.01)，但I(xiàn)carisideⅠ組第12天ALP活性達(dá)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的近90%，與其最為接近；IcarisideⅠ組和ICA組比較，IcarisideⅠ組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)ALP活性的影響均強(qiáng)于ICA組(△△P<0.01)，并且在第9天即接近達(dá)到作用最高點(diǎn)，達(dá)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的近90%。Fig.1 Comparison of ALP activity in the four groups at different time after osteogenic induction

2.2 對(duì)BGP分泌量的影響

BGP分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。檢測(cè)各組在第6、9、12 天BGP分泌量,在第12天達(dá)到了高峰值。結(jié)果如圖2所示。

圖2 成骨性誘導(dǎo)后不同時(shí)間四組間BGP分泌量對(duì)比(n=8)注：與空白對(duì)照組比較，**P<0.01，與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組比較，▼▼P<0.01；與ICA組比較，△△P<0.01與空白對(duì)照組比較，各組BGP分泌量均顯著高于空白對(duì)照組(**P <0.01)；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液對(duì)照組比較，各組結(jié)果均有顯著差異(▼▼P<0.01)，但I(xiàn)carisideⅠ組第12天BGP分泌量達(dá)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的近86%；IcarisideⅠ組和ICA組比較，IcarisideⅠ組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BGP分泌量均強(qiáng)于ICA組(△△P<0.01)。Fig.2 Comparison of BGP secretion in the four groups at different time after osteogenic induction

2.3 ICA與IcarisideⅠ對(duì)rBMSCs骨向分化過(guò)程中ALP、BGP、Osterix、RUNX2 基因表達(dá)的影響

ALP、BGP、Osterix、Runx2的溶解曲線(xiàn)均只見(jiàn)一特異性峰, 表明引物的特異性好。各基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)均呈“S”型,表明擴(kuò)增效率較高。各組細(xì)胞ALP、BGP、Osterix、RUNX2基因表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 BMSCs 成骨分化過(guò)程中相關(guān)骨形成蛋白和細(xì)胞因子

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs) 是一種多能間充質(zhì)干細(xì)胞，在一定條件下可以向成骨、成脂、成軟骨分化。這個(gè)過(guò)程需要譜系特異性的轉(zhuǎn)錄因子如Runx-2、Osterix等參與。BMSCs 向成骨分化的重要表現(xiàn)是：細(xì)胞能夠合成、分泌表達(dá)成骨特異性的蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)成分，如早期出現(xiàn)的堿性磷酸酶、I型膠原蛋白等及較晚出現(xiàn)的骨鈣素、骨涎蛋白等[4]。

ALP是成骨細(xì)胞分泌的一種特異性的酶，標(biāo)志著成骨細(xì)胞早期的分化程度[5]。BGP是成熟成骨細(xì)胞分泌的一種特異非膠原骨基質(zhì)蛋白，是反映成骨細(xì)胞活性的敏感指標(biāo)，也作為成骨細(xì)胞向新骨生成過(guò)程的特異性指標(biāo)[6]。

Runx-2作為成骨細(xì)胞的特異轉(zhuǎn)錄因子和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，是骨發(fā)育過(guò)程中激活與啟動(dòng) BMSCs向成骨細(xì)胞分化并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子[7]。Runx2通過(guò)結(jié)合成骨細(xì)胞特異性激活元件，直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，包括骨鈣素、骨橋蛋白、I型膠原和ALP 等多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)，在骨形成的多個(gè)階段起調(diào)控作用[8]。Osterix是Runx-2的靶基因，受到Runx-2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Osterix是成骨細(xì)胞OB晚期分化所必需的特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控許多重要的OB晚期表型和功能蛋白的表達(dá)，如骨鈣素、 骨橋素、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等，通過(guò)誘導(dǎo)前體成骨細(xì)胞分化為成熟的功能性成骨細(xì)胞，對(duì)骨細(xì)胞的分化成熟和骨質(zhì)形成有重要影響[9]。

表2 各組細(xì)胞ALP、BGP、Osterix、RUNX2基因表達(dá)結(jié)果(n=5)Table 2 Gene expression of ALP, BGP, Osterix and RUNX2 in each group

注：與空白對(duì)照組比較，◇P<0.01；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組比較，☆P<0.01； IcarisideⅠ組與ICA組比較，■P<0.01。
與空白對(duì)照組相比，ICA組和IcarisideⅠ組及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組ALP、BGP基因表達(dá)均顯著增高◇P<0.01，IcarisideⅠ組表達(dá)高于ICA組；與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組相比，ICA組、IcarisideⅠ組ALP、BGP基因表達(dá)均較低且☆P<0.01，IcarisideⅠ組的表達(dá)為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組的80%以上；IcarisideⅠ組與ICA組相比，IcarisideⅠ組ALP、BGP基因表達(dá)顯著增高，■P<0.01。
與空白對(duì)照組相比，ICA組和IcarisideⅠ組及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組Osterix、Runx-2基因表達(dá)均顯著增高◇P<0.01; 與陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組相比，ICA組、IcarisideⅠ組Osterix、Runx-2基因表達(dá)均較低且☆P<0.01；IcarisideⅠ組與ICA組相比，無(wú)顯著性差異。

3.2 中醫(yī)理論“腎藏精”與干細(xì)胞相關(guān)性

中醫(yī)認(rèn)為“腎藏精生髓主骨”，腎主藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨。腎中的精氣可以濡養(yǎng)和滋潤(rùn)骨髓，骨的生長(zhǎng)發(fā)育又有賴(lài)于骨髓的充養(yǎng)，腎中精氣旺盛則骨就強(qiáng)壯，否則反之。正如《醫(yī)經(jīng)精義·五臟所主》所言：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者腎氣之所合也；髓者腎之所生也，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足者則骨強(qiáng)?！边@些論述表明出生后，甚至成年后“腎精”仍具有生成性，有再生的功能[10]。即“腎精”也擔(dān)負(fù)成年組織修復(fù)的功能。

《靈樞·決氣》，“腎藏精”精的來(lái)由是：“兩神相搏，合而成形，常先身生，是為精”。因此，腎所藏之精可相應(yīng)于胚胎干細(xì)胞及它分化為各種組織器官的成體干細(xì)胞。干細(xì)胞具有先天之精的屬性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，干細(xì)胞是具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，以骨髓組織中含量最為豐富。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力與分化方向代表骨髓的功能，該功能由中醫(yī)“腎”的功能主宰，因此認(rèn)為補(bǔ)“腎”可以增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化功能。干細(xì)胞分化的潛能與中藥治療骨質(zhì)疏松癥、骨折、骨壞死、骨缺損等骨相關(guān)疾病有著理論上的相通性。因此，中醫(yī)采用補(bǔ)腎中藥調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的機(jī)制以“腎藏精生髓主骨”為理論基礎(chǔ)[11]。

3.3 淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物促進(jìn)骨代謝的研究現(xiàn)狀

《本草綱目》：“淫羊藿味甘氣香，性溫不寒，能益精氣，乃手足陽(yáng)明命門(mén)藥也”。中藥淫羊藿具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，益精健骨的功效，是臨床治療OP常用藥，因其顯著的促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收作用一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

ICA是淫羊藿中含量最為豐富的黃酮苷類(lèi)化合物，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明ICA可促進(jìn)rBMSCs的成骨性分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞I型膠原的分泌，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，以及抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性[12,13]；ICA可通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子α1 (Cbfα1)、BMP-2、BMP-4 mRNA和Runx2的表達(dá)而促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成[14]。此外，ICA對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化障礙具有保護(hù)作用，可能與ICA激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)[15]。因而具有開(kāi)發(fā)為抗骨質(zhì)疏松新藥的潛力。

淫羊藿常以口服途徑給藥，主要成分ICA經(jīng)腸道細(xì)菌分解后產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如IcarisideⅠ、IcarisideⅡ、icaritin等，而ICA生物利用度較低[16,17]，其代謝途徑見(jiàn)圖5。翟遠(yuǎn)坤等[18]進(jìn)行IcarisideⅡ?qū)w外培養(yǎng)rBMSCs成骨性分化的影響，發(fā)現(xiàn)IcarisideⅡ促進(jìn)BMSCs成骨性分化的活性高于ICA。IcarisideⅠ也是ICA的體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物之一，在對(duì)抗OP促進(jìn)OB分化方面的實(shí)驗(yàn)研究未見(jiàn)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)研究IcarisideⅠ抗骨質(zhì)疏松活性并與ICA活性進(jìn)行比較。

圖3 淫羊藿苷代謝途徑與產(chǎn)物Fig.3 metabolic pathways and metabolites of icariin

3.4 ICA和IcarisideⅠ對(duì)主要成骨活性標(biāo)志物ALP、BGP蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ICA和IcarisideⅠ均能夠促進(jìn)BMSCs成骨性分化，具體表現(xiàn)在明顯提高ALP活性, 增加BGP分泌量, 且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。與正常對(duì)照組比較，除ICA組第9天外，各組ALP的活性及含量均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)；IcarisideⅠ組和ICA組比較，IcarisideⅠ組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ALP活性及BGP分泌量均強(qiáng)于ICA組(P<0.01)。

3.5 ICA和IcarisideⅠ對(duì)ALP、BGP、Osterix和Runx-2基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ICA和IcarisideⅠ均可強(qiáng)烈促進(jìn)成骨性分化因子ALP、BGP，上調(diào)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞Runx-2，并可進(jìn)一步調(diào)節(jié)其下游基因Osterix的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)OB增殖、分化。與空白對(duì)照組比較，ICA和IcarisideⅠ組及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組ALP、BGP、Osterix、Runx-2基因表達(dá)均顯著增高P<0.01，但低于陽(yáng)性轉(zhuǎn)化液組且P<0.01；IcarisideⅠ組ALP、BGP基因表達(dá)顯著高于ICA組且P<0.01。ICA組、IcarisideⅠ組Osterix、Runx-2基因表達(dá)相比，無(wú)顯著性差異。

結(jié)果表明，ICA作為淫羊藿的主要有效成分，經(jīng)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后，其代謝物IcarisideⅠ也具有抗OP活性，并且其作用強(qiáng)于原型藥物ICA。根據(jù)中醫(yī)理論，腎中精氣充盛，對(duì)骨形成有較好的促進(jìn)作用，其作用機(jī)制與其能夠促進(jìn)ALP、BGP、Osterix、Runx-2基因及蛋白表達(dá)有關(guān)。提示ICA可通過(guò)口服途徑給藥，進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松藥效學(xué)評(píng)價(jià)。IcarisideⅠ與ICA比較，主要差別在于脫去3位鼠李糖，這可能是活性增強(qiáng)的主要原因，但具體機(jī)理還需做進(jìn)一步的研究。