李 林，劉拂曉，樊曉旭，李金明，鄒艷麗，劉 珊，包靜月，吳曉東，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟病毒實時熒光RPA快速檢測方法的建立

李 林，劉拂曉，樊曉旭，李金明，鄒艷麗，劉 珊，包靜月，吳曉東，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟是一種跨境動物疫病，對世界養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重。目前，該病的流行范圍越來越廣。為防止該病傳入我國，當前急需建立快速、簡便、可靠的檢測方法。本研究通過分析非洲豬瘟病毒B646L基因保守區(qū)域，設計并合成了特異性引物和exo探針，建立了檢測非洲豬瘟病毒的實時熒光RPA方法。利用該方法可在20 min內(nèi)完成檢測過程，最低可檢測到16拷貝/反應；與豬的其他常見病原核酸無交叉反應；與熒光PCR方法具有相似的靈敏度和特異性；利用該方法對100份國內(nèi)臨床樣品進行檢測，結(jié)果均為陰性。本研究所建立的非洲豬瘟病毒實時熒光RPA檢測方法具有簡單、快速、敏感性高、特異性強的優(yōu)點，在臨床鑒別診斷、檢驗檢疫和病原監(jiān)測等方面具有廣泛的應用價值。

非洲豬瘟；非洲豬瘟病毒；實時熒光RPA；實時熒光PCR

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，能感染所有品種和年齡的豬，引起一系列綜合癥狀，臨床上以高熱、食欲廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血、高死亡率為特征。該病屬于世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的法定報告動物疫病，在我國被列為一類動物疫病。ASF的病原為非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）。該病毒為雙鏈DNA，是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）的唯一成員[1]。ASF主要在非洲和歐洲東部流行，已經(jīng)在非洲以外的意大利撒丁島、西班牙、葡萄牙、加勒比地區(qū)、巴西以及東歐等國家或地區(qū)發(fā)現(xiàn)[2]。自2007年該病傳入俄羅斯以來，不斷蔓延，已經(jīng)傳至俄羅斯的46個地區(qū)[3]。2017年3月，在距離我國較近的俄羅斯遠東地區(qū)伊爾庫茨克州發(fā)生ASF疫情，使得該病傳入我國的風險驟然增加，因此我國急需提高對該病的檢測和防控能力。

ASF與豬瘟（CSF）無法通過臨床癥狀和病理變化進行鑒別，而且這兩種病應與豬的其他急性出血性疫病進行鑒別診斷。由于ASF沒有疫苗，當前ASF的實驗室診斷方法以檢測特異性抗體為主，其他方法如病毒分離、直接免疫熒光法以及檢測病毒核酸的方法（如常規(guī)PCR和熒光PCR）等也相繼建立并廣泛應用[4]。但上述檢測方法大多需要昂貴的儀器設備、繁瑣的試驗程序以及較長的檢測時間，難以滿足現(xiàn)場或臨床檢測需要[5]。

近年來，一些核酸等溫擴增技術逐漸發(fā)展起來，這些技術不需要昂貴的PCR儀，可在短時間內(nèi)大量擴增出目的片段，具有簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點。其中的重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase polymerase amplif i cation，RPA）更是被稱為可替代PCR的核酸檢測技術[6]。RPA技術是模擬了生物體內(nèi)DNA復制，基于重組酶和聚合酶介導的擴增原理發(fā)展而來。該技術主要依賴于結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶三種酶。這3種酶的混合物在常溫下即具有活性，最佳反應溫度在37～42 ℃。它可以在非常短的時間內(nèi)（20 min）使目的基因以指數(shù)級增長，配合熒光標記的探針和熒光信號檢測儀還可實現(xiàn)對擴增的實時監(jiān)控。應用該技術已經(jīng)建立起對多種病原微生物（如口蹄疫病毒、寨卡病毒和裂谷熱病毒等）的快速檢測技術[7-9]。本研究建立和初步評估了一種用于快速檢測ASFV的實時熒光RPA方法。

1 材料與方法

1.1病毒核酸和臨床樣品

含有ASFV E70株B646L基因（p72）的質(zhì)粒pMD 18-p72由本實驗室構建并保存。ASF陽性組織樣品均從歐盟非洲豬瘟參考實驗室（CISA-INIA，西班牙）引進?？谔阋卟《竞怂帷⒇i繁殖與呼吸障礙綜合征病毒核酸、豬瘟病毒核酸和豬圓環(huán)病毒核酸，以及健康豬全血和淋巴結(jié)樣品均為本實驗室保存。實時熒光RPA引物與exo探針、熒光PCR引物和TaqMan探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成，其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2實時熒光RPA引物和exo探針的設計

根據(jù)TwistDx公司RPA指導手冊中的引物和exo探針設計原則，比對GenBank中ASFV的B646L基因（p72）序列中保守部分，設計出的引物和探針序列為：

RPAf：5′-GCTTTCAGGATAGAGATACAGCT CTTCCAGACGC-3′；

RPAr：5′-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGA GCTGCAGAAC-3′；

exo探針RPAp的序列為：5′-ATTATTAAAAAC ATTTCCGTAACTGCTCATGG （FAM-dt）（THF）（BHQ1-dt）AATCTTATCG-C3Spacer-3′。

1.3實時熒光RPA

使用TwistAmp exo試劑盒（TwistDx，Cambridge，UK）在50 μL反應體系進行RPA試驗。Twista等溫實時熒光擴增儀器和軟件（Twista Studio，2.06版）為英國TwistDx公司產(chǎn)品。首先在1.5 mL離心管中加入再水化緩沖液29.5 μL，引物RPAf和RPAr（均為10 μM）各2.1 μL，exo探針RPAp（10 μM）0.6 μL，DNA模板3 μL和滅菌水10.2 μL，混勻后，將前述混合液加入到含有凍干酶球的RPA反應管中，混勻，最后加入280 mM的醋酸鎂溶液2.5 μL，混勻后立即將反應管置于RPA擴增檢測儀中，39 ℃反應20 min，實時收集FAM熒光信號。對于模板濃度較低的反應（1.5×103～1.5×101拷貝/反應）在第230秒時取出混勻1次。結(jié)果判定采用軟件中的閾值時間（Threshold time）方法。

1.4熒光PCR

熒光PCR參照OIE診斷手冊中推薦的方法[10]，檢測的目的基因同樣為B646L。使用TaKaRa公司的Premix ExTaq（Probe qPCR）試劑盒在LightCycler 480熒光PCR儀（Roche，Germany）上進行，反應體系為25 μL，模板加3 μL，反應程序為95 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

1.5敏感性分析

對引物和探針序列在GenBank中Blast，分析本方法中所用引物和探針序列與不同基因型的ASFV序列的差異。人工合成與本文中的RPA引物和exo探針序列有差異基因片段（GenBank登錄號分別為：AF270708、AF270709、AF270710、AF449475、AF449476、AY274452、AY494552、DQ250112），使用建立的實時熒光RPA方法分別檢測。

以質(zhì)粒pMD18-p72 為標準品，測量濃度后，根據(jù)分子量大小計算拷貝數(shù)濃度，連續(xù)10倍倍比稀釋。對不同濃度的DNA標準品（1.5×107～1.5×101拷貝/反應）分別使用實時熒光RPA和熒光PCR檢測。使用Prism統(tǒng)計軟件（Graphpad Software Inc，USA）對實時熒光RPA和熒光PCR能檢測到的模板數(shù)與閾值時間或Ct值分別進行半對數(shù)回歸分析。另外，使用實時熒光RPA方法對不同濃度的標準品重復檢測10次，使用統(tǒng)計軟件對能檢測到的模板數(shù)進行概率回歸分析。

1.6特異性分析

使用High Pure viral nucleic acid kit（Roche公司）提取臨床上豬常見的幾種疫病的病原核酸，如口蹄疫、豬瘟、豬繁殖與障礙呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒病等。同時設立ASF陽性樣品對照，采用相同的方法處理樣品。實時熒光RPA方法檢測提取的病毒核酸。

1.7臨床樣品檢測

采用High Pure PCR template preparation kit（Roche公司）提取4份ASFV陽性組織樣品和100份國內(nèi)送檢的健康豬全血中的DNA，使用熒光PCR方法與本文建立的實時熒光RPA方法檢測，比較兩種方法的結(jié)果差異。

2 結(jié)果

2.1引物和探針的設計

查找GenBank中ASFV的B646L基因序列，使用MEGA軟件序列比對后查找保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域的共同序列為模板設計了引物和exo探針，擴增片段的長度為181 bp。參照Georgia 2007株ASFV的B646L基因序列（GenBank登錄號AM999764.1），最終使用的RPA引物RPAf、RPAr和探針RPAp的對應位置分別為29～62、177～209和115～160。

2.2實時熒光RPA的敏感性分析

實時熒光RPA方法對不同濃度的模板（1.5×107～1.5×101拷貝/反應）進行檢測，檢測下限最低可至1.5×101拷貝/反應（圖1-A）。分別對幾種不同的B646L基因片段（GenBank登錄號為：AF270708，AF270709、AF270710、AF449475、AF449476、AY274452、AY494552、DQ250112）檢測，結(jié)果均能出現(xiàn)擴增曲線（圖1-B）。使用所建立的實時熒光RPA對4份陽性ASF組織樣品的檢測結(jié)果均為陽性，與熒光PCR結(jié)果一致。

圖1實時熒光RPA擴增曲線

以標準品為模板，實時熒光RPA和熒光PCR對每個濃度梯度的模板分別重復檢測10次，熒光PCR的檢測下限為15個拷貝。而經(jīng)概率回歸分析，實時熒光RPA方法檢測下限（95%的概率）為16.9個拷貝（圖2）。在標準品為1.5×107～1.5×102拷貝/反應時，實時熒光RPA的閾值時間與模板拷貝數(shù)的對數(shù)具有良好的線性相關性（R2=0.7618），但閾值時間的變化范圍較大（圖3-A）。而熒光PCR在1.5×107～1.5×101拷貝/反應時，Ct值的與模板拷貝數(shù)的對數(shù)線性相關性較好（R2=0.997 1），Ct值變異較?。▓D3-B）。

圖2實時熒光RPA檢測下限的概率回歸分析

圖3對不同濃度的標準品檢測結(jié)果

在標準品模板數(shù)為1.5×107～1.5×102拷貝/反應時，實時熒光RPA的閾值時間和熒光PCR的Ct值具有良好的線性回歸關系（R2= 0.961 5）（圖4）。

圖4實時熒光RPA與熒光PCR的相關性分析

2.3實時熒光RPA的特異性

以其它豬常見的病原核酸，如口蹄疫病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬瘟病毒和圓環(huán)病毒等，以及健康豬淋巴結(jié)總核酸為模板，進行實時熒光RPA檢測后均沒有出現(xiàn)擴增曲線，而使用實時熒光RPA對ASF陽性對照樣品檢測均出現(xiàn)擴增曲線。對國內(nèi)送檢的100份樣品進行檢測，實時熒光RPA檢測結(jié)果均為ASFV陰性，與熒光PCR檢測結(jié)果一致。

3 討論

2017年3月，俄羅斯遠東地區(qū)伊爾庫茨克（Irkutsk）發(fā)生ASF疫情，這是2007年以來該病在俄羅斯首次向東長距離跨越式傳播。由于疫情發(fā)生地距離我國較近，傳入我國的風險大大增加。為此，農(nóng)業(yè)部下發(fā)了《關于進一步加強非洲豬瘟風險防范工作的緊急通知》（農(nóng)辦醫(yī)〔2017〕14號），要求各地警惕疫情風險，做好防范工作。鑒于非洲豬瘟具有危害十分嚴重且無特征性臨床癥狀的特點，建立適用于各級實驗室和臨床應用的簡便快速鑒別診斷技術對于該病的防控尤為重要。

RPA技術是近年來出現(xiàn)的等溫擴增技術，具有操作簡便、試劑易保存和攜帶、反應快速等優(yōu)點，非常適于臨床檢測。目前，一些實驗室已經(jīng)建立了基于RPA的病原學檢測方法。與其他等溫擴增方法或PCR相比，RPA具有反應快、操作簡便、無需復雜的實驗室設備即可實現(xiàn)快速檢測等優(yōu)點。本方法反應所需要的酶，經(jīng)過凍干，能在常溫下長時間保存，檢測時只需加入提前配制好的緩沖液（包含水解緩沖液、引物和探針等），再加入簡單純化的病原核酸和醋酸鎂即可開始反應，只需20 min即可完成檢測。

本研究建立的實時熒光RPA方法具有非常高的敏感性和特異性。經(jīng)概率回歸分析，該方法的檢測下限最低可達到16.9個拷貝數(shù)（95%可能性），與熒光PCR的檢測下限相似。本研究所建立的實時熒光RPA方法比王建昌等[11]建立的RPA檢測ASFV方法檢測下限提高了10倍，且不需要電泳，節(jié)約時間。本研究建立的RPA方法比熒光PCR檢測下限提高，原因可能是由于使用不同的擴增試劑盒而引起的。對臨床陰性樣品檢測的結(jié)果顯示，實時熒光RPA與熒光PCR具有相似的特異性。由于在實時熒光RPA反應中加入了exo探針，相比普通RPA增加了反應的特異性。與熒光PCR方法不同的是，RPA反應體系中添加了核酸外切酶III，對擴增產(chǎn)物進行切割，擴增產(chǎn)物在反應結(jié)束后即降解，進一步降低了擴增產(chǎn)物污染所帶來的假陽性風險。

實時熒光RPA方法的閾值時間與熒光PCR的Ct值相比變異性較大，原因可能有如下幾點：一是由于RPA反應非?？欤谑覝叵录纯砷_始反應，熒光RPA的閾值時間受手工操作熟練程度的影響較大，對閾值時間的大小產(chǎn)生影響，但不會改變結(jié)果的性質(zhì)（陰性或陽性）。二是由于RPA是在等溫條件下進行反應，若反應體系沒有充分混勻?qū)⒂绊懛磻Y(jié)果，尤其是在模板數(shù)較少的情況下。隨著模板數(shù)的降低，閾值時間的變異也越來越大。而熒光PCR在變溫條件下（變性、退火和延伸）進行反應，反應液在每個循環(huán)都可以得到充分混勻，Ct值的標準差也較小。因此，通常在RPA反應開始3～4 min后將反應管拿出混勻，可提高檢出率并縮短檢測時間，這在模板數(shù)較少的情況下影響尤為顯著。另外，國外有報道，將反應體積縮小至5 μL后也可以提高敏感性，同時還能節(jié)約成本[12]。

本研究所建立的ASFV實時熒光RPA快速檢測方法，結(jié)合快速核酸純化技術和便攜式的儀器設備，具有操作簡單、敏感性高、特異性強和快速等優(yōu)點，非常適合于臨床現(xiàn)場和基層檢測應用，對于我國ASF防控具有重大意義。

[1] DIXON L K，ESCRIBANO J M，MARTINS C，et al. Asfarviridae[C] // FAUQUET C M，MAYO M A，MANILOFF J，et al. Virus taxonomy VIII report of the international committee on taxonomly of viruses. London：Elsevier Academic Press，2005：135-143.

[2] OLSEVSKIS E，GUBERTI V，SERZANTS M，et al. African swine fever virus introduction into the EU in 2014：Experience of Latvia[J]. Res Vet Sci，2016，105：28-30.

[3] SANCHEZ-VIZCAINO J M，MUR L，GOMEZVILLAMANDOS J C，et al. An update on the epidemiology and pathology of African swine fever[J]. J Comp Pathol，2015，152（1）：9-21.

[4] SANCHEZ-VIZCAINO J M，MUR L. African swine fever diagnosis update[J]. Dev Biol（Basel），2013，135：159-165.

[5] OURA C A，EDWARDS L，BATTEN C A. Virological diagnosis of African swine fever--comparative study of available tests[J]. Virus Res，2013，173（1）：150-158.

[6] PIEPENBURG O，WILLIAMS C H，STEMPLE D L，et al. DNA detection using recombination proteins[J]. PLoS Biol，2006，4（7）：e204.

[7] CHAN K，WEAVER S C，WONG P Y，et al. Rapid，affordable and portable medium-throughput molecular device for zika virus[J]. Sci Rep，2016，6：38223.

[8] EULER M，WANG Y，NENTWICH O，et al. Recombinase polymerase amplif i cation assay for rapid detection of Rift Valley fever virus[J]. J Clin Virol，2012，54（4）：308-312.

[9] ABD EL WAHED A，EL-DEEB A，EL-THOLOTH M，et al. A portable reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus[J]. PLoS One，2013，8（8）：e71642.

[10] KING D P，REID S M，HUTCHINGS G H，et al. Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus[J]. J Virol Methods，2003，107（1）：53-61.

[11] 王建昌，王金鳳，劉立兵，等.非洲豬瘟病毒RPA等溫檢測方法的建立[J]. 中國動物檢疫，2016，33（7）：78-81.

[12] LILLIS L，SIVERSON J，LEE A，et al. Factors influencing Recombinase polymerase amplification （RPA）assay outcomes at point of care[J]. Mol Cell Probes，2016，30（2）：74-78.

（責任編輯：朱迪國）

Establishment of a Real-time Recombinase Polymerase Amplif i cation Assay for Rapid Detection of African Swine Fever Virus

Li Lin，Liu Fuxiao，F(xiàn)an Xiaoxu，Li Jinming，Zou Yanli，Liu Shan，Bao Jingyue，Wu Xiaodong，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

African swine fever（ASF）is a transboundary swine disease，causing huge economic losses for swine industry in the world. At present，the prevalence of the disease has been spreading widely. In order to prevent the disease from being introduced into China，it is urgent to establish a fast，simple and reliable method. In this study，the specif i c primers and exo probes were designed and synthesized by analyzing the conserved region of B646L gene of African swine fever virus（ASFV）. A real-time fl uorescence RPA method for detection of ASFV was established. The minimal detection limit of the novel real-time RPA assay was 16 copies per reaction，and the detection could be fi nished in 20 minutes. Cross reactivity with other swine associated viruses was not observed. The sensitivity and specif i city of the assay was comparable to that of the real-time PCR. 100 domestic samples were detected by this method，and the results were negative. The real-time RPA assay developed in this study was of great signif i cance of simple，fast，high sensitivity and strong specif i city，with wide application value in clinical differential diagnosis，laboratory quarantine and pathogen surveillance.

African swine fever；African swine fever virus；real-time RPA；real-time PCR

S851.3

A

1005-944X（2017）08-0087-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.023

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1200500）；農(nóng)業(yè)部動物疫情監(jiān)測與防治項目

王志亮