史 茜，陳瑞花，王科珂，徐新峰，盧曾軍，季新成

（1. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆烏魯木齊 830063；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046）

四種口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA試劑盒檢測豬血清樣本的質(zhì)量評(píng)估

史 茜1，陳瑞花1，王科珂1，徐新峰1，盧曾軍2，季新成1

（1. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆烏魯木齊 830063；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046）

[目的] 對(duì)4種口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。[方法] 用4種商品化的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體ELISA檢測試劑盒，對(duì)非免疫健康、免疫健康、免疫感染和非免疫人工感染4種類型豬血清樣本進(jìn)行檢測，分析試劑盒的診斷敏感性、診斷特異性、分析敏感性、分析特異性及重復(fù)性。[結(jié)果] 4種試劑盒的診斷敏感性在76.8%～94.4%之間，診斷特異性在97.7%～100%之間，分析敏感性和分析特異性較好。4種檢測試劑盒與4種豬常感染疾病的陽性血清不發(fā)生反應(yīng)。試劑盒的批間重復(fù)性為（10.545±6.845）%～（37.577±28.626）%；批內(nèi)重復(fù)性為（9.037±6.075）%～ （37.601±27.027）%。[結(jié)論] 在實(shí)際應(yīng)用中，需根據(jù)檢測目的不同，選取相應(yīng)的試劑盒。

口蹄疫；非結(jié)構(gòu)蛋白抗體；ELISA試劑盒；質(zhì)量評(píng)估

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的急性熱性高度接觸性傳染病，一旦發(fā)病將嚴(yán)重影響疫情國家和地區(qū)的畜牧業(yè)發(fā)展和對(duì)外貿(mào)易，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是世界各國高度關(guān)注的重大動(dòng)物疫病，也是我國的一類動(dòng)物疫病[1]。注射疫苗是防控該病的主要方法。如何區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物在 FMD 防治中具有重要意義。

FMDV蛋白質(zhì)根據(jù)是否存在于病毒顆粒中分為結(jié)構(gòu)蛋白（Structural protein，SP）和非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structural protein，NSP）?，F(xiàn)代疫苗在加工過程中會(huì)去除非結(jié)構(gòu)蛋白，因此以口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白為抗原，檢測動(dòng)物體內(nèi)的NSP抗體是一種很好的區(qū)分感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的診斷方法。目前市售的NSP抗體檢測試劑盒種類繁多，質(zhì)量良莠不齊，對(duì)試劑盒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究報(bào)道也較少。本試驗(yàn)選取了4種常用的商品化口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測試劑盒，分別對(duì)非免疫無FMD、免疫健康、免疫感染和人工感染4類豬血清進(jìn)行檢測，用以評(píng)估試劑盒的靈敏度、特異性、重復(fù)性等質(zhì)量參數(shù)，為試劑盒的選用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清。非免疫無口蹄疫豬血清88份，采自加拿大；免疫健康豬血清88份，為田間背景下利用豬口蹄疫O型滅活疫苗（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)）免疫60 d后采血獲得，采自新疆某豬場；豬水泡病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎、豬呼吸道冠狀病毒病和偽狂犬病毒抗體陽性血清，由新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心中亞地區(qū)動(dòng)物疫病檢測國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。人工免疫健康豬血清88份，為試驗(yàn)背景下注射1次疫苗后21 d和28 d采血獲得；田間采集的免疫后疑似感染豬血清96份；人工感染豬血清108份，攻毒試驗(yàn)后10 d采集，均表現(xiàn)出FMD癥狀。以上樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2試劑盒。4種商品化的豬口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA檢測試劑盒。A試劑盒：阻斷ELISA，適用于牛、羊、豬血清的檢測，國外進(jìn)口，批號(hào)為F130601L、F130901L、F131201L；B試劑盒：間接ELISA，適用于豬血清的檢測，國內(nèi)生產(chǎn)，批號(hào)為2014052206F、2014111906F、2013100906F；C試劑盒：阻斷ELISA，適用于豬血清的檢測，國內(nèi)生產(chǎn)，批號(hào)為20140607e、20141021e、20140910e；D試劑盒：間接ELISA，適用于豬血清的檢測，國外進(jìn)口，批號(hào)為20141126、20151114。

1.1.3主要儀器耗材。Spectra max plux 384酶標(biāo)儀、Eppendorf各型號(hào)微量加樣器。

1.2方法

分別對(duì)試劑盒的診斷敏感性、診斷特異性、分析敏感性、分析特異性及重復(fù)性等技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行檢測，試驗(yàn)操作及結(jié)果判定均按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.1診斷敏感性及診斷特異性試驗(yàn)。利用上述4種檢測試劑盒，分別對(duì)88份非免疫無FMD豬血清樣品（真陰性血清）和108份人工感染豬血清（真陽性血清）進(jìn)行檢測，按照說明書判定結(jié)果，按以下公式計(jì)算診斷敏感性和診斷特異性[2]：診斷敏感性=陽性樣品檢出數(shù)/已知陽性樣品總數(shù)；診斷特異性=陰性樣品檢出數(shù)/已知陰性樣品總數(shù)。

1.2.2分析敏感性試驗(yàn)。利用4種試劑盒，對(duì)108份人工感染豬血清進(jìn)行檢測；選取4種試劑盒檢測均為陽性的6份血清，從1:2開始，進(jìn)行10個(gè)梯度倍比稀釋（即1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1 024），用4種檢測試劑盒，分別對(duì)上述6份不同稀釋度的樣品進(jìn)行檢測，每份樣品設(shè)復(fù)孔，以檢出陽性結(jié)果的最高稀釋倍數(shù)作為分析敏感性的檢測結(jié)果。

1.2.3分析特異性試驗(yàn)。用4種檢測試劑盒，分別檢測豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎、豬呼吸道冠狀病毒病和偽狂犬病毒病的抗體陽性血清樣品，每個(gè)樣品設(shè)復(fù)孔，判斷試劑盒檢測樣品時(shí)的分析特異性。

1.2.4重復(fù)性試驗(yàn)。每種試劑盒抽取3個(gè)批次，每個(gè)批次抽取3個(gè)試劑盒，分別對(duì)6份樣品進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，由2個(gè)以上操作人員在不同的時(shí)間對(duì)相同樣品進(jìn)行重復(fù)檢測。變異系數(shù)計(jì)算公式為CV=100%×（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值），試劑盒的變異系數(shù)為6份樣品變異系數(shù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.5對(duì)免疫血清樣品的檢測。對(duì)免疫3次以上的健康豬血清、免疫健康豬血清和人工免疫21～28 d后采集的豬血清各88份進(jìn)行檢測。同時(shí)對(duì)96份田間免疫后疑似感染的豬血清進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1診斷敏感性和診斷特異性

用4種試劑盒，分別對(duì)已知陰性和陽性豬血清樣品的檢測結(jié)果為：4種試劑盒的診斷特異性均較高，在97.7%～100%之間；診斷敏感性在76.8%～94.4%之間；試劑盒D的診斷敏感性最高，試劑盒A、B和C的診斷特異性最高（表1）。

表1 4種試劑盒對(duì)已知陽性（診斷敏感性）和陰性（診斷特異性）血清樣品的檢測結(jié)果

2.2分析敏感性

對(duì)6個(gè)陽性血清倍比稀釋樣品的檢測結(jié)果為：對(duì)1號(hào)樣品檢出的最高血清稀釋度為1/8，2號(hào)與3號(hào)樣品檢出的最高稀釋度為1/64，4～6號(hào)樣品檢出的最高稀釋度稀釋度大于1/1 024。試劑盒D對(duì)于6個(gè)樣品的血清稀釋度最低為1/8，最高大于1/1 024。試劑盒D具有較高的分析敏感性，試劑盒A次之（表2）。

表2 4種診斷試劑盒分析敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3分析特異性

用4種檢測試劑盒，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胃腸炎、豬呼吸道冠狀病毒病和偽狂犬病毒病抗體陽性血清進(jìn)行檢測，均未檢測出陽性。

2.4重復(fù)性

變異系數(shù)計(jì)算結(jié)果為：A和B試劑盒的批次內(nèi)變異系數(shù)均小于10%，同時(shí)A和B 兩種試劑盒的批間重復(fù)性小于15%，具有較高的批內(nèi)和批間重復(fù)性；試劑盒D的批內(nèi)重復(fù)性小于15%，批間重復(fù)性小于20%，C試劑盒批內(nèi)、批間重復(fù)性均大于30%（表3）。

表3 4種診斷試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5對(duì)免疫豬血清樣品的檢測

利用4種試劑盒，分別對(duì)88份免疫3次以上健康豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果除試劑盒D檢出2份陽性樣品外，其余試劑盒檢測結(jié)果均為陰性；對(duì)88份隨機(jī)采集的免疫健康豬血清的檢測結(jié)果顯示，試劑盒D檢出4份陽性樣品，試劑盒B檢出1份陽性樣品，試劑盒A與C未檢出陽性樣品；對(duì)試驗(yàn)背景下注射1次疫苗后21 d或28 d的豬血清檢測結(jié)果為，試劑盒D檢出3份陽性樣品，其余試劑盒均未檢出陽性樣品。以上結(jié)果顯示，4個(gè)試劑盒對(duì)免疫豬血清檢測的特異性在96.6%～100%之間（表4）。

表4 4種診斷試劑盒對(duì)免疫后健康豬血清樣品的檢測結(jié)果

用4種試劑盒，對(duì)96份免疫后感染FMD的豬血清檢測的結(jié)果為：試劑盒D檢出陽性樣品數(shù)85份，診斷敏感性為88.5%；試劑盒A檢出陽性樣品數(shù)為59份，診斷敏感性為61.5%；試劑盒B和C的診斷敏感性分別為53.1%和56.3%（表5）。

表5 4種診斷試劑盒對(duì)免疫后感染豬血清樣品檢測結(jié)果

3 討論

20世紀(jì)90年代以來，研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)3ABC、3B的血清抗體水平可以作為區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物的指標(biāo)[3-4]。這是因?yàn)樵诂F(xiàn)代疫苗加工過程中，2C、3A、3B和3C等非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)被去除，因此免疫動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)NSP的抗體，只會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。而當(dāng)動(dòng)物感染FMDV并出現(xiàn)病毒復(fù)制后，無論表現(xiàn)為臨床或亞臨床癥狀，動(dòng)物都會(huì)出現(xiàn)2種抗體：一種是針對(duì)衣殼蛋白的抗體；另一種是針對(duì)NSP的抗體。后者可以用來區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物。1997年在荷蘭召開的有關(guān)學(xué)術(shù)研討會(huì)上，與會(huì)學(xué)者確認(rèn)以生物工程技術(shù)制備的3ABC作為抗原的ELISA方法是區(qū)分FMDV自然感染和疫苗免疫動(dòng)物的理想方法[5]。國內(nèi)外相繼研制了很多檢測NSP抗體的ELISA試劑盒，來區(qū)分檢測免疫動(dòng)物與感染動(dòng)物，從而達(dá)到對(duì)疫病的診斷與防控的目的。目前我國缺乏對(duì)商品化試劑盒敏感性、特異性、重復(fù)性等指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)估。然而試劑盒的低敏感性會(huì)造成假陰性的試驗(yàn)結(jié)果，使得感染動(dòng)物未被檢出，增加了該病的傳播風(fēng)險(xiǎn)；低特異性又會(huì)造成誤殺，因此增加了經(jīng)濟(jì)損失；重復(fù)性較差會(huì)造成檢測結(jié)果不穩(wěn)定。因此，對(duì)試劑盒的質(zhì)量評(píng)估工作意義重大。

本試驗(yàn)通過對(duì)未免疫血清和免疫血清檢測結(jié)果的比較可知，4個(gè)試劑盒對(duì)未免疫血清和免疫血清的診斷特異性分別在97.7%～100%和96.6%～100%之間，試劑盒D略低。4個(gè)試劑盒對(duì)上述兩類血清的診斷敏感性檢測結(jié)果差異較大，對(duì)未免疫血清的診斷敏感性在76.8%～94.4%之間，對(duì)免疫血清的診斷敏感性在53.1%～88.5%之間，未免疫血清的診斷敏感性高于免疫血清。Brocchi等[6]通過NCPanaftosa、IZS-Brescia、Ceditest、Svanova、Switzerland和UBI 6種試劑盒，對(duì)牛、羊、豬血清樣品共3 551份進(jìn)行檢測，血清分為免疫動(dòng)物、感染動(dòng)物、自然發(fā)病動(dòng)物和免疫后感染動(dòng)物和非免疫感染動(dòng)物。結(jié)果表明，6種試劑盒對(duì)未免疫感染動(dòng)物的敏感性均達(dá)100%，對(duì)免疫后感染動(dòng)物，NCPanaftosa、IZS-Brescia、Ceditest 3個(gè)試劑盒檢測敏感性均在90%以上，特異性在99%以上。本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果與Brocchi的結(jié)論總體一致，未免疫樣品的診斷特異性和診斷敏感性也高于免疫血清。造成差異的原因可能是因?yàn)橐呙缑庖吆笙拗屏瞬《镜膹?fù)制，免疫動(dòng)物NSP抗體的產(chǎn)生較未免疫動(dòng)物慢，且抗體滴度較低[7]。診斷特異性低的原因可能是在疫苗加工處理過程中，NSP去除不完全，經(jīng)免疫后也產(chǎn)生NSP抗體。試驗(yàn)結(jié)果也說明ELISA試劑盒用于檢測未免疫樣品檢測的準(zhǔn)確率更高。本試驗(yàn)評(píng)估的4種試劑盒的診斷敏感性較上述報(bào)道偏低，其原因可能是由于試驗(yàn)選取的免疫后感染豬血清采自田間疑似感染豬，而人工感染豬血清采自攻毒試驗(yàn)后10 d的豬。通常豬感染病毒1～2周后才開始產(chǎn)生NSP抗體[8-9]。故上述樣品雖均表現(xiàn)出口蹄疫癥狀，但采樣時(shí)尚未產(chǎn)生或只產(chǎn)生較弱的NSP抗體。通過實(shí)驗(yàn)還可看出，4種試劑盒對(duì)免疫3次后的健康血清與免疫1次的人工免疫健康豬血清的陰性檢出率無明顯差異，田間背景下免疫健康豬血清與實(shí)驗(yàn)室背景下免疫豬血清的檢出率也無明顯差異，因此3次以內(nèi)的免疫次數(shù)與免疫條件對(duì)檢測結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生影響。

具有較高敏感性的試劑盒，不一定具有較高的特異性。綜合判斷，試劑盒D的診斷敏感性、診斷特異性、分析敏感性和分析特異性較好。實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同的檢測目的，選取相應(yīng)的試劑盒，如對(duì)于進(jìn)出境動(dòng)物檢疫，要注重試驗(yàn)的敏感性，相反，對(duì)于流行病學(xué)監(jiān)測，則應(yīng)注重試驗(yàn)的特異性。

[1] World Organization for Animal Health（OIE）. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals：Chapter 2.1.8 Foot and mouth disease [M]. Pairs：OIE，2016.

[2] 季新成，哈森，于學(xué)輝，等. 三種ELISA試劑盒對(duì)牛新孢子蟲血清抗體比較檢測[J]. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2012，22（2）：24-27.

[3] PABLO J J，COMPAIRED D，TROTTA M，et al. Validation of an r3AB1-FMDV-NSP ELISA to distinguish between cattle infected and vaccinated with foot-and-mouth disease virus[J]. Journal of Virological Methods，2011，178（1/2）：191-200.

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Evaluation on the Performance of Four ELISA Tests for Antibody against Non-structural Protein of Foot-and-mouth Disease in Swine Sera

Shi Qian1，Chen Ruihua1，Wang Keke1，Xu Xinfeng1，Lun Zengjun2，Ji Xincheng1
（1. Xinjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Urumqi，Xinjiang 830063；2. Lanzhou Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Science，Lanzhou，Gansu 730046）

[Objective]To evaluate the quality of four commercialized ELISA kits for the detection of antibodies to the non-structural proteins（NSPs）of Foot-and-mouth disease virus（FMDV）. [Methods] The four commercialized ELISA kits were compared. The diagnostic sensitivity and specificity，analytic sensitivity and specificity，and repeatability of FMDV NSP ELISA kits were analyzed by detecting four types of sera from uninfected，vaccinated，naturally infected and challenged swine. [Results] The diagnostic sensitivity of the four ELISA kits were between 76.8% to 94.4%，the relatively high diagnostic specif i city were ranging from 97.7% to 100%，and both analytic sensitivity and specif i city were good. Sera from swine infected with other four different diseases cannot be detected using the kits. The repeatability of intra-assay was between（10.545±6.845）% to（37.577±28.626）%，and the inter-assay was between（9.037±6.075）% to（37.601±27.027）%. [Conclusion] In practice，the different kits could be selected for different detection purpose.

Foot-and-mouth disease；non-structural protein；ELISA kit；quality evaluation

S851.33

B

1005-944X（2017）08-0100-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.026

國家質(zhì)檢總局質(zhì)檢公益專項(xiàng)（201410061）

季新成