惠艷華，丁 寧，沈莉萍，葉慧萍，施蔡培，成建忠，鄢志剛，張維誼

（1.上海市崇明區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 202150；2.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

一例豬鏈球菌2型感染的病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

惠艷華1，丁 寧1，沈莉萍2，葉慧萍1，施蔡培1，成建忠1，鄢志剛1，張維誼2

（1.上海市崇明區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 202150；2.上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

2016年2月，上海市崇明區(qū)某鄉(xiāng)鎮(zhèn)一規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)40多頭5～8周齡仔豬發(fā)病死亡情況。經(jīng)細(xì)菌分離、分離菌株生化鑒定和PCR檢測(cè)，確診為豬鏈球菌2型感染。對(duì)該菌株采用K-B紙片法，進(jìn)行10種常用抗菌藥物的體外藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌對(duì)青霉素、阿莫西林、恩諾沙星敏感，對(duì)諾氟沙星、阿奇霉素、壯觀霉素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素和氨芐西林不敏感。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議養(yǎng)豬戶使用阿莫西林和恩諾沙星進(jìn)行治療，并做好病豬的隔離與護(hù)理。一周后病情得到控制。

豬鏈球菌病；豬鏈球菌2型；分離鑒定；PCR

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的人獸共患傳染病，在世界各地均有發(fā)生[1]，近年來(lái)在養(yǎng)豬場(chǎng)的流行呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。豬鏈球菌據(jù)其莢膜抗原差異，至少可分為35種血清型，大多數(shù)致病性血清型為1～9血清型，其中血清2型為最常見(jiàn)和毒力最強(qiáng)的血清型[2]。

1 發(fā)病情況及臨床癥狀

2016年2月，上海市崇明區(qū)某鄉(xiāng)鎮(zhèn)一規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)40多頭5～8周齡仔豬發(fā)病死亡情況，發(fā)病20多天，死亡35頭。病豬臨床表現(xiàn)為食欲不振、消瘦、跛腳、后肢關(guān)節(jié)腫大、個(gè)別豬腹瀉等癥狀，使用雙黃連、頭孢噻呋鈉等肌肉注射，結(jié)果療效不明顯。

2 剖檢病變

病死豬剖檢病變主要表現(xiàn)為心臟與胸腔粘連、心臟表面有纖維素滲出物、腹腔積液、肝臟及頜下淋巴結(jié)腫大、后肢關(guān)節(jié)有透明積液等。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1細(xì)菌分離

將無(wú)菌采集的病死豬心、肝、脾、肺和關(guān)節(jié)積液接種于哥倫比亞血瓊脂平板（購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司），在5% CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果均生長(zhǎng)出灰白色、圓形凸起、半透明、草綠色溶血的小菌落，革蘭氏染色為G+球菌，成雙或鏈狀排列，觸酶試驗(yàn)陰性。

3.2分離菌株生化鑒定

委托上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，按照GP鑒定卡操作步驟進(jìn)行操作，并在VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀上讀取鑒定結(jié)果。細(xì)菌鑒定結(jié)果為471051364313571，豬鏈球菌Ⅱ（Streptococcus suisⅡ），鑒定準(zhǔn)確率96%，生化特性詳見(jiàn)表1。

3.3PCR診斷

3.3.1細(xì)菌基因組DNA提取。用煮沸法制備DNA 模板，挑取數(shù)個(gè)菌落于含100 μL ddH2O的EP管中，100 ℃水浴10 min，12 000 r/min 離心5 min，吸取上清作為模板，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3.2引物合成、反應(yīng)體系和條件。參照文獻(xiàn)[4]合成豬鏈球菌通用和豬鏈球菌2型（表2），PCR反應(yīng)體系均為25 μL。反應(yīng)體系：premix 12.5 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，模板2 μL；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)熱5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將ATCC43765、HA9801為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌純水為陰性對(duì)照。

3.3.3電泳及結(jié)果。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果在分離菌株（重復(fù)2份）DNA中擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照一致目的條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶（圖1）

表1分離菌株生化特性

表2豬鏈球菌PCR引物序列

圖1 分離菌PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

3.4血清型鑒定

使用丹麥的豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)血清（批號(hào)為psu2-2-3），采用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分離菌株與豬鏈球菌2型標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生凝集。

3.5藥敏試驗(yàn)

將細(xì)菌純培養(yǎng)物采用K-B紙片法，對(duì)10種常用抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，36 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS 2010標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果該細(xì)菌對(duì)青霉素、阿莫西林、恩諾沙星敏感，對(duì)諾氟沙星、阿奇霉素、壯觀霉素、卡那霉素、阿米卡星、慶大霉素和氨芐西林不敏感。

4 結(jié)果

結(jié)合病豬臨床癥狀、剖檢變化及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，該病例可以確診為豬鏈球菌2型感染。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議養(yǎng)豬戶使用阿莫西林和恩諾沙星進(jìn)行治療，并做好病豬的隔離與護(hù)理。一周后回訪，病情已得到控制。

5 討論

鏈球菌種類多，屬條件性致病菌，在自然界和豬群中廣泛分布。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬鏈球菌病已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，但大多數(shù)在3～12周齡的仔豬中暴發(fā)流行。在豬鏈球菌眾多血清型中，2型是豬的最主要病原，致病性最強(qiáng)，同時(shí)其對(duì)人的致病性也最強(qiáng)。

豬鏈球菌病雖為細(xì)菌病，但對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害卻不容小覷，同時(shí)因豬鏈球菌病是人獸共患病，所以在生豬養(yǎng)殖過(guò)程中，飼養(yǎng)人員要加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)，有外傷時(shí)應(yīng)盡量避免接觸病豬。發(fā)病豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理及消毒工作，對(duì)病豬隔離治療，同時(shí)提高豬群的營(yíng)養(yǎng)水平。該病臨床上常用β內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類藥物進(jìn)行治療，但因青霉素易產(chǎn)生耐藥性，建議將其只用于敏感菌株所致疾病的治療[5]，最好根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)指導(dǎo)用藥。

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀和細(xì)菌培養(yǎng)及染色鏡檢等，能夠初步判斷豬感染鏈球菌疑似感染，但要確診需進(jìn)一步試驗(yàn)。本次通過(guò)多重PCR方法檢出了豬鏈球菌，證明多重PCR方法具有簡(jiǎn)便、快速，以及特異性和敏感性良好等優(yōu)點(diǎn)，適合基層單位應(yīng)用于鏈球菌的臨床鑒定。

[1] 趙云玲，王君瑋，王華.豬鏈球菌2型檢測(cè)技術(shù)概述[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（10）：

[2] 趙冉，孫建和，陸承平.多重PCR鑒定豬鏈球菌2型毒力菌株[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2006，24（6）：503-507.

[3] 祁金漢，張其祝.豬鏈球菌病的檢疫檢驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（11）：123.

[4] 李小軍.上海地區(qū)豬致病性鏈球菌及其毒力基因的檢測(cè)[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[5] BARBARA E S. 豬病學(xué)[M]. 9版. 趙德明，張仲秋，沈建忠，主譯. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：882.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Isolation，Identif i cation and Drug Sensitivity Test on Strains of Swine Streptococcus suis type 2 Isolated from a Case of Swine Streptococcosis

Hui Yanhua1，Ding Ning1，Shen Liping2，Ye Huiping1，Shi Caipei1，Cheng Jianzhong1，Yan Zhigang1，Zhang Weiyi2
（1. Chongming Animal Disease Prevention and Control Center，Shanghai 202150；2. Shanghai Animal Disease Prevention and Control Center，Shanghai 201103）

More than 40 piglets of 5～8-week-old were dead in a scaled swine farm in a township of Chongming district，Shanghai city，in 2016 February. The diagnosis of Streptococcus suis type 2 infection was confirmed by bacterial isolation，biochemical identif i cation and PCR detection. The vitro drug sensitivity test of 10 kinds of antibacterial drugs against to the strain were done by K-B method，the results showed that it was insensitive to Penicillin，Amoxicillin，Enrofloxacin，Norfloxacin，Azithromycin，Spectinomycin，Kanamycin，Amikacin，Gentamicin and Ampicillin. According to the results of drug sensitivity test，suggestions were put forward to treat the diseased swine with Amoxicillin and Enrof l oxacin，and to do good isolation and nursing care of sick swine. A week later，the illness was controlled.

Swine streptococcosis；Streptococcus suis type 2；isolation and identif i cation；PCR

S851.3

B

1005-944X（2017）08-0097-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.08.025

上海市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（滬農(nóng)科產(chǎn)字〔2016〕第6號(hào)）

成建忠