王 軍， 秦逸輝

[廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院(解放軍第174醫(yī)院)老年病科， 福建 廈門 361003]

Src/Stat3通路在高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移中的作用*

王 軍△， 秦逸輝

[廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院(解放軍第174醫(yī)院)老年病科， 福建 廈門 361003]

目的： 探討Src酪氨酸激酶(Src)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Stat3)在高糖(HG)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和遷移中的作用。方法: 首先將VSMC細(xì)胞株A7R5與HG (10～40 mmol/L)共同孵育24 h，MTT法及EdU染色檢測(cè)VSMCs 增殖，Transwell 小室檢測(cè)VSMCs 遷移，Western blot檢測(cè)p-Src、Src、p-Stat3和Stat3的蛋白水平。qPCR檢測(cè)Stat3靶基因細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Myc、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的表達(dá)。為了進(jìn)一步證實(shí)Src在高糖誘導(dǎo)VSMCs增殖和遷移中的作用，將HG與Src抑制劑saracatinib (100 nmol/L)共同孵育24 h，觀察Src對(duì)HG誘導(dǎo)VSMCs增殖、遷移及Stat3激活的影響。結(jié)果: HG能濃度依賴性地促進(jìn)VSMCs的增殖及遷移并激活Src和Stat3，上調(diào)Stat3靶基因cyclin D1、Myc、MMP2及MMP9的表達(dá)。抑制Src激活可抑制HG誘導(dǎo)的VSMCs增殖及Stat3的激活，同時(shí)下調(diào)cyclin D1及Myc的表達(dá)。結(jié)論: Src/Stat3通路可能在HG誘導(dǎo)的VSMCs增殖及遷移中發(fā)揮重要作用。

Src酪氨酸激酶； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3； 高糖； 血管平滑肌； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移

糖尿病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病率和死亡率是無(wú)糖尿病者的2～4倍，60%～80%的糖尿病患者將死于心血管疾病[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)及機(jī)制[2]。持續(xù)的高糖(high glucose，HG)刺激能誘導(dǎo)VSMC的增殖能力，VSMCs遷移至血管內(nèi)膜導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚、管腔狹窄[3-4]。Src酪氨酸激酶(Src tyrosine kinase，Src)是一種分子量為60 kD的非受體酪氨酸激酶，是Src激酶家族的成員，在細(xì)胞增殖，遷移及生存等方面發(fā)揮重要作用[5-6]。既往研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的VSMCs中Src激活，Src抑制劑能抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠血壓升高及肌球蛋白輕鏈激酶激活[5,7]。還有研究發(fā)現(xiàn)Src能介導(dǎo)醛固酮誘導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)[8]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，Stat3)是Stat家族的一員，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和存活的作用，受到Src的調(diào)控[9]。既往研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1β能激活Stat3并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[10]。目前，Src/Stat3信號(hào)通路在糖尿病血管并發(fā)癥中的作用尚不明確。本研究將在HG誘導(dǎo)的VSMC增殖及遷移細(xì)胞模型中探討Src/Stat3的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco；MTT和D-葡萄糖購(gòu)自Sigma；蛋白定量試劑盒和ECL顯影劑購(gòu)自Thermo；EdU染色試劑盒購(gòu)自銳博；Transwell 小室購(gòu)自Corning；Trizol和qPCR引物購(gòu)自Life technologies；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；抗p-Src、Src、p-Stat3、Stat3和GAPDH抗體購(gòu)自CST。

2 方法

2.1 VSMCs的培養(yǎng) VSMC細(xì)胞系A(chǔ)7R5購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取3～5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 EdU染色 加入不同處理因素刺激24 h后，加入含50 μmol/L EdU的培養(yǎng)基孵育12 h。棄培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞2次。每孔加入100 μL細(xì)胞固定液，于脫色搖床室溫孵育15 min。去固定液，每孔加入100 μL (2 g/L)甘氨酸脫色搖床孵育5 min，PBS洗1次。每孔加入100 μL滲透劑，脫色搖床孵育10 min，PBS洗1次。每孔加入100 μL的Apollo染色反應(yīng)液，避光，于脫色搖床室溫孵育30 min。加入100 μL滲透劑，脫色搖床上室溫孵育10 min。每孔加入100 μL Hoechst 33342反應(yīng)液，避光，脫色搖床上室溫孵育30 min。PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察，每孔隨機(jī)選擇3個(gè)視野，計(jì)算EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞比例。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后換成2% DMEM細(xì)胞周期同步化12～24 h。加入不同的處理因素24 h后加入MTT溶液，37 ℃放置4 h，移除孔內(nèi)所有液體后加入DMSO將細(xì)胞中的結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(A)，計(jì)算出細(xì)胞活力。

2.4 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移 消化A7R5細(xì)胞，每個(gè)Transwell 小室接種2×104個(gè)細(xì)胞，孵育24 h 后棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染色10 min，顯微鏡下取3個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，PBS漂洗后收集細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液裂解，提取總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒定量，樣品加入緩沖液，100 ℃、5 min變性，總蛋白上樣量為30 μg，用10%的SDS-PAGE分離，半干電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h后，分別用相應(yīng)的 I 抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后用 II 抗(1∶5 000稀釋)在室溫孵1 h，TBST 洗膜3次后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白條帶，用GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參照，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度值之比。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 采用qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。每孔加入1 mL Trizol，室溫裂解10 min，加入0.2 mL三氯甲烷，劇烈顛倒混勻15 s。靜置10 min后4 ℃、 12 000 r/min離心15 min，吸取上層水樣層加入0.5 mL異丙醇，顛倒混勻后，25 ℃放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，移去上清。1 mL 75%乙醇沉淀RNA，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，在防止丟失RNA沉淀的前提下吸盡上清，靜置以揮發(fā)乙醇。DEPC水30 μL溶解RNA，參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以GAPDH作為內(nèi)參照，按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qPCR檢測(cè)。Cyclin D1的上游引物為5’-AAC TAC CTG GAC CGT TTC TTG-3’，下游引物為5’-GGG AAT GGT CTC CTT CAT CTT AG-3’；Myc的上游引物為5’-AGC TTC GCT AAC AGG AAC TAT G-3’， 下游引物為5’-CTG CTG TTG CTG GTG ATA GA-3’；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2的上游引物為5’-CAC CAA GAA CTT CCG ACT ATC C-3’，下游引物為5’-TCC AGT ACC AGT GTC AGT ATC A-3’；MMP9的上游引物為5’-GAG CGT TAC TCG CTT GGA TAA-3’；下游引物為5’-AAT AGG CCT TGT CTT GGT AGT G-3’；GAPDH的上游引物為5’-GGA GAA ACC TGC CAA GTA TGA-3’， 下游引物為5’-TTG AAG TCA CAG GAG ACA ACC-3’。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，若方差齊則采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，若方差不齊，則采用Dunnetts T3法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HG促進(jìn)VSMCs增殖

HG能劑量依賴性地增加EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。此外，HG還能濃度依賴性的升高VSMC的細(xì)胞活力，與control組比較，10、20和40 mmol/L的HG可劑量依賴性地促進(jìn)VSMCs增殖，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.High glucose (HG) enhanced VSMC proliferation. A: the representative images of EdU staining (×100); B: the cell viability was detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3～6.**P<0.01vscontrol group.

圖1 高糖誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖

2 HG誘導(dǎo)VMSCs遷移

由圖2可知， HG能劑量依賴性的增加遷移細(xì)胞數(shù)量，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

3 HG能激活Src/Stat3通路并上調(diào)Stat3靶基因的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示HG能顯著升高VSMC中p-Src的含量，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。HG能劑量依賴性地增加p-Stat3含量，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示HG能顯著升高VSMC中Stat3靶基因cyclin D1及Myc mRNA的水平(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.High glucose (HG) induced VSMC migration (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 高糖誘導(dǎo)血管平滑肌遷移

Figure 3.High glucose (HG) activated Src/Stat3 pathway and enhanced the expression of Stat3 target genes. A: the representative images and phosporylation levels of Scr and Stat3 detected by Western blot; B: relative mRNA expression levels of cyclin D1, Myc, MMP2 and MMP9. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 高糖激活Src/Stat3通路并升高Stat3靶基因的表達(dá)

4 抑制Src部分阻斷HG誘導(dǎo)的Stat3激活及其下游靶基因的表達(dá)

我們采用Src抑制劑saracatinib驗(yàn)證激活Src在HG誘導(dǎo)Stat3激活中的作用，結(jié)果顯示，saracatinib(100 nmol/L)和HG(40 mmol/L)共同孵育預(yù)處理24 h后，HG和saracatinib共處理組的p-Src和p-Stat3蛋白水平顯著低于HG單獨(dú)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。我們還進(jìn)一步驗(yàn)證HG是否通過(guò)Src激活Stat3下游靶基因，結(jié)果顯示。HG與saracatinib共處理組的cyclin D1、Myc、MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)水平顯著低于HG單獨(dú)處理組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Inhibition of Src partly blocked HG-induced Stat3 activation and the expression of Stat3 target genes. A: the representative images and phosphorylation levels of Src and Stat3 detected by Western blot; B: relative mRNA expression levels of cyclin D1, Myc, MMP2 and MMP9. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHG group.

圖4 抑制Src部分阻斷了高糖激活Stat3及增加Stat3靶基因表達(dá)的作用

5 抑制Src部分阻斷HG誘導(dǎo)VSMCs增殖

我們采用Src抑制劑saracatinib驗(yàn)證激活Src在HG誘導(dǎo)VSMCs增殖中的作用。EdU染色結(jié)果顯示，HG和saracatinib共處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，與HG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，HG和saracatinib共處理組的細(xì)胞活性顯著降低，與HG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見(jiàn)圖5。

6 抑制Src部分阻斷HG誘導(dǎo)VSMCs遷移

我們采用Src抑制劑saracatinib驗(yàn)證激活Src在HG誘導(dǎo)VSMCs遷移中的作用。Transwell檢測(cè)結(jié)果如圖6所示， HG和saracatinib共處理組的遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少，與HG組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。

討 論

VSMCs增殖加快并由血管中層向內(nèi)膜遷移是動(dòng)脈粥樣硬化重要機(jī)制之一[11]。研究證實(shí)HG[12]、氧化低密度脂蛋白[13]、Ang Ⅱ[14]、醛固酮[15]等動(dòng)脈粥樣硬化病理因素均能促進(jìn)VSMCs的增殖及遷移。還有研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)基因能延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[16]。本研究對(duì)HG促進(jìn)VSMCs增殖及遷移的機(jī)制進(jìn)行探索，對(duì)于進(jìn)一步揭示糖尿病促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)理有一定的意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ通過(guò)激活Src促進(jìn)VSMCs增殖及遷移[17]。國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究探索Src/Stat3信號(hào)通路在HG誘導(dǎo)VSMC增殖及遷移中的作用。首先，本研究利用HG誘導(dǎo)VSMC增殖細(xì)胞模型對(duì)Src的功能進(jìn)行了初步研究。我們先采用不同劑量HG刺激24 h后檢測(cè)VSMCs活力及EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示HG能升高VSMCs活力，增加EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。我們還采用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移，結(jié)果顯示HG能劑量依賴性地促進(jìn)VSMCs遷移。這些結(jié)果提示HG能促進(jìn)VSMCs增殖及遷移，這與既往研究的結(jié)果一致[18-19]。我們進(jìn)一步檢測(cè)Src的活性，結(jié)果顯示HG能劑量依賴性地升高p-Src的表達(dá)水平。這提示HG能誘導(dǎo)VSMCs中Src的激活，Src可能在HG誘導(dǎo)的VSMCs增殖中發(fā)揮重要作用。接著，我們采用Src抑制劑saracatinib抑制Src激活，驗(yàn)證Src在HG誘導(dǎo)的VSMCs增殖及遷移中的作用，結(jié)果顯示saracatinib能抑制HG誘導(dǎo)的VSMCs增殖及遷移。這提示Src可能在HG誘導(dǎo)的血管平滑肌增殖及遷移中發(fā)揮重要作用。

Figure 5.Inhibition of Src partly abolished the pro-proliferative effect of HG on the VSMCs.A: representative images and EdU positive cell ratio after EdU staining (×100); B: the cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3～6.**P<0.01vsHG group.

圖5 抑制Src部分阻斷了高糖促血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用

Figure 6.Inhibition of Src partly abolished the pro-migratory effect of HG on the VSMCs (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHG group.

圖6 抑制Src部分阻斷了高糖促血管平滑肌細(xì)胞遷移的作用

Stat3是一個(gè)具有調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、存活的作用的轉(zhuǎn)錄因子，已被證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)HG能升高VSMCs中p-Stat3的水平。我們還發(fā)現(xiàn)HG能升高cyclin D1及Myc的表達(dá)。Cyclin D1和Myc已被證實(shí)是Stat3的靶基因，Stat3能通過(guò)上調(diào)cyclin D1及Myc的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，MMP2及MMP9具有調(diào)控細(xì)胞遷移的作用[21]。這些結(jié)果提示HG能促進(jìn)Stat3信號(hào)通路的激活。更重要的是，我們還發(fā)現(xiàn)抑制Src能抑制HG誘導(dǎo)的Stat3的激活以及上述4個(gè)靶基因的表達(dá)。這個(gè)結(jié)果提示HG通過(guò)Src激活Stat3信號(hào)通路。

在本研究中，我們明確了HG能促進(jìn)VSMCs增殖、遷移并激活Src/Stat3信號(hào)通路。更重要的是我們發(fā)現(xiàn)抑制Src能抑制HG誘導(dǎo)VSMCs增殖、遷移及Stat3激活。這提示HG可能通過(guò)激活Src/Stat3通路促進(jìn)VSMCs增殖及遷移。Src/Stat3可能是防治糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥的新靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

High glucose induces vascular smooth muscle cell proliferation and migration through activation of Src/Stat3 signaling pathway

WANG Jun, QIN Yi-hui

(DepartmentofGeratology,ChenggongHospitalofXiamenUniversity,The174thHospitalofPLA,Xiamen361003,China.E-mail:wangjun_xmu@163.com)

AIM: To investigate the role of Src tyrosine kinase (Src)/signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) signaling pathway in high glucose (HG)-induced vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation and migration. METHODS: VSMCs were incubated with HG (10～40 mmol/L) for 24 h. The cell proliferation was detected by MTT assay and EdU staining, while the migration ability of VSMCs was measured by Transwell assay. The protein levels of p-Src, Src, p-Stat3, Stat3 and GAPDH were determined by Western blot. The mRNA expression levels of cyclin D1, Myc, matrix metalloproteinase 2 (MMP2) and matrix metalloproteinase 9 (MMP9) were detected by qPCR. To further confirm the role of Src in HG-induced VSMC proliferation, the VSMCs were exposed to HG (40 mmol/L) and co-treated with Src inhibitor saracatinib (100 nmol/L) for 24 h, and then the proliferation ability and the Stat3 activity of the cells were analyzed. RESULTS: Treatment with HG dose-dependently enhanced the cell viability, increased the ratio of EdU-positive cells, and raised the migration cell number， the protein levels of p-Src and p-Stat3 and the mRNA levels of cyclin D1, Myc, MMP2 and MMP9. Inhibition of Src inhibited HG-induced VSMC proliferation and migration, and suppressed Stat3 activation and the expression of Stat3 target genes cyclin D1, Myc, MMP2 and MMP9. CONCLUSION: Src/Stat3 signaling pathway might play an important role in HG-induced VSMC proliferation and migration.

Src tyrosine kinase; Signal transducer and activator of transcription 3; High glucose; Vascular smooth muscle cells; Cells proliferation; Cells migration

1000- 4718(2017)07- 1237- 07

2016- 08- 03

2017- 05- 17

南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(No. 11MA073)

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.014

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