馬濤 王通

齊魯師范學(xué)院體育學(xué)院（山東 濟(jì)南 250200）

運(yùn)動對廢用性骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝和破骨細(xì)胞分化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響

馬濤 王通

齊魯師范學(xué)院體育學(xué)院（山東 濟(jì)南 250200）

目的：研究跑臺運(yùn)動對廢用性骨質(zhì)疏松的作用以及破骨細(xì)胞分化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)在其中的介導(dǎo)作用。方法：6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠40只，分為正常對照組、廢用模型組、正?；謴?fù)組和運(yùn)動恢復(fù)組，每組10只。正常對照組不做任何特殊處理，安靜飼養(yǎng)4周后處死；廢用模型組尾部懸吊4周后處死；正?；謴?fù)組尾部懸吊4周后，安靜飼養(yǎng)4周處死；運(yùn)動恢復(fù)組尾部懸吊4周后，跑臺訓(xùn)練4周處死。各組大鼠處死后立即進(jìn)行骨密度（BMD）、骨組織形態(tài)計量學(xué)、骨組織抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）染色計量、骨代謝以及破骨細(xì)胞分化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞因子等指標(biāo)的測試。結(jié)果：廢用模型組大鼠BMD、骨小梁體積百分比（TBV）、骨小梁寬度（Tb.Wi）、血清堿性磷酸酶（ALP）濃度、骨髓細(xì)胞因子OPG基因表達(dá)量均顯著小于正常對照組（P<0.01），而骨小梁間距（Tb.Sp）、脛骨干骺端TRACP-5b平均陽性染色面積百分比（APSAP）、血清Ca2+和TRACP-5b濃度、骨髓細(xì)胞因子RANKL、M-CSF、RANK、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量則顯著大于正常對照組（P<0.01）。運(yùn)動恢復(fù)組大鼠BMD、TBV、Tb.Wi、血清ALP濃度、骨髓細(xì)胞因子OPG基因表達(dá)量均顯著大于正?；謴?fù)組（P<0.05或P<0.01），而Tb.Sp、血清Ca2+和TRACP-5b濃度、脛骨干骺端APSAP、骨髓細(xì)胞因子RANKL、M-CSF、RANK、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量均顯著小于正常恢復(fù)組（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：4周的尾部懸吊可導(dǎo)致大鼠廢用性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，跑臺運(yùn)動可以促進(jìn)廢用性骨質(zhì)疏松癥的恢復(fù)，這均與骨髓微環(huán)境破骨細(xì)胞分化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。

運(yùn)動；廢用性骨質(zhì)疏松；骨代謝；破骨細(xì)胞；OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨質(zhì)流失為主要特征的骨組織退行性疾病，據(jù)國際骨質(zhì)疏松協(xié)會統(tǒng)計，全球每年有近900萬人發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[1]。廢用性骨質(zhì)疏松癥可發(fā)生于脊髓損傷不能運(yùn)動的患者以及其它由于疾病或手術(shù)而長期臥床休息的患者，此外，由于宇航員長期處于太空微重力的環(huán)境下，其骨組織（尤其是下肢承重骨）由于缺乏正常的機(jī)械負(fù)荷刺激，廢用性骨質(zhì)疏松癥也時有發(fā)生[2]。廢用性骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折不但使患者身心受到巨大摧殘，而且也對患者家庭及社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，廢用性骨質(zhì)疏松癥的防治方法研究至關(guān)重要[3]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，通過尾部懸吊使大鼠后肢不能正常承重，造成后肢廢用性骨質(zhì)疏松模型，從而研究運(yùn)動對廢用性骨質(zhì)疏松癥的治療作用。

骨組織是一個代謝活躍的組織，在整個生命過程中骨組織不斷地進(jìn)行著骨質(zhì)的更新—骨重建，骨重建的過程包括破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用的協(xié)調(diào)平衡[4]。在某些情況下，骨吸收和骨形成過程不能保持平衡即可造成骨組織疾病，如在骨吸收作用障礙的情況下可造成骨硬化癥，在骨吸收作用亢進(jìn)的情況下可造成骨質(zhì)疏松癥等[5]。事實上，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間存在著相互調(diào)控的作用。研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞可以調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和活性，而OPGRANKL-RANK系統(tǒng)則是目前為止所發(fā)現(xiàn)的一個主要信號調(diào)節(jié)通路[6]，本研究從OPG-RANKL-RANK信號通路的角度研究運(yùn)動對廢用性骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞分化的影響，并通過對骨組織破骨細(xì)胞特異性酶抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）的染色來反映骨組織破骨細(xì)胞的骨吸收活性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

6周齡健康純系雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體重213.33±18.26 g，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（滬）2003－0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為正常對照組、廢用模型組、正常恢復(fù)組和運(yùn)動恢復(fù)組，每組10只。各組大鼠采取的干預(yù)及測試方案如下：正常對照組：不做任何特殊處理，安靜飼養(yǎng)4周后處死，進(jìn)行指標(biāo)測試；廢用模型組：尾部懸吊致后肢廢用4周后處死，進(jìn)行指標(biāo)測試；正常恢復(fù)組：尾部懸吊4周后，安靜飼養(yǎng)4周處死，進(jìn)行指標(biāo)測試；運(yùn)動恢復(fù)組：尾部懸吊4周后，進(jìn)行跑臺訓(xùn)練（段式ZH-PT）。跑臺訓(xùn)練第1周的前3天為適應(yīng)性訓(xùn)練，跑速為10 m/min，每次訓(xùn)練時間為20 min，跑臺坡度為0。從第4天開始，跑速固定為13 m/min，每次訓(xùn)練時間固定為40 min，跑臺坡度為0，每周訓(xùn)練6次（周一至周六每天1次），共訓(xùn)練4周后處死，進(jìn)行指標(biāo)測試。

1.2 廢用性骨質(zhì)疏松模型的建立

廢用模型組、正?；謴?fù)組和運(yùn)動恢復(fù)組大鼠均需要進(jìn)行廢用干預(yù)，本實驗室通過尾部懸吊的方法自制后肢廢用性骨質(zhì)疏松模型，其具體制作方法在本實驗室研究團(tuán)隊前期相關(guān)研究文獻(xiàn)中已有詳述[7]，在此就不再重復(fù)。

1.3 取材

正常對照組和廢用模型組大鼠在安靜飼養(yǎng)或尾部懸吊4周后處死，進(jìn)行指標(biāo)測試；為了減少急性運(yùn)動對測試指標(biāo)的影響，正?；謴?fù)組和運(yùn)動恢復(fù)組大鼠的取材，均安排在運(yùn)動恢復(fù)組大鼠最后一次訓(xùn)練結(jié)束24 h后進(jìn)行。斷頸椎處死大鼠，在斷頸椎后即刻進(jìn)行心臟取血，待測血清骨代謝生化標(biāo)志物；取其兩側(cè)股骨和脛骨，剔除骨組織上附著的軟組織，將左側(cè)股骨用生理鹽水浸透的紗布包裹好，放于－20℃冰箱保存，待測骨密度（BMD）；將右側(cè)股骨浸泡在PBS中，待測骨髓細(xì)胞因子。將兩側(cè)脛骨在PBS中清洗后，投入4%PFA溶液中，左側(cè)脛骨待做不脫鈣切片，進(jìn)行脛骨近端干骺端骨小梁組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)；右側(cè)脛骨待進(jìn)行骨組織TRACP-5b染色。

1.4 指標(biāo)的測定

1.4.1 骨密度測試及骨組織HHEE染色

將左側(cè)股骨從－20℃冰箱中取出，室溫自然解凍24小時，雙能X線骨密度儀（型號為Hologic Discovery A）掃描股骨骨密度；將左側(cè)脛骨做不脫鈣切片，HE染色，在日本產(chǎn)Olympus IX71顯微鏡下觀察并拍片，通過Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件統(tǒng)計脛骨干骺端近端骨小梁組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)，指標(biāo)包括骨小梁體積百分比（TBV）、骨小梁寬度（Tb.Wi）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.Sp），統(tǒng)計位置在距骺線1～4 mm范圍，其具體步驟已在本研究團(tuán)隊前期發(fā)表的論文[8]中詳細(xì)闡述，在此不在重復(fù)。

1.4.2 骨組織TRRAACCPP-- 55 bb染色

使骨組織在4%多聚甲醛（PFA）溶液中4℃過夜，第2天4%PFA換液繼續(xù)固定24小時，然后10%EDTA溶液脫鈣1周，10%EDTA換液繼續(xù)脫鈣1周，雙蒸水清洗，梯度酒精脫水，常規(guī)二甲苯透明處理，常規(guī)石蠟包埋，在Leica石蠟切片機(jī)上以5 μm的厚度切片，常規(guī)二甲苯脫臘，梯度酒精水化，雙蒸水清洗后，加入固定液，室溫固定30 s，雙蒸水清洗，加入TRACP-5b染色試劑盒中的染液，37℃水浴中染色4小時（Acid Phospha?taseLeukocyteKit，Sigma）。雙蒸水清洗，Leica DM4000電子顯微鏡拍片，用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件統(tǒng)計脛骨干骺端TRACP-5b陽性染色區(qū)域的平均陽性染色面積百分比（Average positive staining area percentage，APSAP）。

1.4.3 血清骨代謝生化標(biāo)志物的測試

將心臟取血得到的血液在4℃條件下即刻進(jìn)行離心操作，轉(zhuǎn)速為3000 rpm，離心時間3 min，分離大鼠血清[9]，比色法檢測血清骨代謝生化標(biāo)志物血清鈣離子（Ca2+）、血清磷離子（P）、堿性磷酸酶（ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b），試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 熒光定量PPCCRR測試OPG-RANKL--RRAANNKK系統(tǒng)相關(guān)調(diào)節(jié)因子

骨兩端用剪刀剪開，用2～3 ml α-MEM培養(yǎng)基、10 ml注射器和27G針頭沖洗出骨髓；常規(guī)方法提取骨髓總RNA；瓊脂糖凝膠鑒定RNA完整性，NANODROP 2000 spectrophotometer測定RNA純度和濃度，確認(rèn)OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間并記錄各樣本的濃度；常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄；根據(jù)所要檢測的目的基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢各基因引物序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成，各基因引物序列及擴(kuò)增長度見表1；熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照以下體系進(jìn)行，SYBR Premix Ex TaqTM（2×）10 μL、PCR Forward Prim?er（10 μm）0.4 μL、PCR Reverse Primer（10 μm）0.4 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、DNA模板2μL、加DEPC水使總反應(yīng)體系達(dá)到20 μL；Real time PCR分3階段，擴(kuò)增采用3步法進(jìn)行，溫度循環(huán)參數(shù)如下：Stage 1（1×）：95℃，1 min（預(yù)變性）。Stage 2（40×）：95℃，15 s；61℃，30 s；72℃，45 s（收集熒光）。Stage3（1×）：建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，95℃，30 s；61℃，2 min；95℃，15 s；每1℃收集熒光；反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以β-actin基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔCt計算各基因的相對表達(dá)量。

表1 骨髓細(xì)胞因子基因引物設(shè)計

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 骨密度

由圖1可知，各組大鼠股骨干骺端骨密度比較結(jié)果顯示，廢用模型組顯著小于正常對照組（P<0.01），運(yùn)動恢復(fù)組顯著大于正常恢復(fù)組（P<0.01）。

圖1 各組大鼠股骨骨密度比較

2.2 骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)

由表2可知：各組大鼠脛骨近段干骺端組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果顯示：廢用模型組骨小梁體積百分比（TBV）和骨小梁寬度（Tb.Wi）均顯著小于正常對照組（P<0.01）；廢用模型組骨小梁間距（Tb.Sp）顯著大于正常對照組（P<0.01）；運(yùn)動恢復(fù)組骨小梁體積百分比（TBV）和骨小梁寬度（Tb.Wi）均顯著大于正?；謴?fù)組（P<0.05或P<0.01）；運(yùn)動恢復(fù)組骨小梁間距（Tb.Sp）顯著小于正?；謴?fù)組（P<0.01）；各組骨小梁數(shù)目（Tb.N）之間沒有顯著性差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠脛骨干骺端組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)（n=8）

2.3 骨組織TRRAACCPP-- 55 bb染色

抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）是成熟的破骨細(xì)胞所分泌的破骨細(xì)胞特異性酶，TRACP-5b經(jīng)染色呈現(xiàn)紅色，故染色后破骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紅色陽性，所以通常用TRACP-5b經(jīng)染色呈現(xiàn)紅色的面積來反映破骨細(xì)胞的數(shù)量。從圖2可以看出，大鼠脛骨骨骺、骺板以及干骺端的骨吸收陷窩內(nèi)的紅色陽性染色較多，證明破骨細(xì)胞多分布于這些部位，且沿骨吸收陷窩邊緣排列，以骺板部位的破骨細(xì)胞最為密集，另外在皮質(zhì)骨的外表面也分布有大量紅色陽性染色的破骨細(xì)胞。

由圖3可知，廢用模型組脛骨干骺端TRACP-5b平均陽性染色面積百分比（APSAP）顯著大于正常對照組（P<0.01），運(yùn)動恢復(fù)組脛骨干骺端TRACP-5b平均陽性染色面積百分比（APSAP）顯著小于正?；謴?fù)組（P<0.01）。

2.4 血清骨代謝生化標(biāo)志物

由表3可知，各組大鼠血清骨代謝生化標(biāo)志物比較結(jié)果顯示：廢用模型組反映骨吸收的指標(biāo)血清Ca2+和TRACP-5b濃度均顯著大于正常對照組（P<0.01），同時廢用模型組反映骨形成的指標(biāo)血清ALP濃度顯著小于正常對照組（P<0.01）；運(yùn)動恢復(fù)組反映骨吸收的指標(biāo)血清Ca2+和TRACP-5b濃度均顯著小于正?；謴?fù)組（P<0.05或P<0.01），同時運(yùn)動恢復(fù)組反映骨形成的指標(biāo)血清ALP濃度顯著大于正?；謴?fù)組（P<0.01）；各組血清P濃度無顯著性差異（P>0.05）。

圖2 各組大鼠脛骨近段干骺端TRACP-5b染色（40×）

2.5 OPG-RANKL--RRAANNKK系統(tǒng)相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)

由表4可知，各組大鼠骨髓局部OPG-RANKLRANK系統(tǒng)相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)量比較結(jié)果顯示：廢用模型組促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子RANKL、M-CSF、RANK、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量均顯著大于正常對照組（P<0.01），同時廢用模型組抑制破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子OPG顯著小于正常對照組（P<0.01）；運(yùn)動恢復(fù)組促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子RANKL、M-CSF、RANK、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量均顯著小于正?；謴?fù)組（P<0.05或P<0.01），同時運(yùn)動恢復(fù)組抑制破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子OPG顯著大于正?；謴?fù)組（P<0.01）。

圖3 各組大鼠脛骨近段干骺端TRACP-5b平均陽性染色面積百分比

表3 各組大鼠血清骨代謝生化標(biāo)志物指標(biāo)（n=8）

表4 各組大鼠OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)（n=8）

3 分析與討論

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少為特征的常見病、多發(fā)病。骨質(zhì)疏松患者由于骨量的減少極易發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折以及一些其它代謝性疾病[10]。業(yè)已證明，機(jī)械負(fù)荷刺激對于維持骨密度和骨量具有重要意義[11]，如人體承重骨骨密度明顯大于非承重骨骨密度，再如運(yùn)動員的骨組織由于長期承受較高的沖擊性機(jī)械刺激，其骨密度顯著高于非運(yùn)動員。而廢用（缺少機(jī)械負(fù)荷刺激）則是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要原因之一，缺少機(jī)械負(fù)荷刺激將會使骨代謝的平衡遭到破壞并進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)的快速流失以及骨組織機(jī)械功能的受損，廢用導(dǎo)致的骨質(zhì)流失起因于骨吸收作用的增強(qiáng)和骨形成作用的減弱[12]。在本研究中，廢用模型組大鼠骨密度顯著低于正常對照組。這說明本研究通過尾部懸吊制造大鼠廢用性骨質(zhì)疏松模型的方法是有效的。目前國內(nèi)外有關(guān)廢用性骨質(zhì)疏松的動物模型主要包括神經(jīng)切斷術(shù)、尾部懸吊、石膏固定以及彈性包扎等。本研究在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了尾部懸吊模型，主要是通過增加旋轉(zhuǎn)鏈接裝置以提高懸吊模型大鼠的活動自由度以及改進(jìn)包扎方式以減少大鼠尾部損傷，與以往方法相比，效果較好，在整個廢用干預(yù)期間廢用模型組動物體重變化和正常對照組之間差異較小。此外，廢用模型也沒有造成動物尾部皮膚的潰爛或者腫脹。

除骨密度之外，本研究還從股骨近端干骺端骨小梁微細(xì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)計量學(xué)層面進(jìn)一步對各組大鼠進(jìn)行對比。其中，骨小梁體積百分比（TBV）綜合反映了測量區(qū)域內(nèi)骨小梁面積和總測量面積的比值，骨小梁寬度（Tb.Wi）反映了測量范圍內(nèi)骨小梁的粗細(xì)程度，骨小梁數(shù)目（Tb.N）反映了測試區(qū)域骨小梁的疏密程度，骨小梁間距（Tb.Sp）反映了測量區(qū)域內(nèi)相鄰骨小梁的間隙大小[13]。其中，TBV、Tb.Wi和Tb.N均和骨組織骨密度成正相關(guān)，而Tb.Sp和骨組織骨密度呈負(fù)相關(guān)[14]。無論是從股骨骨密度指標(biāo)，還是脛骨骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)，本研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)廢用模型組大鼠均出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)流失。與正常恢復(fù)組相比，運(yùn)動恢復(fù)組大鼠的骨密度和骨結(jié)構(gòu)都得到了較快的恢復(fù)。同時，從反映骨代謝的血清生化標(biāo)志物結(jié)果看，廢用模型組反映骨吸收的指標(biāo)血清Ca2+和TRACP-5b濃度均顯著大于正常對照組，同時廢用模型組反映骨形成的指標(biāo)血清ALP濃度顯著小于正常對照組；運(yùn)動恢復(fù)組反映骨吸收的血清Ca2+和TRACP-5b濃度均顯著小于正?；謴?fù)組，同時運(yùn)動恢復(fù)組反映骨形成的指標(biāo)血清ALP濃度顯著大于正?；謴?fù)組。這說明廢用導(dǎo)致大鼠骨形成作用減弱而骨吸收作用亢進(jìn)，從而導(dǎo)致大鼠骨密度的下降和骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)的變化，出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥。與正?；謴?fù)相比，運(yùn)動可以顯著促進(jìn)廢用性骨質(zhì)疏松的恢復(fù)。此結(jié)果與本實驗室前期關(guān)于運(yùn)動防治廢用性骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究結(jié)果相符合[7]。

值得注意的是，在本研究中，不論是股骨骨密度還是脛骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)TBV、Tb.Wi和Tb.Sp方面，運(yùn)動恢復(fù)組不但顯著高于廢用模型組和正?；謴?fù)組，而且也顯著高于正常對照組。我們認(rèn)為，出現(xiàn)這一結(jié)果一方面是因為運(yùn)動對骨組織產(chǎn)生了積極的影響，另一方面是由于大鼠骨組織隨年齡的自然增長而導(dǎo)致的，因為正常恢復(fù)組和運(yùn)動恢復(fù)組大鼠均比正常對照組和廢用模型組大鼠多生長了4周的時間。正是由于在廢用干預(yù)之后骨組織4周的自然生長加之跑臺運(yùn)動對其產(chǎn)生的積極影響，才使得運(yùn)動恢復(fù)組大鼠骨密度和骨組織形態(tài)計量學(xué)指標(biāo)均顯著大于正常對照組。同時我們也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動恢復(fù)組大鼠血清骨代謝指標(biāo)ALP也顯著大于正常對照組，這一指標(biāo)反映的是骨形成作用的強(qiáng)弱，說明跑臺運(yùn)動不但能夠使大鼠因廢用干預(yù)而減弱的骨形成作用得以恢復(fù)，而且還可以使其骨形成作用超過正常狀態(tài)。在本實驗室前期關(guān)于運(yùn)動防治廢用性骨質(zhì)疏松的相關(guān)研究中也得到了類似的結(jié)果[7]，在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)模擬失重＋游泳訓(xùn)練組和模擬失重＋跑臺訓(xùn)練組大鼠股骨以及第5腰椎骨密度均顯著大于正常對照組，而且模擬失重＋游泳訓(xùn)練組和模擬失重＋跑臺訓(xùn)練組大鼠股骨以及第5腰椎的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)和材料力學(xué)參數(shù)均顯著大于正常對照組。

骨重建是一個舊的骨組織逐漸被新的骨組織所取代的動態(tài)過程，這包括破骨細(xì)胞的骨吸收作用和成骨細(xì)胞的骨形成作用的協(xié)調(diào)平衡。專門負(fù)責(zé)骨吸收作用的破骨細(xì)胞起源于巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞譜系，在一系列激素和細(xì)胞因子的調(diào)控作用下，由多能造血干細(xì)胞增殖為單核細(xì)胞，進(jìn)入組織后轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化和融合，最終形成多核的破骨細(xì)胞[15]。研究表明，抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRACP-5b）是由成熟的破骨細(xì)胞在骨吸收過程中特異性分泌的，所以測量骨組織TRACP-5b的含量即可了解骨組織正在進(jìn)行骨吸收活動的程度[16]。本研究骨組織TRACP-5b的結(jié)果顯示，廢用模型組脛骨干骺端TRACP-5b平均陽性染色面積百分比（APSAP）顯著大于正常對照組，運(yùn)動恢復(fù)組脛骨干骺端TRACP-5b平均陽性染色面積百分比（APSAP）顯著小于正?；謴?fù)組。此結(jié)果說明廢用導(dǎo)致大鼠骨組織破骨細(xì)胞分化加快，活性增加，造成了骨組織較快的骨吸收。與正常恢復(fù)組相比，運(yùn)動可以顯著抑制骨組織破骨細(xì)胞的分化與活性，降低骨吸收。此外，在反映骨吸收的指標(biāo)中，除了骨組織TRACP-5b染色外，血清中的TRACP-5b含量也和骨吸收活動高度相關(guān)且可以通過免疫技術(shù)等方法進(jìn)行具體測量，可作為評價骨吸收的一個主要血清標(biāo)志物[17]。血清TRACP-5b作為一項骨吸收標(biāo)志物已經(jīng)在大量骨吸收疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌，肺癌，前列腺癌等）的檢測結(jié)果中得到證明[18]。目前，血清TRACP-5b作為骨吸收標(biāo)志物已逐步應(yīng)用于臨床對骨質(zhì)疏松等骨吸收疾病診斷的特異性和敏感性指標(biāo)[19]。

在骨質(zhì)疏松的細(xì)胞與分子機(jī)制研究中，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的信號通訊以及由此調(diào)控的骨形成與骨吸收的平衡問題是近年來研究的熱點問題[20]。成骨細(xì)胞可以調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和活性，而OPG-RANKLRANK系統(tǒng)則是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一個主要信號調(diào)節(jié)通路[21]。OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和活性主要包括三個主要過程：（1）造血前體細(xì)胞（這里稱為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞）的表面表達(dá)核因子κB受體活化因子（RANK）；（2）核因子κB受體活化因子配體（RANKL）在成骨細(xì)胞表面表達(dá)并進(jìn)而經(jīng)過蛋白水解釋放其可溶性形式的RANKL；（3）成骨細(xì)胞表達(dá)和釋放RANKL的誘餌受體骨保護(hù)素（OPG）[22]。破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為成熟的、具有骨吸收活性的破骨細(xì)胞的過程需要RANKL與RANK的結(jié)合并進(jìn)而激發(fā)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號通路，而OPG與RANKL的結(jié)合可以阻止RANKL與RANK的結(jié)合從而抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟[23]。研究發(fā)現(xiàn)，大量的激素和細(xì)胞因子均通過OPG-RANKL-RANK信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其對破骨細(xì)胞分化和活性的生理調(diào)節(jié)作用，如IL-6和TNF-α可通過OPG-RANKL-RANK信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和形成[24]。本研究結(jié)果顯示，廢用模型組促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子RANKL、M-CSF、RANK、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量均顯著大于正常對照組，同時廢用模型組抑制破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子OPG顯著小于正常對照組；運(yùn)動恢復(fù)組促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子RANKL、MCSF、RANK、IL-6和TNF-α基因表達(dá)量均顯著小于正?；謴?fù)組，同時運(yùn)動恢復(fù)組抑制破骨細(xì)胞分化和形成的骨髓細(xì)胞因子OPG顯著大于正?；謴?fù)組。這說明廢用可通過改變骨髓微環(huán)境OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，而運(yùn)動也可以通過調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)而抑制破骨細(xì)胞的分化。

4 結(jié)論

4周的尾部懸吊可導(dǎo)致大鼠廢用性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，跑臺運(yùn)動可以促進(jìn)廢用性骨質(zhì)疏松癥的恢復(fù)，廢用性骨質(zhì)疏松癥及運(yùn)動對廢用性骨質(zhì)疏松癥的恢復(fù)作用與骨髓微環(huán)境破骨細(xì)胞分化OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)。

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Effects of Exercises on Bone Metabolism and OPG-RANKL-RANK System of Osteoclast Differentiation in Rats with Disuse Osteoporosis

Ma Tao，Wang Tong
College of Physical Education，Qilu Normal Univesity，Jinan 250200，China Corresponding Author：Ma Tao，Email：mthdsfdx@126.com

ObjectiveTo explore the effect of treadmill exercises on disuse osteoporosis and the me?dia effect of OPG-RANKL-RANK system of osteoclast differentiation in the process.MethodsForty sixweek-old male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a normal control group，a disuse model group，a normal recovery group and an exercise recovery group，each of 10.The normal control group were sacrificed 4 weeks later without receiving any special treatment.The disuse model group were sac?rificed after 4 weeks of tail suspension.The normal recovery group were sacrificed after 4 weeks of tail suspension and keeping quiet for 4 weeks.The exercise recovery group were sacrificed after 4 weeks of tail suspension and another 4 weeks of treadmill exercises.The indicators of bone mineral density（BMD），bone histomorphometry，bone tissue TRACP-5b staining，bone metabolism and cytokines related to the osteoclast differentiation OPG-RANKL-RANK system were tested immediately after therats were sacrificed.ResultsThe BMD，trabecular bone volume percentage（TBV），trabecular bone width（Tb.Wi），concentration of serum alkaline phosphatase（ALP）and the gene expression of bone marrow oculopneumoplethysmograph（OPG）of the disuse model goup were significantly lower than those of the normal control group（P<0.01），while the trabecular bone spacing（Tb.Sp），average posi?tive staining area percentage（APSAP）of tartrate-resistant acid phosphatase（TRACP）-5b，concentra?tion of serum Ca2+and TRACP-5b and the gene expression of bone marrow cytokines including RANKL，macrophage colony-stimulating factor（M-CSF），RANK，interleukin（IL）-6 and tumor necrosis factor（TNF）-α of the disuse model goup were significantly higher than those of the normal control group（P<0.01）.The BMD，TBV，Tb.Wi，concentration of serum ALP and the gene expression of bone marrow OPG of the exercise recovery group were significantly higher than those of the normal recovery group（P<0.05 or P<0.01）.The Tb.Sp，APSAP，concentration of serum Ca2+and TRACP-5b and the gene expression of RANKL，M-CSF，RANK，IL-6 and TNF-α of the exercise recovery group were signif?icantly lower than those of the normal recovery group（P<0.05 or P<0.01）.ConclusionThe 4-week tail suspension can lead to disuse osteoporosis in rats.Treadmill exercise can promote the recovery of rats with the disuse osteoporosis.The occurrence of disuse osteoporosis and the effect of exercises on disuse osteoporosis were related with the expressing of OPG-RANKL-RANK system-related cytokines of osteoclast differentiation in bone marrow microenvironment.

exercise，disuse osteoporosis，bone Metabolism，osteoclast，OPG-RANKL-RANK system

2016.09.10

國家體育總局全民健身研究領(lǐng)域課題（2015B059）；國家體育總局體育哲學(xué)社會科學(xué)研究項目（2292SS16029）

馬濤，Email：mthdsfdx@126.com