王治平 何榮海 丁文慧 邢 歡 侯福榮 馬海樂

(江蘇大學食品與生物工程學院；江蘇省農產品物理加工重點實驗室；江蘇省食品智能制造工程技術研究中心，鎮(zhèn)江 212013)

葡萄糖接枝改性對米渣分離蛋白乳化性及結構的影響

王治平 何榮海 丁文慧 邢 歡 侯福榮 馬海樂

(江蘇大學食品與生物工程學院；江蘇省農產品物理加工重點實驗室；江蘇省食品智能制造工程技術研究中心，鎮(zhèn)江 212013)

利用濕熱法合成米渣分離蛋白-葡萄糖接枝產物，以研究美拉德反應條件及反應程度對接枝產物乳化性和結構的影響。以溫度、pH值、時間、米渣分離蛋白和葡萄糖質量比為試驗因素，并利用響應面法優(yōu)化試驗。結果顯示，接枝產物乳化性同實驗因素之間不呈線性關系。在溫度79.13 ℃，pH 10.6,時間16 min，質量比1∶1的反應條件下制得的接枝產物乳化性為7 778 m2/g，為米渣分離蛋白的1.46倍。在此條件下蛋白接枝產物表面疏水性降低；紅外光譜結果表明米渣分離蛋白以共價鍵的形式引入糖分子，蛋白接枝產物的α-螺旋結構含量減少，β-折疊和不規(guī)則卷曲結構含量增加。電鏡掃描結果顯示蛋白改性后表面結構分散，聚集體之間的界限分明。

米渣蛋白 糖接枝改性 乳化性

米渣是大米生產淀粉糖或味精后的副產物，蛋白質質量分數(shù)高達60% 以上，原料來源廣、價格低，是一種提取大米蛋白的理想原料。大米蛋白氨基酸組成合理[1]，低抗原性[2]的特點使其深受歡迎。但大米蛋白屬于高疏水性植物蛋白，具有溶解性小，乳化性、起泡性等[3]功能性質弱的特點。

美拉德反應又稱為羰氨反應[4]。其原理是食品中的羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)之間的反應。反應產物蛋白質-糖共價復合物中多糖的引入是對蛋白質的改性和功能性質的強化。此共價復合物可以提高油-水乳化系統(tǒng)中水相的黏度，降低油-水界面張力，因而達到提高蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的作用[5]，在此反應中蛋白質與糖共價結合不需要化學試劑作為催化劑，僅通過加熱可使反應自發(fā)地進行，并且接枝產物是一種相對安全的食品配料，符合現(xiàn)代社會對食品配料的要求。陸鈁[6]、紀崴[7]、華靜嫻[8]等分別用大米蛋白和還原糖進行美拉德反應，結果表明反應后蛋白改性產物的乳化性、乳化穩(wěn)定性、溶解性等功能性質均得到不同程度的改善。不過關于接枝反應條件對大米蛋白改性產物功能性的影響規(guī)律的較深入研究報道還比較少，而了解這一規(guī)律可以為該技術的應用奠定理論基礎，是目前該領域研究的迫切需要解決的問題。

以美拉德反應為手段，以提高米渣分離蛋白乳化性為目的，研究蛋白和糖接枝產物的接枝度和其乳化性的關系，以及糖接枝后米渣蛋白的結構變化，以期在此基礎上揭示不同接枝條件對米渣分離蛋白乳化性影響，為擴大米渣蛋白應用范圍提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 原料

米渣(蛋白質質量分數(shù)為62.32%)：安徽錦泰糖業(yè)有限公司；大豆油：中糧集團。

1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)：Sigma公司；透析袋(阻截分子質量8 000～14 000)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

ATAVAR型傅里葉變換紅外光譜儀：美國Nicolet公司；S-4800電鏡掃描儀：日本電子株式會社；Cary Eclipse熒光分光光度計：美國Varian公司；IKA ULTRA-TURRAX 分散儀：金壇市富華儀器有限公司；微量紫外分光光度計：北京瑞利實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米渣分離蛋白的制備

將一定量的米渣粉碎，過篩后置于磁力攪拌水浴鍋中，在溫度35 ℃，時間2 h，料液比1∶15(m/m)的條件下用濃度為0.03 mol/L的堿液提取米渣分離蛋白。原料液經(jīng)5 000 r/min離心15 min后，取上清液調至等電點pI 4.0，靜置2 h，沉淀用蒸餾水溶解，用NaOH溶液將pH調到7.0，在4 ℃條件下透析24 h，冷凍干燥備用，制得樣品蛋白純度為89%。

1.3.2 米渣分離蛋白-糖共價復合物的制備

將米渣分離蛋白配制成濃度為1.2%(m/V)的溶液，用NaOH溶液調至pH 12，在50 ℃水浴鍋中磁力攪拌1 h使蛋白溶解，冷卻至室溫。按一定質量比加入葡萄糖，磁力攪拌20 min，使蛋白與葡萄糖混合均勻，常溫下調節(jié)pH至恒定值。取蛋白-葡萄糖混合液于具塞試管中水浴加熱。待反應結束后在冰浴中迅速冷卻終止反應。取部分反應溶液用于接枝度分析，褐變分析。其余反應溶液在4 ℃條件下透析24 h。透析液冷凍干燥后備用。

1.3.3 改性產物乳化性測定

乳化性的測定采用濁度法[9]，略有改動。

米渣分離蛋白改性產物溶解于磷酸緩沖液(10 mmol/L, pH 7.0)制成1 mg/mL的蛋白溶液，取15 mL蛋白溶液和5 mL大豆油混合后在10 000 r/min高速分散儀中均質1 min，迅速從試管底部取出50 μL乳液，按1∶100的比例加入0.1 mg/mL SDS溶液中，用分光光度計在500 nm下測定吸光值，得乳化性指標EAI。

(1)

式中：A0為吸光值；DF為稀釋倍數(shù)(100)；C為蛋白質量濃度/g/mL；φ為光程(1 cm)；θ為油相所占的體積(0.25)。

1.3.4 米渣分離蛋白-糖共價復合物接枝度的測定

采用TNBS法[10]，取樣品液1 mL，加入5 mL 0.1% SDS溶液配制成0.2%(m/V)的蛋白溶液，磁力攪拌15 min。取0.4 mL樣品液，依次加入2 mL的磷酸鹽溶液(pH 8.2)和1 mL 0.1% (m/V)TNBS試劑，混合均勻。50 ℃水浴鍋中避光反應1 h后加入2 mL HCL(0.1 mol/L)終止反應。室溫下放置30 min，以蒸餾水代替樣品按上述相同過程處理作為空白調零，在340 nm下測量吸光值。用賴氨酸做標準曲線計算自由氨基的含量。

(2)

式中：C0為未反應時樣品中自由氨基含量/mol/L；Ct為反應th后樣品中自由氨基含量/mol/L。

1.3.5 米渣分離蛋白-糖共價復合物褐變程度的測定

取樣品液1 mL，加入5 mL 0.1% SDS溶液配制成0.2%(m/V)的蛋白溶液，磁力攪拌20 min。以0.1% SDS溶液為對照，于420 nm下測量吸光值。

1.3.6 米渣分離蛋白糖接枝復合物表面疏水性研究

根據(jù)Kato等[11]的方法將米渣分離蛋白和透析后的接枝產物用0.01 mol/L Na2HPO4-NaOH緩沖液稀釋至0.001 25、0.002 5、0.005、0.01、0.02 mg/mL。取20 μL ANS溶液(8 mmol/L)溶于0.0l mol/L磷酸鹽緩沖液)加入4 mL稀釋蛋白溶液后立即搖勻。于激發(fā)波長為390 nm、發(fā)射波長為470 nm檢測熒光強度。激發(fā)和發(fā)射縫寬2.5 nm。用熒光強度對蛋白溶液濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率做蛋白表面疏水性曲線。

1.3.7 米渣分離蛋白糖接枝復合物傅里葉紅外光譜研究

測定條件：KBr于200 ℃烘箱內烘干。樣品充分干燥后，以1∶100～1∶200的比例與KBr混合于研磨中研磨至顆粒大小為2～3 μm后壓片，紅外光譜儀全波段掃描(400～4 000 cm-1)，掃描次數(shù)128次。室溫敞開狀態(tài)下以KBr薄片為背景，相同條件下測量樣品。

譜圖處理：用OMNIC軟件校正水汽和二氧化碳，減差KBr背景譜圖，選擇酰胺Ⅰ帶范圍(1 600～1 700 cm-1)。利用Peakfit 4.12軟件進行兩點基線校正、平滑、Deconvolve Gaussian IRF峰形擬合、二階求導后得到各子峰相對面積，根據(jù)其積分面積累加計算各二級結構相對百分含量。

1.3.8 米渣分離蛋白糖接枝復合物掃描電子顯微鏡研究

樣品冷凍干燥后涂于雙面導電膠上。于原料涂層噴金厚度約10 nm，15 kV電壓下掃描。

1.3.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 米渣分離蛋白葡萄糖接枝改性試驗

分別以反應溫度、時間、蛋白(g) /糖(g)質量比及反應pH值為試驗因素，以糖接枝復合物乳化性為評價指標，優(yōu)化米渣分離蛋白的最佳改性條件。

2.1.1 反應時間對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度與褐變程度的影響

圖1為米渣分離蛋白和葡萄糖混合溶液在pH 10、溫度80 ℃、質量比1∶1條件下反應不同時間后產物乳化性，接枝度和褐變程度的變化。從圖1可以看出，隨反應時間的增加，蛋白-糖復合產物乳化性呈現(xiàn)先增后降的趨勢。在反應15 min時有顯著性變化，復合產物乳化性最好。隨反應時間的增加，增加了葡萄糖與米渣分離蛋白的接觸機會，使復合產物乳化性增加，待反應完全時復合產物乳化性不再增加甚至有所降低。糖接枝復合物的接枝度隨時間的增長呈先增加再保持不變的趨勢。當糖接枝反應進行到20 min時，接枝度為18.67%，基本達到飽和。顏色變化是美拉德反應進入高級階段的重要和極其顯著特征，顏色的變化與食品的種類和反應程度有關。由圖可知隨著反應時間的不斷增加褐變程度也不斷增加。糖接枝復合物的乳化性和接枝度，褐變程度在不同反應時間條件下并非呈正相關的趨勢，原因是隨著反應前期葡萄糖和米渣蛋白反應結合，蛋白表面的羥基增多從而增加產物的親水性，從而增加了蛋白的乳化性。但隨著反應時間的增加，蛋白接枝產物的接枝度升高，葡萄糖通過共價鍵的形式鍵合到蛋白上的數(shù)量越來越多使蛋白更偏于親水，從而使接枝產物的乳化性降低。這種現(xiàn)象在陸鈁[6]的研究中也有體現(xiàn)。

圖1 反應時間對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度及褐變程度的影響

2.1.2 反應溫度對糖接枝米渣分離蛋白乳化性, 接枝度與褐變程度的影響

圖2為米渣分離蛋白和葡萄糖混合溶液在pH 10，質量比1∶1，不同反應溫度條件下反應15 min后產物乳化性，接枝度和褐變程度的變化。從圖2可以看出，隨溫度的升高，復合產物乳化性呈現(xiàn)先增后降的趨勢。在80 ℃和90 ℃改性效果顯著。在溫度為80 ℃時，復合產物乳化性最好。這是由于熱處理使蛋白分子變性展開，使原來隱藏在分子內的疏水基團暴露出來，親油性增強、電荷數(shù)量增加，阻止了油滴的相互靠近，表現(xiàn)為復合產物的乳化性增強。但隨著溫度的升高，過熱處理一方面破壞了蛋白質分子的結構，另一方面蛋白質分子的伸展增加了分子間的相互作用力，使蛋白分子凝聚和沉淀，表現(xiàn)為乳化性降低[13]。接枝復合物的接枝度和褐變程度隨反應溫度的升高有顯著的增加。這是因為堿性環(huán)境、高溫利于糖接枝反應的發(fā)生，同時有利于類黑素的生成。在不同溫度條件下蛋白和糖的復合產物的乳化性和接枝度并非成正相關。隨溫度升高蛋白質分子展開疏水性集團暴露，以及蛋白和糖反應接枝產物表面羥基含量增多，從而增加了蛋白的乳化性。隨著溫度升高，糖接枝產物接枝度升高，復合物表面羥基含量增多，從而使其親水性增加，同時反應溫度升高蛋白分子容易產生聚集等現(xiàn)象降低親油性。從而使蛋白復合產物的乳化性降低。

圖2 反應溫度對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度及褐變程度的影響

2.1.3 葡萄糖添加量對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度與褐變程度的影響

圖3為米渣分離蛋白和葡萄糖混合溶液在pH 10，溫度80 ℃，不同質量比條件下反應15 min后產物乳化性，接枝度和褐變程度的變化。如圖3可知，蛋白(g) /糖(g)的質量比變化對復合產物乳化性的影響不大，在蛋白(g) /糖(g)的質量比為1∶1和2∶1處有較顯著變化，主要是由于葡萄糖分子質量較小，接枝程度高，所以蛋白(g) /糖(g)的質量比對乳化性影響不明顯。蛋白(g) /糖(g)的質量比對糖接枝復合物接枝度的影響基本保持不變，在蛋白(g) /糖(g)質量比為2∶1和4∶1時有較顯著的降低。對復合產物的褐變程度有顯著性影響，隨著蛋白(g) /糖(g)的質量比的增加褐變程度顯著性的增加。隨著蛋白和糖的比例變化，蛋白接枝產物的乳化性和接枝度幾乎都沒有發(fā)生變化。原因是葡萄糖是小分子糖較易和蛋白發(fā)生接枝反應。在較低糖濃度條件下接枝反應已經(jīng)達到飽和。

圖3 蛋白(g)/糖(g)質量比對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度及褐變程度的影響

2.1.4 反應pH對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度與褐變程度的影響

圖4 反應pH對糖接枝米渣分離蛋白乳化性、接枝度及褐變程度的影響

圖4為米渣分離蛋白和葡萄糖混合溶液在溫度80 ℃，質量比1∶1，不同pH值條件下反應15 min后產物乳化性，接枝度和褐變程度的變化。由圖4可知，伴隨pH的升高，復合產物乳化性得到顯著改善，當溶液pH為11時產物的乳化性最大。當pH再增加時，乳化性又降低。主要是由于米渣分離蛋白為堿溶性蛋白，隨著pH值的增加蛋白更好的溶解于溶液中增加了蛋白分子與葡萄糖分子的接觸機會，有利于接枝反應的進行表現(xiàn)在接枝度增加，復合產物的乳化能力增強，但高堿液濃度導致蛋白質的嚴重變性，這也是復合產物乳化性降低的原因。反應產物的接枝度也是隨著pH值的增加有顯著性的升高，當pH為11時接枝度最大，隨著pH值繼續(xù)增加，接枝度下降，高堿濃度會導致蛋白變性，同時發(fā)生蛋白質交聯(lián)反應，使接枝復合物的接枝度降低。但接枝產物的褐變程度隨著pH值的增加不斷升高。原因是高堿濃度有利于糖接枝反應生成褐色色素-類黑精。 糖接枝產物的乳化性和接枝度一樣隨反應溶液的pH增加先升高后降低。原因是隨pH升高蛋白溶解度增加接枝反應加劇，接枝度升高，乳化性加強。但在強堿性條件下蛋白變性嚴重，不利于接枝反應進行，產物的乳化性降低。同時強堿性條件下美拉德反應容易從高級階段開始易產生類黑素等物質，所以強堿性條件下接枝產物的褐變程度較大。

2.2 對米渣分離蛋白糖接枝復合產物結構性質的研究

經(jīng)過接枝反應響應面分析優(yōu)化試驗(限于篇幅，本文中不詳細報告)，得到了反應溫度為79 ℃、體系pH 10.6及時間16 min、蛋白(g) /糖(g)比例為1∶1的最佳反應條件，在此條件下制備米渣分離蛋白接枝產物，測得其乳化性為7 677 m2/g，是米渣分離蛋白乳化性(5 258 m2/g)的1.46倍，并分析接枝產物結構的變化。

2.2.1 米渣分離蛋白糖接枝復合產物表面疏水性研究

米渣分離蛋白的表面疏水性為1 196.3，在溫度79 ℃、pH 10.6、反應時間16 min、蛋白(g) /糖(g)比例為1∶1的條件下制取的糖接枝復合物的表面疏水性為1 064.6。糖接枝反應是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)間的反應，經(jīng)過復雜的反應后蛋白質接上攜帶羰基的糖分子，使蛋白接枝產物表面親水性基團增加，蛋白的表面疏水環(huán)境在相對減少，使其疏水性降低[13]。另外一些親水基團的暴露也會增加蛋白接枝產物的親水性，這也是蛋白接枝產物疏水性降低的原因。

2.2.2 米渣分離蛋白糖接枝復合產物傅里葉紅外光譜研究

如圖5為米渣分離蛋白以及蛋白糖接枝反應產物的傅里葉紅外圖譜。在波長3 700～3 000 cm-1處接枝復合物的峰寬增大，峰的吸收強度增加。表明產物分子中新形成的 C-N 共價鍵伸縮振動吸收強度增大，說明葡萄糖通過共價鍵的形式接入蛋白質分子中，使蛋白分子中羥基數(shù)量增加[14]。1 500～1 350 cm-1波段的吸收峰強度增加，這說明接枝反應能引起 C-H 的變角振動及 C-OH 振動的增加。根據(jù)這兩組峰可以進一步確認接枝物中糖類化合物的存在。表1是對葡萄糖接枝米渣分離蛋白酰胺Ⅰ帶峰形擬合、面積計算后的結果。表1中結果表明，糖接枝復合物的α-螺旋結構數(shù)量減少，β-結構(β-折疊、β-轉角)和無規(guī)卷曲結構數(shù)量呈上升趨勢。說明接枝后米渣分離蛋白的結構由有序變?yōu)闊o序。蛋白質的α-螺旋結構是緊密的無空腔結構，結構過于穩(wěn)定不利于蛋白質的功能性質。β-結構(β-折疊、β-轉角)和無規(guī)卷曲在結構上要比α-螺旋結構差很多。因此，糖接枝改性使α-螺旋結構含量降低，使蛋白的柔韌性增加，乳化性質得到改善[13]。

圖5 糖接枝改性對米渣分離蛋白二級結構的影響

表1 糖接枝改性對米渣分離蛋白二級結構的影響

樣品α-螺旋/%1645～1662/cm-1β-折疊/%1615～1638/cm-1β-轉角/%1662～1682/cm-1不規(guī)則卷曲/%1638～1645/cm-1米渣分離蛋白27.9830.0718.8014.23糖接枝復合物22.6432.0120.1516.02

2.2.3 米渣分離蛋白糖接枝復合產物掃描電子顯微鏡研究

蛋白質的表面結構反應了蛋白分子狀態(tài)，影響著蛋白質的功能性質。由圖6可知，糖接枝改性后復合產物表面結構發(fā)生明顯變化，產物表面較為分散，聚集體之間的界限分明。這可能是由于米渣分離蛋白分子結構上引入了糖分子,使分子擴散伸展減少了分子的聚集[15]。

注：均放大1 000倍。圖6 糖接枝改性對米渣分離蛋白顯微結構的影響

3 結論

研究結果表明反應溫度、pH值、時間以及蛋白和糖的比例對糖接枝復合產物乳化性的影響不是簡單的線性關系。在不同的溫度、時間、pH條件下接枝蛋白的乳化性都是先升高后降低的趨勢，但隨著蛋白和糖的比例變化，蛋白接枝產物的乳化性幾乎沒有發(fā)生變化。米渣分離蛋白在蛋白/糖質量比為1∶1、反應溫度79 ℃、體系pH 10.6及反應時間16 min條件下經(jīng)接枝改性后，表面疏水性由1 196.3降低至1 064.6。通過對接枝前后蛋白樣品酰胺Ⅰ帶峰形擬合、面積計算表明，糖接枝作用使米渣分離蛋白的α-螺旋結構向β-結構(β-折疊、β-轉角)和無規(guī)卷曲結構轉化。蛋白質分子的空間結構由有序變?yōu)闊o序，柔韌性增強，功能性得到改善。復合產物表面結構發(fā)生明顯變化，產物表面較為分散，聚集體之間的界限分明，形成相對均勻的小顆粒物。這可能是由于米渣分離蛋白分子中引入了糖分子，使分子伸展減少了蛋白的聚集。

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Effects of Glycosylation on Emulsification Property and Structure of Rice Residue Protein Isolate

Wang Zhiping He Ronghai Ding Wenhui Xing Huan Hou Furong Ma Haile

(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products of Jiangsu Province Food Intelligent Manufacturing Engineering Technology Research Center of Jiangsu Province, Zhenjiang 212013)

In order to investigate the effect of maillard reaction condition and degree on the emulsifying activity index and structural properties of Rice residue protein isolate (RRPI)-glucose conjugates. The RRPI was glycated with glucose through classical heating in this work. The reaction temperature, pH, time and RRPI/ glucose mass ratio (w/w) were the control conditions of maillard reaction, and the response surface methodology was used to optimize the test. Results indicated that the emulsifying activity index of the grafted products was not a linear relationship with the experimental factors，and the optimal reaction conditions were 79.13 ℃, pH 10.6, 16 min, RRPI/ glucose mass ratio (w/w) 1∶1. Under this reaction conditions the emulsifying activity index of RRPI-glucose conjugates was 7 778 m2/g, 1.46 times of RRPI. The surface hydrophobicity of RRPI-glucose conjugates were less than the RRPI. The result of fourier transform infrared spectroscopy indicated that the RRPI introduced glucose in the form of covalent bonds, and the structural feature analyses suggested that the contents of α-helical structure of RRPI-glucose conjugates reduced, while the contents of β-sheet and random coil structure increased. The scanning electron microscope results suggested that surface structural feature of RRPI-glucose conjugates was more dispersive than RRPI.

rice residue protein, glycosylation, emulsifying activity index

863計劃(2013AA100203)，國家公益性行業(yè)(農業(yè))科技專項(201303071)，江蘇省自然科學基金(BK2012708)，國家星火計劃(2014GA690262)，鎮(zhèn)江市科技支撐(NY2013012)

2015-06-26

王治平，女，1989年出生，碩士，植物蛋白加工技術

何榮海，男，1971年出生，教授，食品蛋白質、多肽加工技術

TS210.9

A

1003-0174(2017)02-0043-06