黃路平，劉 侖，魯黎明，李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 625014)

煙草NtKAT3基因克隆、序列和表達(dá)分析

黃路平，劉 侖，魯黎明，李立芹*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 625014)

鉀離子通道對(duì)植物體具有重要的生理功能，利用同源克隆的策略從煙草品種K326中獲得一個(gè)鉀離子通道基因，該基因全長(zhǎng)1 989 bp，蛋白編碼662個(gè)氨基酸，分子量75.6 ku，等電點(diǎn)7.2。同源性分析結(jié)果顯示，該基因與絨毛煙草鉀離子通道基因KAT3、林煙草鉀離子通道基因KAT3等具有較高的同源性，所以命名為NtKAT3。根據(jù)生物信息學(xué)分析，NtKAT3具有5個(gè)跨膜區(qū)，是一個(gè)疏水蛋白?；虮磉_(dá)分析表明，NtKAT3在根中的表達(dá)量最高，其次是葉、莖和花；煙草幼苗在低鉀處理后NtKAT3的表達(dá)量先升高后降低，NtKAT3的表達(dá)量在12 h時(shí)達(dá)到最高值，在48 h達(dá)到最低值；200 mmol·L-1NaCl處理后，NtKAT3基因表達(dá)量在6 h達(dá)到最低值，24 h達(dá)到最高值，說(shuō)明該基因表達(dá)量受到低鉀和鹽脅迫誘導(dǎo)。

煙草；鉀離子通道；基因克隆

鉀離子是植物細(xì)胞中含量最豐富的陽(yáng)離子之一，對(duì)生物體具有重要的生理生化功能，例如調(diào)節(jié)各種酶的活性和細(xì)胞膨壓，維持細(xì)胞內(nèi)外電荷平衡，參與蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)和植物的光合作用，提高代謝能力，介導(dǎo)氣孔的張開(kāi)和閉合、葉片的運(yùn)動(dòng)[1-5]。1992年Sentenac等[6]從擬南芥中克隆出了K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因AKT1；與此同時(shí)Anderson等[7]也從擬南芥中克隆出了K+通道基因KAT1。到目前為止，已得到克隆的植物K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因有兩大類(lèi)，分別是K+轉(zhuǎn)運(yùn)體基因和K+離子通道基因[8]。K+通道基因主要包括Shake家族和KCO家族，其中Shaker K+通道家族的重要特點(diǎn)之一是能形成異源四聚體結(jié)構(gòu)，可以使植物調(diào)節(jié)不同細(xì)胞中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，這種調(diào)節(jié)在每個(gè)器官或組織中是獨(dú)立的，并與環(huán)境條件相關(guān)[9-10]。Dreyer等[11]在擬南芥中克隆了K+通道基因AKT1，KAT1和AtKAT3(又稱AtkC1)，將K+通道基因不同組合導(dǎo)入非洲爪蟾卵母細(xì)胞檢測(cè)擬南芥中，結(jié)果顯示K+通道基因的不同α亞基是非選擇性的，能產(chǎn)生不同的四聚體通道蛋白。Geoffrey等[12]的研究表明，在擬南芥中KAT3基因表達(dá)的α亞基不能形成四聚體從而導(dǎo)致KAT3基因的沉默，但是可以結(jié)合AKT1基因產(chǎn)生的亞基形成不同的K+通道蛋白，從而調(diào)控K+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)；同時(shí)Dietmar等[13]證明了KAT3在低鉀條件下促進(jìn)擬南芥根的KAT1對(duì)K+的吸收；最新研究表明，KAT3還可與其他家族的基因CIPK2/3協(xié)同調(diào)控AKT1對(duì)K+的吸收[14]。

鉀對(duì)煙草生理生化、品質(zhì)和抗逆性具有重要的作用，是評(píng)判煙葉品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)，缺鉀是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的導(dǎo)致煙草生長(zhǎng)受抑和產(chǎn)量減少的重要原因[15-16]。煙草K+通道基因也有了巨大的發(fā)展，為更好解決煙草缺鉀問(wèn)題提供了可能。郭兆奎等[17]克隆和分析了黃花煙草K+通道NKC1基因，研究表明NKC1與黃花煙草SKT1的同源性最高，NKC1在煙草的幼根、葉片和花朵中均有表達(dá)。曲平治等[18]克隆了普通煙草K+通道基因NKT4，報(bào)道了NKT4主要在煙草主根和側(cè)根中表達(dá)， 其次在煙草葉片中有少量表達(dá)。靳義榮等[19]在林煙草中克隆NKT6基因，NKT6主要在林煙草的莖和腋芽中表達(dá)，定位于細(xì)胞膜和核膜附近的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Reintanz等[20]從擬南芥中克隆出AtKAT3基因，研究結(jié)果表明其主要在根部表達(dá)。

本試驗(yàn)從煙草K326中克隆到一個(gè)Shake鉀離子通道(NtKAT3)的cDNA，并運(yùn)用生物信息手段分析NtKAT3所編碼的蛋白，預(yù)測(cè)NtKAT3編碼的蛋白性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和表達(dá)部位，同時(shí)利用熒光定量PCR分析NtKAT3基因在組織中的特異性，分析NtKAT3基因在低鉀誘導(dǎo)和高鹽脅迫下的表達(dá)情況，旨在為煙草K+吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

本試驗(yàn)選擇的煙草品種為K326，首先選擇籽粒飽滿、大小相同的K326煙草種子，種子經(jīng)過(guò)20%次氯酸鈉溶液消毒30 min后，用無(wú)菌水清洗6～7次，均勻分布到有MS培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，平均每個(gè)培養(yǎng)皿上分布50粒種子為宜，然后放置于25 ℃，16 h/8 h(L/D)的光照培養(yǎng)箱，15 d后即得煙草無(wú)菌苗。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草幼苗，并轉(zhuǎn)移至低鉀和200 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，分別處理0、6、12、24、48 h，并對(duì)煙草幼苗進(jìn)行整株取樣。

其他試劑：大腸埃希菌感受態(tài)和DNA凝膠純化回收試劑盒購(gòu)自天根公司；Trizol試劑、載體PMD19-T、高保真Pfu酶、cDNA 合成試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real time、SYBR Green Master mix等試劑購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 煙草NtKAT3的克隆

根據(jù)GenBank中收錄的普通煙草NtKAT3(登錄號(hào)：XP_016460285)的序列，使用Primer5.0工具設(shè)計(jì)引物NtKAT3F和NtKAT3R(表1)。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：MIX 5 μL，cDNA 1 μL，NtKAT3F和NtKAT3R各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；總延伸8 min。得到的目的片段經(jīng)過(guò)電泳，膠回收純化后與pMD19-T載體16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，隨后均勻地涂抹于含有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，采用菌落PCR選出陽(yáng)性克隆，電泳檢測(cè)后隨機(jī)選取3個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆送生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.2 煙草NtKAT3生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam tool分析NtKAT3編碼蛋白的理化性質(zhì)；采用DNAMAN軟件分析該基因表達(dá)蛋白的疏水性，并利用MAG2.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)分析；利用NCBI在線分析NtKAT3的保守功能域；運(yùn)用在線工具PSORT預(yù)測(cè)NtKAT3的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用IBCP和SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)NtKAT3的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 煙草NtKAT3的表達(dá)分析

根據(jù)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)Real Time PCR的引物，分別是NtKAT3qF和NtKAT3qR(表1)，采用煙草的18S rRNA作為內(nèi)參，對(duì)NtKAT3進(jìn)行表達(dá)差異研究。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。所有的樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后，基因相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

取K326煙草的葉片，用TRIZOL法提取煙草葉片總RNA，然后以總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在2 000 bp左右位置上有清晰條帶(圖1)。將該條帶純化后，16 ℃條件下與pMD19-T載體進(jìn)行連接，運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，最后隨機(jī)挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送生物公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 NtKAT3序列分析

2.2.1 NtKAT3的理化性質(zhì)及疏水性分析

NtKAT3編碼蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為75.6 ku，分子式為C3431H5351N907O969S25，理論等電點(diǎn)pI為7.20，該蛋白的總平均疏水性為-0.083，不穩(wěn)定系數(shù)是36.66，根據(jù)理化性質(zhì)分析結(jié)果，NtKAT3蛋白是一個(gè)穩(wěn)定性蛋白。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名稱Name引物序列PrimersequenceNtKAT3F5′?ATGAATACAGAAACCAGTAA?3′N(xiāo)tKAT3R5′?TTAAAAGGAAAAACAAATGG?3′N(xiāo)tKAT3qF5′?CGGAGGCTTTGGTTATGTGGA?3′N(xiāo)tKAT3qR5′?GGACCAGATGAGAAGGGAACA?3′18SF5′?CCTACGCTCTGTATACATTAGC?3′18SR5′?GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC?3′

M， Marker；1， 目的基因M， Marker；1， Target gene圖1 NtKAT3克隆Fig.1 Cloning of NtKAT3

利用在線ProtSCale(http:/web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行的疏水性分析結(jié)果(圖2)表明，縱坐標(biāo)是氨基酸標(biāo)度值，正值代表疏水，負(fù)值代表親水，橫坐標(biāo)表示氨基酸序列位置，總的平均疏水性為-0.083，推測(cè)NtKAT3蛋白是疏水蛋白。

2.2.2 NtKAT3的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

了解蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)有助于認(rèn)識(shí)蛋白的特性，本研究利用IBCP(http://npsa-pbil.ibcp.fr)的在線工具SOPMA，對(duì)NtKAT3的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，其結(jié)果表明：α-螺旋約占41.09%；無(wú)規(guī)則卷曲約占21.75%；延伸鏈占29.46%；β-轉(zhuǎn)角占7.70%；其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)(圖3-A)。運(yùn)用SWISS-MODEL服務(wù)器對(duì)NtKAT3的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)(圖3-B)。

圖2 NtKAT3疏水區(qū)預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophobic region prediction of NtKAT3

A， 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；B， 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A， Secondary structure prediction; B， Tertiary structure prediction圖3 NtKAT3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The secondary structure and tertiary structure prediction of NtKAT3

2.2.3 NtKAT3蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

NtKAT3編碼蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果表明，該蛋白含有5個(gè)跨膜區(qū) (圖4)?？缒ぢ菪奈恢梅謩e為第46～65氨基酸，第75～96氨基酸，第116～138氨基酸，第185～204氨基酸和第262～284氨基酸。結(jié)果顯示，該蛋白有5個(gè)跨膜區(qū)，推測(cè)該鉀離子通道是一個(gè)膜蛋白。

2.2.4 NtKAT3同源性分析

把NtKAT3的氨基酸序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，按照相似性程度高低選擇較高相似性的20個(gè)基因序列(包括目的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(圖5)表明，NtKAT3與絨毛煙草鉀離子通道KAT3、林煙草鉀離子通道KAT3等具有較高的氨基酸序列同源性(99%、97%)，與野草莓鉀離子通道KAT1的氨基酸序列同源性最低，為59%。

2.2.5 編碼蛋白的功能保守域及亞細(xì)胞定位分析

利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的CDD軟件對(duì)NtKAT3蛋蛋白功能保守域進(jìn)行了分析，結(jié)果表明(圖6)，該蛋白存在離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(Ion_trans)和環(huán)核苷酸結(jié)合域(cNMP)，環(huán)核苷酸結(jié)合域存在于 cAMP 及cGMP 依賴的蛋白激酶及門(mén)控離子通道中。利用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)在線預(yù)測(cè)NtKAT3的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，在質(zhì)膜上的相似度為0.874，在微體中的相似度為0.585，在高爾基體上的相似度為0.3，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(膜)上的相似度為0.2，NtKAT3蛋白與質(zhì)膜相似度最高，推測(cè)該鉀離子通道蛋白可能定位在質(zhì)膜上。

圖4 NtKAT3蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of transmembrane region of NtKAT3 protein

圖5 NtKAT3的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of NtKAT3

2.3NtKAT3的組織表達(dá)分析

以煙草K326的根、莖、葉、花的cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，并分析NtKAT3在各個(gè)部位的表達(dá)量，由圖7可知，NtKAT3的表達(dá)量由高到低依次為根、莖、葉、花，其在根中的表達(dá)量分別是莖、葉、花中表達(dá)量的2.7、60.2、63.4倍，結(jié)果顯示NtKAT3主要在煙草植株的根中表達(dá)，其表達(dá)存在組織特異性，推測(cè)NtKAT3基因調(diào)控?zé)煵莸母颓o的鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖6 NtKAT3功能保守域分析Fig.6 Functional conservative domain analysis of NtKAT3

不同數(shù)據(jù)上沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P≤0.05)，下同The bars with different letters show the significant difference at the level of 0.05. The same as below圖7 NtKAT3在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析Fig.7 Analysis of relative expression of NtKAT3 in different tissues

2.4 低鉀脅迫和鹽脅迫下NtKAT3的表達(dá)分析

本研究采用Real-time PCR對(duì)NtKAT3在低鉀和鹽脅迫處理后的表達(dá)量進(jìn)行了分析。由圖8可知，該基因在低鉀處理1～12 h表達(dá)量上升，12 h時(shí)達(dá)到最大，為對(duì)照(0 h)的2.6倍；隨后表達(dá)量下降，48 h后表達(dá)量為對(duì)照的25%。因此低鉀處理后，NtKAT3的表達(dá)量是先上調(diào)后降低；同時(shí)鹽處理后的NtKAT3表達(dá)量在0～6 h降低，6～24 h升高，24～48 h降低，在24 h時(shí)NtKAT3表達(dá)量達(dá)到最大值，其表達(dá)量是0 h的1.4倍。

圖8 NtKAT3在低鉀和鹽脅迫處理下的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of NtKAT3 under low-K+ and salt stress treatment

3 討論

本研究中，我們首先克隆了煙草K326的NtKAT3基因全長(zhǎng)cDNA的序列，Shaker家族的重要標(biāo)志為氨基酸序列有一個(gè)很保守的TxxTxGYGD序列(簡(jiǎn)稱T盒)[21]，在NtKAT3基因的氨基酸序列第241到249的序列為T(mén)MTTTGYGD，表明NtKAT3基因的氨基酸序列存在一個(gè)T盒。同時(shí)NtKAT3的進(jìn)化樹(shù)數(shù)據(jù)表明，克隆的NtKAT3氨基酸序列和絨毛煙草的KAT3等氨基酸序列具有較高的同源性。另一個(gè)結(jié)果顯示，NtKAT3的亞細(xì)胞預(yù)測(cè)定位中NtKAT3主要定位在質(zhì)膜上。到目前為止，在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)了9個(gè)Shaker家族的成員，都定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，表現(xiàn)出高度的保守性[22]。分析NtKAT3的氨基酸序列，結(jié)果表明普通煙草的NtKAT3基因與同源基因具有相對(duì)一致性，并且利用有效的SWISS-MODEL服務(wù)，成功預(yù)測(cè)了NtKAT3基因的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)圖，為進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)功能打下基礎(chǔ)。然而對(duì)于NtKAT3只有5個(gè)跨膜區(qū)，目前并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

Shaker家族目前被認(rèn)為是植物鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)最為重要的功能蛋白，對(duì)植物保持細(xì)胞內(nèi)部鉀離子的平衡有著至關(guān)重要的作用[23]。Shaker家族分為AKT1，KAT1，AKT2，KC1和SKOR 5個(gè)亞族，KC1(KAT3)亞族主要表達(dá)在根毛和根的內(nèi)皮層細(xì)胞，并且參與調(diào)節(jié)AKT1通道的K離子吸收[20-21]。NtKAT3表達(dá)量最高的在根，其次是莖，這表明該基因主要表達(dá)在根，這與生物信息分析，NtKAT3具有擬南芥KAT3的特點(diǎn)相符合。鹽角草的AKT1基因在缺鉀下處理48 h后表達(dá)量會(huì)升高[24]。水稻OsKAT1.1基因在缺鉀誘導(dǎo)下根部的表達(dá)量在48 h后下降[25]。本研究表明，煙草幼苗在低鉀處理后NtKAT3的表達(dá)量先升高后下降，在12 h后達(dá)到最大值，表明該基因受低鉀誘導(dǎo)其表達(dá)量下降。對(duì)水稻的幼苗進(jìn)行100 mmol·L-1Na+處理，水稻OsKAT2的表達(dá)量在48 h后下降[26]，擬南芥的葉片在100 mmol·L-1Na+處理下KAT1和KAT2的表達(dá)量在48 h后下降[27]。本研究NtKAT3的表達(dá)量是先降低后升高再下降，但是在48 h的表達(dá)量與0 h時(shí)相同，這表明該基因受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。

綜上所述，完成普通煙草NtKAT3的克隆，并對(duì)NtKAT3序列進(jìn)行分析和表達(dá)模式的闡述，為后續(xù)工作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。今后的研究可以對(duì)NtKAT3構(gòu)建過(guò)表達(dá)和RNAi載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究；可以利用酵母雙雜交技術(shù)研究NtKAT3與其他家族基因的相互作用，進(jìn)一步明確NtKAT3在煙草鉀營(yíng)養(yǎng)方面的功能。這為植物鉀營(yíng)養(yǎng)分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Cloning， sequence and expression analysis of a potassium channelNtKAT3 in tobacco

HUANG Luping， LIU Lun， LU Liming， LI Liqin*

(CollegeofAgronomy，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu625014，China)

Potassium channels have important physiological roles in plants. This study obtains a potassium channel gene from the tobacco variety K326 by using homologous cloning strategy. Sequences analysis showed that this gene contains 1 989 bp and encodes a protein consisting of 662 amino acids， the calculated molecular mass was 75.6 ku and the theoretical isoelectric point (pI) was 7.2. Homology analysis suggested that the gene had a high homology with the potassium channelsKAT3 of bothNicotianatomentosiformisandNicotianasylvestris， so it was named asNtKAT3. Protein structure and function analysis showed thatNtKAT3 has 5 transmembrane domains， which was a hydrophobic membrane protein. Expression patterns analysis showed that the highest expression level was observed in the roots， followed by leaves， stems and flowers. Under low potassium condition， the expression level ofNtKAT3 in tobacco seedlings increased firstly and then decreased， the highest expression level ofNtKAT3 appeared at 12 h， and the lowest level appeared at 48 h. Under 200 mmol·L-1NaCl treatment，NtKAT3 reached the lowest expression level at 6 h， while the highest level appeared at 24 h， which indicated that the geneNtKAT3 can be induced by low potassium or salt stress.

tobacco; potassium channel; gene cloning

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.01

2016-12-04

植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLPPBKF1505，SKLPPBKF1506)

黃路平(1993—)，男，重慶云陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事煙草分子生物學(xué)研究。E-mail: 1043737331@qq.com

*通信作者，李立芹，E-mail: liliqin88@qq.com

S572

A

1004-1524(2017)07-1057-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1057-1063

黃路平，劉侖，魯黎明，等. 煙草NtKAT3基因克隆、序列和表達(dá)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(7)： 1057-1063.