李好磊，李葉珍，趙 顧，崔騰飛，徐前明，魏建忠，李 郁，孫 裴

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

豬流行性腹瀉病毒N基因重組真核質(zhì)粒構(gòu)建及其表達(dá)

李好磊，李葉珍，趙 顧，崔騰飛，徐前明，魏建忠，李 郁，孫 裴*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

為探明豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)N基因編碼的蛋白對PEDV感染早期診斷的作用，根據(jù)PEDV CV777株N基因全序列設(shè)計一對特異性引物以擴(kuò)增N基因，定向插入到pPM-C-His真核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPM-C-His-N，將重組質(zhì)粒肌肉注射昆明系小鼠，以檢測其在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平；將pPM-C-His-N轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞，分別在基因水平和蛋白水平對N基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，并采用間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay， IFA)檢測N蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)分布情況。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒在基因水平和蛋白水平均成功表達(dá)，免疫小鼠血清中抗體的效價為1∶51 200，Western-blot結(jié)果顯示，免疫血清能與重組N蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，說明實驗成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPM-C-His-N，且在Vero細(xì)胞內(nèi)檢測到了綠色熒光，為PEDV診斷方法的建立及致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

PEDV；N蛋白；真核質(zhì)粒；表達(dá)質(zhì)粒

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性腸道傳染病，以引起豬的嘔吐、腹瀉、脫水等為主要臨床癥狀，哺乳仔豬、斷奶仔豬和育肥豬感染發(fā)病率100%，成年母豬約為15%，哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，病死率平均50%[1-2]。該病于1971年首次在英國發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)80年代初在我國陸續(xù)發(fā)生，目前PED已成為全世界流行的疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[3-5]。PEDV屬單股正鏈RNA病毒，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是S蛋白(纖突糖蛋白即糖激化纖突蛋白，spike protein)、M蛋白(膜糖蛋白即糖激化囊膜，membrane protein)、E蛋白(小膜蛋白，envelope protein)、N蛋白(核衣殼蛋白，nucleocapsid protein)。S蛋白在病毒感染機(jī)體后，可介導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體；M蛋白和E蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中起到重要作用，其中M蛋白能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α干擾素，可作為PEDV基因工程苗的候選基因；N蛋白在PEDV結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，豬在感染病毒早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體，由于豬群感染PEDV之后血清中產(chǎn)生的抗N蛋白抗體沒有抗S蛋白抗體持久[6]，因此可將N蛋白作為檢測病毒早期感染的標(biāo)志蛋白；同時由于冠狀病毒N蛋白基因保守型強(qiáng)，不易發(fā)生變異[7]，所以利用N蛋白建立PEDV分子生物診斷技術(shù)具有良好的發(fā)展前景。

本研究利用在國內(nèi)較為常見的PEDV CV777株的N基因全序列設(shè)計一對特異性引物，構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pPM-C-His-N，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，利用間接免疫熒光試驗檢測其在細(xì)胞中的表達(dá)；然后將重組質(zhì)粒進(jìn)行動物體免疫試驗，采集血清用間接ELISA法評估其效價，并用Western-blot檢驗其反應(yīng)原性，以期為PEDV特異性早期診斷技術(shù)的建立及后續(xù)利用N蛋白研究致病機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

Vero細(xì)胞與PEDV陽性病料由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室保存；真核表達(dá)載體pPM-C-His由ABM公司合成。

1.1.2 主要試劑與實驗動物

DMEM高糖培養(yǎng)基、四季青胎牛血清為Sigma公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶(NheⅠ、XhoⅠ)和T4DNA連接酶購自Invitrogen(上海)貿(mào)易有限公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶均購自天根生化科技(北京)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自全式金生物科技(北京)有限公司；山羊抗鼠FITC-IgG以及山羊抗鼠HRP-IgG酶標(biāo)二抗購自博士德(武漢)生物工程有限公司；雌性昆明系小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 PEDV N基因的擴(kuò)增

取PEDV陽性豬包含腸內(nèi)容物的部分小腸加入少量研磨液充分研磨，-20 ℃反復(fù)凍融之后離心取上清，按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，然后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA保存在-20 ℃，作為PCR擴(kuò)增的模板。

利用軟件對PEDV N基因序列全長(Accession No. DQ355221.1)進(jìn)行分析，設(shè)計一對含NheI、XhoI酶切位點的特異性引物，上游5’-CTAGCTAGCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGG-3’(NheⅠ)；下游5’-CCGCTCGAGCCTGTATCGAAGATCTCGTTG-3’(XhoⅠ)，目的片段大小為1 326 bp，以25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50.3 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPM-C-His-N的構(gòu)建

N基因PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收純化后，用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，并與經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的pPM-C-His載體連接，獲得重組pPM-C-His-N質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌 DH5α，轉(zhuǎn)化液涂布于含30 μg·mL-1卡那霉素(Kanamycin)的LB固體板，37 ℃培養(yǎng)過夜，選取卡那霉素陽性的克隆進(jìn)行菌落 PCR，選取陽性克隆過夜搖菌，抽提重組質(zhì)粒，分別對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.3 重組真核質(zhì)粒在昆明系小鼠體內(nèi)的表達(dá)

將構(gòu)建好的重組真核質(zhì)粒pPM-C-His-N在含Kana的LB液體培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增，按無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書大量提取真核質(zhì)粒，用核酸蛋白測定儀測定質(zhì)粒的純度與濃度，以100 μg每只肌肉注射體重相當(dāng)?shù)拇菩岳ッ飨敌∈骩8]。

將45只雌性小鼠平均分成3組，每組15只，分別設(shè)置空載體pPM-C-His組、重組質(zhì)粒pPM-C-His-N組、生理鹽水對照組，每只小鼠肌肉注射0.5 mL，在初次免疫前使用眼球采血法采集陰性血清。一免后14 d采用同樣方法制備待檢血清，分別在一免過后14、21 d各加強(qiáng)免疫一次，采集血清，-20 ℃保存，分別測定各組三次免疫血清中的抗體效價。

1.2.4 抗體效價測定

采用間接ELISA法測定免疫血清中抗體效價。實驗中設(shè)置重組N蛋白(rN)包被濃度為30 μg·mL-1、待檢免疫血清從1∶25倍比稀釋至1∶25×220、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(二抗)的稀釋度為1∶2 500，鄰苯二胺(OPD)底物液避光顯色后，測定D492nm值，以待檢血清孔的D492nm值/陰性血清孔的D492nm值≥2.1判為陽性。

1.2.5 真核表達(dá)質(zhì)粒在Vero細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

RNA水平的檢測：按TransIntro EL Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書鋪板，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，同時設(shè)置陰性對照和空白對照。轉(zhuǎn)染24 h之后利用細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，核酸蛋白測定儀測定總RNA的濃度與純度，然后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件同1.2.2節(jié)檢測重組質(zhì)粒在基因水平的表達(dá)。

蛋白質(zhì)水平的檢測：按RNA水平檢測中所述方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、60 h收集細(xì)胞，按細(xì)胞中總蛋白提取試劑盒說明書分別提取各時間點細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE檢測重組N蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

1.2.6 間接免疫熒光(IFA)試驗

用PBS將已轉(zhuǎn)染48 h的單層Vero細(xì)胞洗2次，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的正常Vero細(xì)胞作為空白對照，-20 ℃預(yù)冷的甲醇室溫固定10 min，PBS洗3次，每次5 min，吸干；加入倍比稀釋的鼠抗PEDV抗體，以覆蓋培養(yǎng)孔表面為宜，放入濕盒中37℃作用60 min，洗滌同上；再加入按1∶32、1∶48、1∶64倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔30 μL，37 ℃作用60 min，洗滌同上；熒光倒置顯微鏡下觀察，空白對照無熒光，而實驗組出現(xiàn)綠色熒光者為陽性。

1.2.7 重組N蛋白的Western blot分析

重組N蛋白經(jīng)12%的 SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，PBST洗膜3次，加入1∶100稀釋的純化后的鼠抗N蛋白抗體，室溫孵育1 h，PBST洗膜5次，每次10 min；加入1∶3 000稀釋的HRP羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，洗滌同上，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，分析重組N蛋白的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV-N基因片段的PCR擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 326 bp處有一條帶，與預(yù)期片段大小相符，如圖1所示。

2.2 重組真核質(zhì)粒pPM-C-His-N的雙酶切與測序鑒定

M, DL2000 DNA Marker; 1, 陰性對照; 2, PEDV N基因M, DL2000 DNA Marker; 1, Negative control; 2, N gene of PEDV圖1 PEDV-N基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PEDV-N gene amplified by RT-PCR

利用NheⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切之后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證，環(huán)形的載體被切成線型，出現(xiàn)1 326 bp大小的目的條帶，說明酶切成功，通過測序驗證序列符合率100%，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，酶切結(jié)果如圖2所示。

2.3 重組真核質(zhì)粒在Vero細(xì)胞中的表達(dá)與檢測

利用RT-PCR檢測重組質(zhì)粒在基因水平的表達(dá)結(jié)果如圖3所示，實驗組在1 326 bp處出現(xiàn)目的條帶，而空載體組和陰性對照組均未出現(xiàn)目的條帶，說明重組質(zhì)粒在基因水平成功表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24、48及60 h時，SDS-PAGE結(jié)果顯示在50 ku左右處均出現(xiàn)了目的蛋白條帶，而空載體未出現(xiàn)，表明重組蛋白水平獲得成功表達(dá)，如圖4所示。

2.4 IFA試驗結(jié)果

經(jīng)過試驗確定山羊抗鼠FITC-IgG在1∶48稀釋時效果最佳，實驗組細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，而空載體組和陰性對照組細(xì)胞未出現(xiàn)綠色熒光，證明重組質(zhì)粒在細(xì)胞中成功表達(dá)，如圖5所示。

2.5 重組N蛋白抗體效價測定與Western blot分析

如表1所示，一免后14 d可從小鼠免疫血清中檢測出抗體，隨著免疫次數(shù)的增加，抗體水平不斷提高，28 d時效價高達(dá)1∶51 200，說明該重組質(zhì)粒有良好的免疫原性。Western-blot分析結(jié)果顯示，重組N蛋白與鼠抗N蛋白抗體發(fā)生了特異性結(jié)合反應(yīng)，在約50 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶，而作為對照的His標(biāo)簽蛋白不能與鼠抗N蛋白抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)(圖6)，說明重組N蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M, DL5000 DNA Marker; 1, pPM-C-His空載體; 2, pPM-C-His-N重組真核質(zhì)粒M, DL5000 DNA Marker; 1, pPM-C-His empty vector; 2, pPM-C-His-N recombinant eukaryotic plasmids圖2 重組真核質(zhì)粒pPM-C-His-N雙酶切結(jié)果Fig.2 Result of restriction enzyme of recombinant eukaryotic plasmids of pPM-C-His-N

M, DL2000 DNA Marker；1, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞組；2, 空載體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞組；3, 陰性對照組M, DL2000 DNA Marker; 1, Recombinant plasmid transfection Vero cell group；2, Empty vector transfection Vero cell group； 3, Negative control圖3 重組真核質(zhì)粒在Vero細(xì)胞中的基因表達(dá)結(jié)果Fig.3 Results of recombinant eukaryotic plasmid gene expression in Vero cells

M, 預(yù)染蛋白Marker；1, 24 h蛋白表達(dá)量；2, 48 h蛋白表達(dá)量；3, 60 h蛋白表達(dá)量；4, pPM-C-His空載體M, Pre dyed protein Marker; 1, 24 h protein expression; 2, 48 h protein expression; 3, 60 h protein expression; 4, pPM-C-His empty vector圖4 不同時間重組N蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of recombinant N protein in different times

A, 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pPM-C-His-N的Vero細(xì)胞；B, 轉(zhuǎn)染空載體pPM-C-His的Vero細(xì)胞； C, 陰性對照A1, Vero cells of transfection recombinant plasmid; B, Vero cells of transfection empty vector; C, Negative control圖5 IFA檢測重組N蛋白在Vero細(xì)胞中的表達(dá)(400×)Fig.5 IFA detecting recombinant N protein expression in Vero cell(400×)

表1 重組質(zhì)粒免疫小鼠不同時間后血清中特異性抗體效價

Table 1 The specific antibody titer in mouse serum detected by ELISA after immunization

組別Group免疫后不同時間小鼠血清抗體效價Theantibodytiterafterimmunizationdifferenttimeinmouseserum一免后第14天14daysafterfirstimmunization二免后第7天7daysaftersecondimmunization三免后第7天7daysafterthirdimmunization重組質(zhì)粒組Recombinantplasmidgroup1∶8001∶64001∶51200空質(zhì)粒組Emptyplasmidgroup———生理鹽水組Physiologicalsalinegroup———

M, 預(yù)染蛋白Marker；1, rN純化蛋白；2, His標(biāo)簽蛋白M, Dye molecular weight protein standard； 1, rN purified protein； 2, His-tag protein圖6 重組N蛋白的Western blot分析Fig.6 Recombinant N protein of Western blot analysis

3 討論

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，其基因組是具有感染性且不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長約28 kb，CV777為中國主要感染株型[9]。PEDV主要編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白，對PEDV全基因序列分析發(fā)現(xiàn)其中的N基因編碼的蛋白是由441個氨基酸組成的磷酸化核衣殼蛋白，是主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在PEDV中所占比例最大，和病毒基因組RNA纏繞形成病毒核衣殼[10-12]，N蛋白基因含有6～7個潛在磷酸化的位點，在低滲、pH 9.0的非離子溶劑中，溶解度最大，這種特性對于病毒增殖、感染宿主具有重要作用[13-14]，主要體現(xiàn)在：1)能和病毒多聚酶以及細(xì)胞因子作用，改變宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，還能和磷脂與細(xì)胞膜作用，促使病毒RNA的復(fù)制與病毒組裝，從而促進(jìn)病毒增殖；2)能參與細(xì)胞通信，并干擾宿主細(xì)胞周期，抑制干擾素產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。劉隨新等[15]通過對N基因在細(xì)胞內(nèi)定位規(guī)律的研究推測PEDV主要定植在細(xì)胞核仁中與細(xì)胞相互作用從而影響細(xì)胞周期，使機(jī)體持續(xù)感染；張博等[16]構(gòu)建部分N基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，并在此基礎(chǔ)上建立了間接ELISA用于檢測PEDV病原，但由于是部分N基因片段，因此方法并不是很靈敏。劉蘇君等[17]利用PEDV N基因原核表達(dá)的融合蛋白GST-N 為免疫原免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤細(xì)胞篩選，獲得了3株穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的 Mab，為建立診斷方法提供物質(zhì)材料。鑒于冠狀病毒N蛋白基因保守性極強(qiáng)，且能引起機(jī)體的早期免疫，因此可作為PEDV感染早期診斷的目標(biāo)蛋白。

N基因真核質(zhì)粒構(gòu)建的報道較少，而原核表達(dá)較多，同時由于真核表達(dá)較原核表達(dá)簡單，在免疫動物時直接使用質(zhì)粒肌肉注射制得抗體，省去了蛋白表達(dá)與純化的過程，且在免疫動物時不必使用免疫佐劑，減少了佐劑對動物體的應(yīng)激與傷害，提高了免疫效率[18-19]。本試驗通過成功構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒獲得了抗原與抗體，試驗證明得到的抗原抗體能夠發(fā)生特異性反應(yīng)；該真核載體為ABM公司改良載體，含有強(qiáng)CMV啟動子，可以高效表達(dá)目的基因，且可以通過制得的抗原或者抗體對PEDV免疫抗體水平或者病原進(jìn)行檢測，為PEDV的診斷與防治以及致病機(jī)制的研究提供新思路。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Recombinant eukaryotic plasmid construction of porcine epidemic diarrhea virus of N gene and its expression

LI Haolei， LI Yezhen， ZHAO Gu， CUI Tengfei， XU Qianming， WEI Jianzhong， LI Yu， SUN Pei*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

In order to investigate the effect of porcine epidemic diarrhea virusNgenes encoding proteins in the PEDV infection early diagnosis， a pair of specific primers was designed to amplify N gene according to the full-length genome sequence of N gene of the PEDV CV777 strain in this experiment， then N gene was cloned into the eukaryotic expression vector pPM-C-His to construct a recombinant plasmid named pPM-C-His-N， the recombinant plasmid was extracted and the intramuscular injection for Kunming mice was carried out to detect the expression level in mice. At the same time， the plasmid was transfected into Vero cells， and PEDV N expression at gene level and protein level was detected， then N protein distribution in cells was detectedinvitroby indirect immunofluorescence assay (IFA). The results showed that the recombinant eukaryotic plasmid expressed successfully at gene level and protein level， the serum antibody titer in immunized mice was 1∶51 200. Western blot results showed that the immune serum can react with recombinant N protein particularity. The study constructed recombinant eukaryotic expression plasmid of pPM-C-His-Nsuccessfully， and detected green fluorescence in Vero cells， which laid the foundation for establishment of diagnostic method of PEDV and research for pathogenic mechanism.

PEDV; N protein; prokaryotic plasmid; expression plasmid

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.07

2017-03-07

安徽省自然科學(xué)基金(1708085MC83)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(CARS-36-生豬)；安徽省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金資助項目

李好磊(1990—)，男，河南周口人，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail: 964505723@qq.com

*通信作者，孫裴，E-mail: sunpei1979@126.com

S858.28

A

1004-1524(2017)07-1103-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1103-1109

李好磊，李葉珍，趙顧，等. 豬流行性腹瀉病毒N基因重組真核質(zhì)粒構(gòu)建及其表達(dá)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(7)： 1103-1109.