呂夢娜，龍航宇，王麗梅，唐 陶，陳冰冰，林瑞慶

(華南農業(yè)大學 獸醫(yī)學院/廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州510642)

A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51的原核表達及活性檢測

呂夢娜，龍航宇，王麗梅，唐 陶，陳冰冰，林瑞慶

(華南農業(yè)大學 獸醫(yī)學院/廣東省動物源性人獸共患病預防與控制重點實驗室，廣東 廣州510642)

【目的】原核表達A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51并研究其對A型產氣莢膜梭菌Clostridium perfringens的體外抗菌活性。 【方法】合成噬菌體裂解酶Cp51基因，并構建了pET-32a-Cp51原核表達載體，轉化到大腸埃希菌Escherichia coli BL21(DE3)，經終濃度為0.5 mmol·L–1的IPTG誘導以及鎳柱純化后，獲得了可溶性的Cp51重組蛋白；用比濁法檢測Cp51重組蛋白的殺菌活性。 【結果】噬菌體裂解酶Cp51重組蛋白能夠有效降低7株A型產氣莢膜梭菌的濁度，裂解酶質量濃度在5 μg·mL–1以上、作用30 min對A型產氣莢膜梭菌的殺菌率可達到99.99%以上，而對其他種類細菌無殺菌效果。 【結論】A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51重組蛋白對

A型產氣莢膜梭菌有較強的體外殺菌活性和特異性，研究結果為后續(xù)裂解酶Cp51的臨床應用奠定基礎。

產氣莢膜梭菌；噬菌體；裂解酶；蛋白表達；殺菌活性

產氣莢膜梭菌Clostridium perfringens又名魏氏梭菌C. welchii，是一種重要的人畜共患病原菌[1]。產氣莢膜梭菌為兩端鈍圓厭氧性菌，呈粗桿狀，單個或成對存在，是一種能產芽孢的革蘭陽性菌，在人和動物的腸道內普遍存在，也廣泛分布于污水、土壤等自然環(huán)境中。根據產氣莢膜梭菌產生的4種主要外毒素，可將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E 型，其中A型產氣莢膜梭菌是引發(fā)人類氣性壞疽及家禽壞死性腸炎的主要病原[2]。目前家禽壞死性腸炎的預防和治療仍以抗生素為主，但由于抗生素的長期和不規(guī)范使用引起細菌耐藥性及藥物殘留等問題廣泛出現，不僅使家禽的生產性能大大降低，而且通過雞等肉制品威脅人類健康[3-4]。人類已進入了“后抗生素”時代，細菌耐藥性等問題已經成為現代醫(yī)學以及畜牧生產的難題[5-6]。作為預防和治療細菌疾病的一種古老的方法，噬菌體防控在這種情況下又回到了歷史舞臺。噬菌體在抗生素興起之前就已經被發(fā)現和使用，噬菌體能特異性地裂解宿主細菌，其編碼的裂解酶是在基因組復制后期合成的一種酶，作用于細菌細胞壁肽聚糖上的酰胺鍵，使細菌破碎，釋放出子代噬菌體[7]。細菌對噬菌體裂解酶不易產生耐藥性，而噬菌體裂解酶的結合結構域能識別宿主細胞壁受體分子，從而從體外特異性識別細菌并將其溶解，而不需噬菌體侵染細菌時的吸附、自我復制、繁殖等系列過程，因此，噬菌體裂解酶的裂解譜比噬菌體的裂解譜寬。噬菌體裂解酶作為一種潛在的抗菌制劑具有高效、特異性強等優(yōu)點[8-9]。目前國內已有許多學者利用相應的噬菌體裂解酶作用于葡萄球菌、鏈球菌等細菌均得到了較好的抗菌效果[10-13]。產氣莢膜梭菌病的防控及噬菌體研究在國外受到重視[14]，但國內目前針對產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶的相關研究鮮見報道。

本試驗原核表達了 A 型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶 Cp51，并初步研究了 A 型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶 Cp51 重組蛋白對 A 型產氣莢膜梭菌的體外裂解活性，以期為進一步研究治療壞死性腸炎的新型藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和質粒 7株A型產氣莢膜梭菌、2株金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus、2株豬鏈球菌Streptococcus suis、1株腸炎沙門氏菌Salmonella enteritidis、1株大腸埃希菌Escherichia coli和1株腐敗梭菌Clostridium septicum及表達載體pET-32a(+)為華南農業(yè)大學寄生蟲實驗室保存；感受態(tài)細胞DH 5α、BL 21(DE3)均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 工具酶及主要試劑 BamH I內切酶、HindⅢ內切酶、DNA Marker DL 2000、DL 15000、凝膠回收試劑盒均購自日本TaKaRa公司。Page Ruler Prestained Protein Ladder 10～170 kU購自Thermo公司。質粒抽提試劑盒購自天根生化科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒、純化填料、HRP羊抗鼠IgG、EasySee Western-blot Kit購自北京全式金生物技術有限公司。LB肉湯、TSC培養(yǎng)基、咪唑購自廣州鼎國生物技術有限公司。其余常用試劑為國產或進口分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51基因的克隆及表達載體的構建 通過GeneBank獲得A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51蛋白序列(AGH27916.1)，根據Cp51蛋白的氨基酸序列人工合成相應的Cp51基因序列，在5′端引入BamH I位點，3′端引入Hind Ⅲ位點，并在不改變氨基酸的情況下對Cp51基因序列中810位堿基由A突變?yōu)镚，人工合成由深圳華大科技有限公司完成。合成的基因克隆于pMD-18T載體上，轉化至DH5α感受態(tài)大腸埃希菌中，挑取陽性克隆，進行PCR、酶切、測序驗證。重組質粒pMD-18T-Cp51經BamH I和HindⅢ雙酶切，切膠回收Cp51基因目的片段，克隆到表達載體pET-32a(+)上，構建重組表達載體pET-32a-Cp51，陽性克隆送到深圳華大科技有限公司測序。

1.2.2 重組蛋白pET-32a-Cp51的表達和純化 將測序正確的表達質粒轉化到BL 21(DE3)感受態(tài)細胞內，挑取單克隆接種到5 mL含有100 μg·mL–1的Amp+LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下150 r·min–1培養(yǎng)過夜，按1︰100的比例擴大培養(yǎng)，37 ℃條件下180 r·min–1震蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4～0.6，加入IPTG使終濃度為0.5 mmol·L–1，37 ℃條件下180 r·min–1誘導3 h。8 000 r·min–1離心10 min，收集菌體，菌體重懸于平衡緩沖液中(10 mmol·L–1咪唑)，功率200 W，超聲3 s，間隔5 s，超聲120次。分別取上清和沉淀，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液10 μL，煮沸5 min，10 000 r·min–1離心10 min，進行SDSPAG 電泳，檢測重組蛋白是存在于上清液中還是存在于包涵體中。

采用全式金生物技術有限公司的Ni2+–NTA蛋白質純化柱純化目的蛋白, 選擇不同濃度的咪唑(20～200 mmol·L–1)梯度洗脫，純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，測定純化效率，確定洗脫液的最佳咪唑濃度，并用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.3 重組蛋白pET-32a-Cp51 的 Western blot檢測 分別取150 mmol·L–1咪唑洗脫液40 μL，pET-32a-Cp51未誘導樣品和pET-32a(+)誘導菌處理后加 5×SDS-PAGE上樣緩沖液10 μL，進行SDSPAGE電泳。電泳結束后將膠切成合適大小。安裝好轉膜裝備，放入轉膜槽，接通電源，電流150 mA，轉膜2 h，質量分數5%脫脂奶粉封閉1 h，小鼠抗His抗體用質量分數為5% 的脫脂奶粉稀釋為體積比1︰2 000，室溫條件下孵育2 h，羊抗小鼠HRPIgG用質量分數為5% 的脫脂奶粉稀釋為體積比1︰2 000，室溫條件下搖床孵育1～2 h。TBST洗膜3次，將ECL的2種發(fā)光液按照體積比1︰1的比例混合，發(fā)光顯色，拍照保存。

1.2.4 重組蛋白pET-32a-Cp51活性檢測及裂解譜的測定 將過夜培養(yǎng)的A型產氣莢膜梭菌以10 000 r·min–1離心1 min，PBS清洗后，細菌重懸于4 mL的 PBS 中，加入1 mL蛋白純化液，使得最終的反應體系為5 mL，蛋白的終質量濃度分別為 20、10、5和 1 μg·mL–1，同時A型產氣莢膜梭菌最終的D600nm約為0.6，細菌數約為108cfu·mL–1，設置pET-32a空載組和PBS組作為對照組，37 ℃條件下180 r·min–1震蕩培養(yǎng)，分別在0、5、10、15、20 和30 min時測量D600nm，取3次重復數據的平均值。并將作用30 min的最終反應液取100 μL涂布于TSC平板，40 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h。

用終質量濃度為10 μg·mL–1重組蛋白pET-32a-Cp51分別作用于本試驗分離和保存的7株A型產氣莢膜梭菌、2株葡萄球菌、2株鏈球菌、1株沙門氏菌、1株大腸埃希菌和1株腐敗梭菌，測定其在作用0、5、10、15、20和30 min時的D600nm。

2 結果與分析

2.1 Cp51基因原核表達載體的構建與鑒定

將陽性重組表達載體pET-32a-Cp51經BamH I和Hind Ⅲ雙酶切后，得到2條片段，一條為載體條帶，另一條約為1 150 bp的目的基因條帶(圖1)，測序結果表明重組表達質粒構建正確。

2.2 pET-32a-Cp51誘導表達及純化

將重組的質粒pET-32a-Cp51轉化至BL 21(DE3)后，經IPTG誘導表達，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，結果顯示上清和沉淀中均在相對分子質量約為63 000處有明顯蛋白條帶(圖2)。故選擇從上清中純化目的蛋白，用不同濃度的咪唑溶液洗脫收集，SDS-PAGE檢測顯示用150和200 mmol·L–1咪唑洗脫時，在相對分子質量63 000處可獲得較多的重組蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質量濃度分別是555和450 μg·mL–1(圖3)。

圖1 重組質粒pET-32a-Cp51酶切鑒定Fig. 1 Identification of recombinant plasmid pET-32a-Cp51 by enzyme digestion

圖2 pET-32a-CP51表達SDS-PAGE電泳Fig. 2 SDS-PAGE pattern of expressed pET-32a-CP51 protein

圖3 pET-32a-Cp51蛋白純化的SDS-PAGE電泳Fig. 3 SDS-PAGE pattern of purified pET-32a-Cp51 protein

2.3 pET-32a-Cp51的Western blot檢測結果

pET-32a-Cp51純化產物和pET-32a空載體表達產物經SDS-PAGE電泳后的蛋白條帶轉移到硝酸纖維素膜上進行免疫印跡，結果純化的重組目的蛋白和空載體表達產物均可與小鼠抗His抗體發(fā)生反應，純化的重組目的蛋白約在相對分子質量63 000的位置出現特異性反應條帶，pET-32a空載體表達產物約在相對分子質量20 000的位置出現特異性反應條帶(圖4)。

圖4 pET-32a-Cp51蛋白的Western blot檢測結果Fig. 4 Western blot results of pET-32a-Cp51 protein

2.4 pET-32a-Cp51活性及裂解譜檢測結果

采用比濁法，測定pET-32a-Cp51的抗菌活性。結果(圖5)顯示，與pET-32a(+)和PBS對比，30 min內終質量濃度為20、10和5 μg·mL–1的pET-32a-Cp51噬菌體裂解酶稀釋液能將A型產氣莢膜梭菌的濁度從0.6降至0.1，而終質量濃度1 μg·mL–1的pET-32a-Cp51噬菌體裂解酶稀釋液能將A型產氣莢膜梭菌的濁度從0.6降至0.33。說明pET-32a-Cp51 作用于相近起始D600nm的A型產氣莢膜梭菌液時，隨著酶液作用濃度的增加，D600nm下降速度加快。平板涂布樣品經40 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察，根據平板菌落計數結果，發(fā)現終質量濃度為20、10和5 μg·mL–1酶液作用于菌液30 min后，可使A型產氣莢膜梭菌裂解率達99.99%、99.99%和 100%，酶液終質量濃度為1 μg·mL–1樣品的裂解率可達99.91%，表明pET-32a-Cp51對A型產氣莢膜梭菌具有高效裂解活性，終質量濃度5 μg·mL–1以上有較強殺菌效果。利用相同方法作用于A型產氣莢膜梭菌不同分離株發(fā)現pET-32a-Cp51均有良好裂解活性(圖6)。而作用于葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏菌、大腸埃希菌和腐敗梭菌則無裂解作用(圖7)。

圖5 不同質量濃度pET-32a-Cp51裂解酶對A型產氣莢膜梭菌的活性Fig. 5 Activity of different concentrations of pET-32a-Cp51 lysin against type A Clostridium perfringens

圖6 pET-32a-Cp51裂解酶對A型產氣莢膜梭菌不同分離株的活性Fig. 6 Activity of pET-32a-Cp51 lysin against different isolates of type A Clostridium perfringens

3 討論與結論

自人類使用抗生素以來，各種抗生素的濫用、亂用現象層出不窮，因此導致了大量的細菌耐藥和抗生素殘留等問題。由于抗生素的使用不當帶來的耐藥菌株甚至成為超級耐藥菌株，不僅提高了畜禽的死亡率，而且增大了預防和治療的投入，給養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的損失[15]。隨著產氣莢膜梭菌耐藥性加劇，開發(fā)新型抗菌藥物治療壞死性腸炎迫在眉睫[16]。裂解酶是噬菌體在裂解末期表達的一種能降解肽聚糖的酶，在革蘭陽性菌上作用明顯[17]，還具有高效、特異性強、不易產生抗性等優(yōu)勢，作為新興的抗菌劑具有較高的應用價值。本研究成功構建A型產氣莢膜梭菌的噬菌體裂解酶Cp51 基因的重組表達載體pET-32a-Cp51，經IPTG 誘導表達，并進行蛋白純化。比濁法測定結果顯示A型產氣莢膜梭菌的噬菌體裂解酶pET-32a-Cp51 對A型產氣莢膜梭菌殺菌活性效果明顯，終質量濃度5 μg·mL–1以上、作用0.5 h后的殺菌率高達99.99%，殺菌效果與Gervasi 等[17]的裂解酶試驗結果相似，且能以較低的蛋白濃度達到較強的殺菌效果，此外，本試驗進行了噬菌體裂解酶pET-32a-Cp51 對多種常見細菌的裂解譜試驗，結果表明pET-32a-Cp51 具有較強特異性，只裂解A型產氣莢膜梭菌，對其他種類細菌無作用。

近幾年，人們應用噬菌體及其裂解酶進行了一系列的試驗，顯示其具有高效殺菌、不易產生耐藥性和特異性強等優(yōu)點，在治療細菌感染病方面具有潛在應用價值[18-20]。綜上所述，A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51原核表達純化后，其蛋白純度較高，體外裂解試驗表明對A型產氣莢膜梭菌具有明顯殺滅效果，為研究其替代抗生素作為新型抗菌藥物奠定了基礎。

[1]GARCIA J P, BEINGESSER J, FISHER D J, et al. The effect of Clostridium perfringens type C strain CN3685 and its isogenic beta toxin null mutant in goats[J]. Vet Microbiol, 2012, 157(3/4): 412-419.

[2]LOVLAND A, KALDHUSDAL M. Severely impaired production performance in broiler flocks with high incidence of Clostridium perfringens-associated hepatitis[J]. Avian Pathology, 2001, 30(1): 73-81.

[3]汪復, 朱德妹, 胡付品, 等. 2012年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志, 2013, 13(5): 321-330.

[4]FILE T M, Jr, SRINIVASAN A, BARTLETT J G. Antimicrobial stewardship: Importance for patient and public health[J]. Clin Infect Dis, 2014, 59(S3): S93-S96.

[5]FISCHETTI V A. Bacteriophage endolysins: A novel anti-infective to control gram-positive pathogens[J]. Int J Med Microbiol, 2010, 300(6): 357-362.

[6]SCHRAG S J, MCGEE L, WHITNEY C G, et al. Emergence of Streptococcus pneumoniae with veryhigh-level resistance to penicillin[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(8): 3016-3023.

[7]SCHUCH R, PELZEK A J, RAZ A, et al. Use of a bacteriophage lysin to identify a novel target for antimicrobial development[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e60754.

[8]SCHUCH R, NELSON D, FISCHETTI V A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis[J]. Nature, 2002, 418(6900): 884-889.

[9]LOESSNER M J. Bacteriophage endolysins: Current state of research and applications[J]. Curr Opin Microbiol, 2005, 8(4): 480-487.

[10]李躍, 宮鵬娟, 夏斐斐, 等. 金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK的表達及其多克隆抗體的制備[J] .中國獸醫(yī)學報, 2014, 34(1): 45-49.

[11]王彬 金.黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15外用制劑的初步研制[D]. 長春: 吉林大學, 2015.

[12]陳蔚青, 王曉楓, 王普, 等. 鏈球菌噬菌體裂解酶在大腸桿菌中的表達、純化及活性檢測[J]. 生物工程學報, 2009(8): 1267-1272.

[13]吳蒙, 陸海榮, 黃青山. 金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187的CHAP結構域的表達及抗菌活性分析[J]. 生物技術通報, 2016, 32(9): 232-238.

[14]GERVASI T, HORN N, WEGMANN U, et al. Expression and delivery of an endolysin to combat Clostridium perfringens[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(6): 2495-2505.

[15]MARTIN H, WILLEY B, LOW D E, et al. Characterization of Clostridium difficile strains isolated from patients in Ontario, Canada, from 2004 to 2006[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(9): 2999-3004.

[16]LAWRENCE R, JEYAKUMAR E. Antimicrobial resistance: A cause for global concern[J]. BMC Proc, 2013, 7(S3): S1.

[17]BORYSOWSKI J, WEBER-DABROWSKA B, GóRSKI A. Bacteriophage endolysins as a novel class of antibacterial agents[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2006, 231(4): 366-377.

[18]GU J, XU W, LEI L, et al. LysGH15, a novel bacteriophage lysin, protects a murine bacteremia model efficiently against lethal methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(1): 111-117.

[19]SCHMELCHER M, POWELL A M, BECKER S C, et al. Chimeric phage lysins act synergistically with lysostaphin to kill mastitis-causing Staphylococcus aureus in murine mammary glands[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(7): 2297-2305.

[20]PASTAGIA M, EULER C, CHAHALES P, et al. A novel chimeric lysin shows superiority to mupirocin for skin decolonization of methicillin-resistant and -sensitive Staphylococcus aureus strains[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(2): 738-744.

【責任編輯 李曉卉】

Prokaryotic expression and activity detection of bacteriophage lysin Cp51 against Clostridium perfringens type A

Lü Mengna, LONG Hangyu, WANG Limei, TANG Tao, CHEN Bingbing, LIN Ruiqing
(College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University/Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong Province, Guangzhou 510642, China)

【Objective】To construct a prokaryotic expression system of type A Clostridium perfringens phage lysin Cp51, and study its antibacterial activity against C. Perfringens type A in vitro. 【Method】Bacteriophage lysin Cp51 gene was synthesized. The prokaryotic expression vector pET-32a-Cp51 was constructed and transformed into Escherichia coli BL21(DE3). After induction using 0.5 mmol·L–1IPTG, the soluble recombinant protein Cp51 was successfully expressed, and was subsequently purified with Ni2+-NTA affinity chromatography. The antibacterial activity of the recombinant protein Cp51 was detected by kinetic turbidimetric assay. 【Result】The bacteria turbidities of seven strains of C. perfringens type A were effectively reduced by the recombinant protein Cp51. The bactericidal rate was above 99.99% in 30 min after treatment of recombinant protein Cp51 at the concentration of above 5 μg·mL–1. The Cp51 protein had no bactericidal effect against other types of bacteria. 【Conclusion】The recombinant protein of bacteriophage lysine Cp51 has strong bactericidal activity and specificity in vitro against type A C. perfringens, which could provide a basis for clinical application of Cp51 lysin.

Clostridium perfringens; bacteriophage; lysin; protein expression; bactericidal activity

Q939.48；S945.1

A

1001-411X(2017)05-0019-05

呂夢娜, 龍航宇, 王麗梅, 等. A型產氣莢膜梭菌噬菌體裂解酶Cp51的原核表達及活性檢測[J]. 華南農業(yè)大學學報, 2017, 38(5): 19-23.

2016-11-29 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0855.008.html

呂夢娜(1991—)，女，碩士研究生，E-mail: 793453116@qq.com； 通信作者： 林瑞慶(1973—)，男，副研究員，博士，E-mail: rqlin@scau.edu.cn

廣東省科技計劃項目(2014A020208099)