曹先爽，王 進(jìn)，宋 麗，姜 浩,2，姚 曦，湯 鋒，岳永德

(1 國際竹藤中心 國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102；2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜分析紫藤種子提取物及其殺蚜活性研究

曹先爽1，王 進(jìn)1，宋 麗1，姜 浩1,2，姚 曦1，湯 鋒1，岳永德1

(1 國際竹藤中心 國家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100102；2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

【目的】通過對紫藤Wisteria sinensis種子提取物的化學(xué)成分分析及殺蚜活性測定和抗氧化活性評價(jià)，為紫藤種子資源在植物源農(nóng)藥領(lǐng)域的利用提供基礎(chǔ)。 【方法】以紫藤種子提取物為材料，采用全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC×GC-TOF/MS)技術(shù)進(jìn)行成分分析，以微量點(diǎn)滴法開展對棉蚜Aphis gossypii的觸殺毒力測定，用2,2–二苯基–1–苦基肼(DPPH)自由基清除法進(jìn)行抗氧化活性評價(jià)。 【結(jié)果】從紫藤種子石油醚提取物中檢測到61種化合物，主要包括酯類、烷烴類、芳香烴類等化合物，其中相對含量大于9%的化合物有：對二甲苯(14.33%)、十一烷(11.89%)、1,4–二乙基苯(11.02%)和癸烷(9.54%)。紫藤種子提取物對棉蚜的致死中質(zhì)量濃度(LC50)為193.22 mg·L–1(處理后24 h)。同時(shí)，紫藤種子提取物具有抗氧化活性，對DPPH的抑制中質(zhì)量濃度(IC50)為4.15 g·L–1。 【結(jié)論】紫藤種子提取物具有較強(qiáng)的殺蚜活性，有望作為植物源殺蚜劑用于棉蚜的防治。

紫藤；種子提取物；全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜；化學(xué)成分；觸殺活性；棉蚜；抗氧化活性

植物源農(nóng)藥具有環(huán)境友好、低毒和不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的生物農(nóng)藥，越來越受到關(guān)注。紫藤Wisteria sinensis是紫藤屬的藤本植物，在我國分布廣泛，資源豐富[1-2]。紫藤提取物具有抗氧化[3-4]、抑菌[5-6]、抗炎[7]和抗腫瘤[8]等生物活性，其中紫藤花提取物的抗氧化能力與其含有的總酚和總黃酮含量呈正相關(guān)[9]。在病蟲害防治方面，Hirashiki等[10]報(bào)道了紫藤種子中含有的蛋白酶抑制劑在植物防御病蟲害中擔(dān)當(dāng)重要角色。目前，對紫藤植物的花、莖和葉等部位的生物活性及化學(xué)成分的研究都有涉及，但對紫藤種子的研究相對較少[11-14]。在民間，紫藤種子晾干搗碎，經(jīng)水浸泡后的浸出液，可作為土農(nóng)藥用于殺蟲[15]。據(jù)《本草拾遺》記載，紫藤種子味甘、性溫、有小毒。高希武[16]報(bào)道了紫藤種子的丙醇提取物對蘋果蠢蛾Cydia pomonella幼蟲有毒性。陳凡等[17]從紫藤種子的蛋白粗提液中得到了紫藤凝集素，主要含有谷氨酸、天冬氨酸。朱立成[18]利用離子交換層析、凝膠過濾等色譜技術(shù)，從紫藤種子中分離純化出2種新的抗真菌肽，命名為WsAFP1和WsAFP2，它們對油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum和煙草赤星病菌Alternaria alternata的生長具有抑制作用。棉蚜Aphis gossypii是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，對棉花等多種農(nóng)作物均有危害作用。它不僅吸食植物汁液，破壞植物生長，還能傳播植物病毒病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失[19-20]。在生產(chǎn)中，常用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行棉蚜的防治，但容易造成棉蚜的抗藥性以及農(nóng)藥殘留等問題，因此，利用植物源農(nóng)藥進(jìn)行棉蚜害蟲的防治值得研究。本研究利用全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC×GC-TOF/ MS)分析了紫藤種子石油醚提取物的化學(xué)成分，并評價(jià)了紫藤種子提取物對棉蚜的觸殺活性及抗氧化能力，旨在為紫藤種子提取物作為植物源農(nóng)藥應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫藤種子于2015年10月從北京中國林業(yè)科學(xué)研究院采集，在室內(nèi)自然風(fēng)干，從紫藤莢中取出種子并粉碎，置于–20 ℃冰柜中備用。

甲醇、正己烷(色譜純)，美國Fisher公司產(chǎn)品；吡蟲啉，純度為96%(w)，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心產(chǎn)品；2,6–二叔丁基–4–甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)和2,2–二苯基–1–苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；丙酮、乙酸乙酯、石油醚 (分析純)，北京化工廠產(chǎn)品。

1.2 供試蚜蟲

供試棉蚜生活于棉花幼苗葉片表面，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為(28±1)℃，相對濕度(RH)為70%±5%，光周期為16 h光照∶8 h黑暗。

1.3 紫藤種子提取物制備

取粉碎后紫藤種子樣品100 g 于700 mL石油醚中，超聲波提取30 min，重復(fù)提取3次，合并提取液，經(jīng)布氏漏斗抽濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(45 ℃)中濃縮去除石油醚相，濃縮后的提取物為黃色油狀物。取10 μL的紫藤種子提取物溶于1 mL正己烷中，用GC×GC-TOF/MS分析。

1.4 紫藤種子提取物的色譜層析餾分

將紫藤種子石油醚提取物用硅膠柱色譜分離，在玻璃柱(內(nèi)徑26 mm、柱長500 mm)填充硅膠(200～300 目，青島海洋化工廠產(chǎn)品)后，按照質(zhì)量比1∶10的比例上樣，分別用石油醚、石油醚+乙酸乙酯(二者體積比為7∶3)、乙酸乙酯、乙酸乙酯+甲醇(二者體積比為6∶4)、乙酸乙酯+甲醇(二者體積比為2∶8)、甲醇進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度使用2倍柱體積(柱體積約為200 mL)的洗脫液，收集每個(gè)梯度的餾分，在45 ℃條件下減壓濃縮，然后分別對每個(gè)餾分進(jìn)行殺蚜活性評價(jià)。

1.5 GC×GC-TOF/MS分析

利用Pegasus 4D全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行樣品分析，儀器由美國LECO公司生產(chǎn)，分析條件：進(jìn)樣口及傳輸線溫度設(shè)為 240 和 280 ℃；進(jìn)樣量1 μL；色譜柱為一維柱，即Rxi-5 Sil MS石英毛細(xì)柱(內(nèi)徑0.25 mm×柱長30 m，膜厚0.25 μm)，二維柱即Rxi-17 Sil MS石英毛細(xì)柱(內(nèi)徑0.18 mm×柱長2 m，膜厚0.18 μm)。一維柱升溫程序：50 ℃保持0.2 min，以8.0 ℃·min–1速度升至280 ℃；二維柱爐溫補(bǔ)償5 ℃；熱脈沖0.8 s，調(diào)制周期4.0 s；載氣為高純氦氣1.0 mL·min–1；載氣分流比為50∶ 1。質(zhì)譜參數(shù)：離子源溫度 250 ℃；檢測器電壓1 420 V；質(zhì)量掃描范圍(m/z)33～550；采集頻率100 spec·s–1。

1.6 觸殺活性測定

采用微量點(diǎn)滴法進(jìn)行棉蚜觸殺活性的測定[21]，在棉花幼苗葉片上，用毛筆剔除若蟲，選取健康活潑、大小一致的無翅成蚜(≥30頭)為供試對象，將紫藤種子提取物溶于丙酮溶劑中，采用倍半稀釋法將供試溶液的質(zhì)量濃度配成500.00、250.00、125.00、62.50和31.25 mg·L–1，用Burkard-900X型自動微量施藥器對棉蚜背部進(jìn)行點(diǎn)滴施藥，設(shè)置丙酮溶劑為空白對照，吡蟲啉為陽性對照，每個(gè)處理重復(fù)3次，然后用濕棉花包住葉柄保濕，放在培養(yǎng)皿(內(nèi)徑9.0 cm×高1.5 cm)中，將培養(yǎng)皿放置在光照培養(yǎng)箱中[θ=(28±1) ℃、RH=(70±5) %、光周期為16 h光照∶8 h黑暗]培養(yǎng)，24 h后檢查蚜蟲死亡情況，并計(jì)算校正死亡率和致死中濃度(Median lethal concentration，LC50)。

1.7 紫藤石油醚提取物的抗氧化活性測定

采用Epidata 3.2進(jìn)行問卷調(diào)查數(shù)據(jù)錄入，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，兩兩比較釆用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用DPPH自由基清除法，評價(jià)紫藤提取物的抗氧化活性[22]，以乙醇為溶劑，分別配制0.125 mmol·L–1的DPPH溶液、10 mg·mL–1的紫藤提取物溶液和0.5 mg·mL–1的陽性對照BHT的溶液，分別取上述樣品0.60、0.50、0.30、0.10和0.07 mL，加入乙醇定容至1 mL后，再加入2 mL DPPH，混合搖勻，以乙醇溶劑為空白對照，BHT為陽性對照，每個(gè)處理重復(fù)3次，在37 ℃搖床上反應(yīng)30 min，用紫外分光光度計(jì)測定樣品在517 nm的光密度(D517nm)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

1.8.1 棉蚜死亡率和校正死亡率 棉蚜死亡率和校正死亡率計(jì)算公式：死亡率=死亡蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100%，校正死亡率=(處理組死亡率–對照組死亡率)/(1–對照組死亡率)×100%。

差異顯著性分析用統(tǒng)計(jì)軟件(Statistical product and service solutions, SPSS)在P=0.05時(shí)用單因素方差分析和鄧肯顯著性檢驗(yàn)，殺蟲活性的致死中濃度(LC50)根據(jù)概率回歸分析計(jì)算。

1.8.2 DPPH自由基清除率 DPPH自由基清除率=(D0–D1)/D0×100%，其中：D0為空白對照樣品的光密度；D1為處理樣品的光密度。計(jì)算結(jié)果用于制作樣品質(zhì)量濃度和自由基清除率相關(guān)的曲線，并根據(jù)該曲線的回歸模型計(jì)算出抑制中濃度(Half maximal inhibitory concentration, IC50)，IC50的數(shù)值越小，所表征出的活性越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫藤種子提取物的GC×GC-TOF/MS分析結(jié)果

表1 紫藤種子石油醚提取物化學(xué)成分全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜分析Tab. 1 Chemical compounds identified from the petroleum ether extract of Wisteria sinensis seeds by GC×GC-TOF/MS

續(xù)表 1 Tab. 1 continued

2.2 紫藤種子提取物及其洗脫餾分的殺蚜活性篩選

采用微量點(diǎn)滴法，對供試的紫藤種子提取物及其不同洗脫餾分進(jìn)行殺蟲活性評價(jià)，計(jì)算每個(gè)供試樣品在處理24 h后的棉蚜死亡率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，紫藤種子石油醚提取物具有較好的殺蚜活性，在處理質(zhì)量濃度為500 mg·L–1時(shí)，蚜蟲的死亡率達(dá)到80.33%。通過硅膠柱對紫藤種子石油醚提取物進(jìn)行色譜分離，獲得了6個(gè)色譜洗脫餾分(表2中編號1～6)，在不同餾分的殺蚜活性篩選中，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯+甲醇(二者體積比為2∶8)洗脫餾分的殺蟲活性最高，棉蚜的死亡率達(dá)到85.80%，說明紫藤種子石油醚提取物中的殺蚜活性組分，主要集中在該餾分，因此，進(jìn)一步對乙酸乙酯+甲醇(二者體積比為2∶8)洗脫餾分和紫藤種子石油醚提取物進(jìn)行毒力回歸分析。

表2 紫藤種子提取物及其不同洗脫餾分處理24 h后的殺蚜活性Tab. 2 Insecticidal activity of the seed extract of Wisteria sinensis and different elution fractions against Aphis gossypii after 24 h treatment

2.3 紫藤種子提取物對棉蚜的觸殺毒力回歸分析

將紫藤種子石油醚提取物和乙酸乙酯+甲醇(二者體積比為2∶8)洗脫餾分的樣品對棉蚜的觸殺生物活性進(jìn)行毒力回歸分析，并與陽性對照吡蟲啉進(jìn)行比較，分析結(jié)果見表3。從表3可知，供試的紫藤種子石油醚提取物及其洗脫餾分，均對棉蚜蟲有較好的觸殺作用，其致死中濃度(LC50)分別為193.22和86.88 mg·L–1。用LC50值表征紫藤種子提取物的觸殺能力，LC50值越小代表觸殺能力越強(qiáng)，紫藤種子石油醚提取物的LC50值是農(nóng)藥吡蟲啉LC50值的15倍，但作為植物源提取物來說，其殺蟲活性值得研究。

表3 紫藤種子石油醚提取物及洗脫餾分對棉蚜24 h的觸殺活性Tab. 3 Contact toxicity of petroleum ether extract of Wisteria sinensis seeds and the elution fraction against Aphis gossypii after 24 h treatment

2.4 紫藤石油醚提取物的抗氧化活性

采用DPPH自由基清除法，測定紫藤種子石油醚提取物的抗氧化活性，以BHT為陽性對照，結(jié)果見表4。從表4看出，在試驗(yàn)設(shè)置的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紫藤種子石油醚提取物的質(zhì)量濃度與其抗氧化活性呈線性關(guān)系(R2≥0.968 8)，紫藤石油醚提取物具有一定的抗氧化能力，其抑制中濃度(IC50)為4.15 g·L–1。用IC50表征紫藤種子石油醚提取物的抗氧化能力，IC50越小所表征的抗氧化能力越強(qiáng)。

表4 紫藤種子石油醚提取物的抗氧化活性Tab. 4 Antioxidant activity of the petroleum ether extract of Wisteria sinensis seeds

3 討論與結(jié)論

在紫藤種子提取物的化學(xué)成分分析中，發(fā)現(xiàn)一些化合物的保留時(shí)間相似，在一維色譜中難以分開，而在二維色譜中能夠較好地分離，結(jié)合飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行定性，鑒定結(jié)果的可靠度更高。徐敬東[5]采用氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析了紫藤種子超臨界CO2提取物，鑒定出了21種化合物，相對含量較高的為亞油酸(62.13%)和十六碳烯酸(17.46%)，從水蒸氣蒸餾法制備的紫藤提取物中，鑒定出47種化合物，相對含量較高的化合物為棕櫚酸(19.10%)和油酸(7.58%)。上述研究結(jié)果與本研究中的紫藤種子提取物成分差異較大，可能由于種子產(chǎn)地來源以及提取工藝方法的不同，造成了檢出化學(xué)成分的差異。另外，紫藤植物不同組織部位的化學(xué)成分也存在差異，如，金振國等[23]采用GC-MS分析紫藤莢提取物的化學(xué)成分，其中2,3–環(huán)氧基–1–丁醇和乙酸乙酯的相對含量較高。Mohamed 等[8]從紫藤葉甲醇提取物中分離鑒定出9種化合物，其中6種為黃酮類化合物。植物化學(xué)成分是其生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，上述結(jié)果對于紫藤的生物活性研究具有重要意義。

本研究采用GC×GC-TOF/MS技術(shù)對紫藤種子石油醚提取物進(jìn)行分析，共鑒定出61種成分，相對含量較高的成分有：對二甲苯(14.33%)、十一烷(11.89%)和1,4–二乙基苯(11.02%)等。李軻軻等[24]研究了二甲苯對蚜蟲的行為反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)二甲苯在較低劑量時(shí)就可以引起蚜蟲死亡。另外，楊紅等[25]研究表明，二甲苯以 φ 為 4%的體積分?jǐn)?shù)，就能對菜青蟲細(xì)胞產(chǎn)生78%的致死率。因此，本研究中紫藤種子提取物中相對含量較高的對二甲苯對殺蚜活性起到重要作用。

本研究表明，紫藤種子石油醚提取物對棉蚜蟲有較好的觸殺作用，其LC50為193.22 mg·L–1，通過對紫藤種子提取物的硅膠柱色譜分離表明，其殺蚜活性成分集中在乙酸乙酯+甲醇(二者體積比為2∶8)的洗脫餾分，有文獻(xiàn)報(bào)道，從駱駝蓬Peganum harmala中分離出的駱駝蓬堿具有較好的殺蟲活性，合成制備的2種駱駝蓬堿單體化合物對芥末蚜蟲的LC50為53.16和68.05 mg·L–1(處理48 h)[26]。華北白前Cynanchum mongolicum精油對大豆蚜蟲的LC50為37.8 μL·mL–1(處理24 h)[27]。和紫藤植物一樣，華北白前和駱駝蓬2種植物也在民間用于殺蟲。本研究中，紫藤種子石油醚提取物具有一定的抗氧化能力，其IC50為4.15 g·L–1。一般來說，植物源農(nóng)藥具有穩(wěn)定性差、易降解的特點(diǎn)，通過加入抗氧化劑來清除氧自由基或阻斷鏈?zhǔn)阶杂苫趸磻?yīng)，是增加或改善植物源農(nóng)藥穩(wěn)定性的方法之一[28]。本研究表明，紫藤種子提取物具有一定的抗氧化活性，將有助于其制劑的穩(wěn)定性。因此，紫藤種子石油醚提取物具有開發(fā)成植物源殺蚜劑的潛力。

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【責(zé)任編輯 李曉卉】

GC×GC-TOF/MS analysis of the seed extract of Wisteria sinensis and the insecticidal activity

CAO Xianshuang1, WANG Jin1, SONG Li1, JIANG Hao1,2, YAO Xi1, TANG Feng1, YUE Yongde1
(1 SFA Key Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology, International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China; 2 State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

【Objective】To analyze the chemical composition, insecticidal and antioxidant activities of the seed extract of Wisteria sinensis, and provide a basis for developing botanical pesticide from W. sinensis germplasm resources.【Method】The seed extract of W. sinensis was analyzed by comprehensive two-dimensional gas chromatographytime-of-flight mass spectrometry (GC×GC-TOF/MS). The toxicity against Aphis gossypii was determined by topical application bioassay. The antioxidant activity was evaluated using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging method. 【Result】A total of 61 components were identified from the seed extract of W. sinensis, mainly including esters, alkane, arene, etc. The constituents with higher than 9% relative content were p-xylene (14.33%), undecane (11.89%), 1,4-diethyl-benzene (11.02%) and decane (9.54%). The seed extract of W. sinensis showed insecticidal activity against A. gossypii with the LC50value of 193.22 mg·L–1after 24 h treatment, and also showed antioxidant activity with the IC50value of 4.15 g·L–1against DPPH. 【Conclusion】The seed extract of W. sinensishas strong insecticidal activity, and has the potential to be developed into a natural insecticide for controlling A. gossypii.

Wisteria sinensis; seed extract; GC×GC-TOF/MS; chemical composition; contact toxicity; Aphis gossypii; antioxidant activity

S482.1；S433

A

1001-411X(2017)05-0067-07

曹先爽, 王進(jìn), 宋麗, 等. 全二維氣相色譜–飛行時(shí)間質(zhì)譜分析紫藤種子提取物及其殺蚜活性研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 38(5): 67-73.

2016-11-19 優(yōu)先出版時(shí)間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0859.024.html

曹先爽(1992—)，女，碩士研究生，E-mail: 18811717100@163.com； 通信作者： 王 進(jìn)(1977—)，男，副研究員，博士，E-mail: wangjin@icbr.ac.cn

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0600801)；國際竹藤中心基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1632014009)