付雙彬，李 慧，趙 健，符學軍，朱松林，張金鳳

(1 林木育種國家工程實驗室/林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室/國家林業(yè)局樹木花卉育種生物工程重點開放實驗室/北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京100083；2 山西呂梁山國有林管理局 國家油松良種基地，山西 臨汾 041300)

油松胚性愈傷組織培養(yǎng)中褐化因素研究及增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

付雙彬1，李 慧1，趙 健1，符學軍2，朱松林2，張金鳳1

(1 林木育種國家工程實驗室/林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室/國家林業(yè)局樹木花卉育種生物工程重點開放實驗室/北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院，北京100083；2 山西呂梁山國有林管理局 國家油松良種基地，山西 臨汾 041300)

【目的】調(diào)查油松Pinus tabulaeformis胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)階段不同因素對于褐化產(chǎn)生的影響，并結(jié)合增殖率對培養(yǎng)基進行調(diào)整優(yōu)化以降低褐化率，提高利用率?！痉椒ā恳?個年份的9個細胞系的油松胚性愈傷組織為材料，利用單因素試驗設計對放置不同數(shù)量愈傷塊、pH、植物凝膠含量、糖種類和含量以及培養(yǎng)時間的褐化率和增殖率進行測定計算。采用正交試驗選出最佳培養(yǎng)條件。【結(jié)果】單因素試驗結(jié)果表明，褐化率在不同基因型間差異顯著，且與增殖繼代年齡顯著正相關；在培養(yǎng)皿中放置6～7塊愈傷組織、pH 5.8～6.0、培養(yǎng)基中添加2.0～3.0 g·L–1植物凝膠、添加10 g·L–1蔗糖能保證較低的褐化率和較高的增殖率，且蔗糖優(yōu)于葡萄糖和麥芽糖?！窘Y(jié)論】結(jié)合正交設計，90 mm培養(yǎng)皿中放置7塊愈傷組織，培養(yǎng)基中添加2.5 g·L–1植物凝膠、10 g·L–1蔗糖，調(diào)節(jié)pH為5.9時，褐化率、增殖率和利用率最理想。

油松；胚性愈傷；褐化；增殖；正交設計

油松Pinus tabulaeformis是我國北方14個省(自治區(qū)、直轄市)重要的鄉(xiāng)土樹種，生態(tài)適應區(qū)約300萬km2，是我國華北、西北及東北部分地區(qū)的主要造林樹種。油松用途廣，選育目標多樣，在較好的立地，可以培育工業(yè)用材林；它耐干旱、貧瘠，適應力強，對維護國土生態(tài)安全具有特殊重要地位[1]。然而，由于林木本身的限制，其良種的繁育遠遠達不到造林以及商業(yè)化的要求，因此開辟新的育種途徑，加快油松的育種和繁殖進程是油松育種中亟待解決的問題。得益于油松體細胞胚胎發(fā)生體系的建立，為油松的快速繁育提供了新的途徑，為其無性系育種和優(yōu)良無性系繁殖推廣提供了高效的繁殖技術。然而，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)一些油松胚性愈傷組織會產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，并會逐漸影響未褐化組織的生長，嚴重的會導致整塊的組織死亡，使珍貴的材料丟失[2]。

組織培養(yǎng)中的褐變是指外植體在誘導分化或再分化的過程中自身組織從表面向培養(yǎng)基中釋放褐色有毒物質(zhì)，使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，以至于外植體也隨之變褐死亡的現(xiàn)象。褐變在組織培養(yǎng)過程中普遍存在[3]，這在果樹等酚類物質(zhì)含量較高的木本植物中尤其嚴重[4]。對于這種較普遍的現(xiàn)象，國內(nèi)外研究主要集中在果樹等經(jīng)濟林樹種的組織培養(yǎng)中[5]，針葉樹種中只有歐洲赤松、紅豆杉[6-8]等少數(shù)幾個樹種有組織培養(yǎng)方面的研究，油松并沒有專門進行這方面研究的報道。目前研究認為，引起褐化的原因包括酶促褐變和非酶促褐變，近年也有與美拉德反應相聯(lián)系[9]；但組織培養(yǎng)中的褐變主要是由酶引起的細胞內(nèi)的氧化褐變，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等都成為影響褐化的重要外因[3-4]。

根據(jù)原有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，油松胚性愈傷褐化率平均在30%左右，而在一些愈傷組織中甚至無一幸免。為了盡量避免胚性愈傷的褐化，保證材料的完整性，我們對現(xiàn)有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化和調(diào)整，選擇了3個不同年份共9個細胞系作為供試材料，研究90 mm培養(yǎng)皿接種愈傷塊數(shù)量，培養(yǎng)基中不同植物凝膠含量、糖種類和蔗糖含量對于褐化產(chǎn)生的影響，同時結(jié)合增殖率對現(xiàn)有的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進行優(yōu)化，希望借此能夠篩選合適的基因型，選擇最優(yōu)的培養(yǎng)基、創(chuàng)造最佳的培養(yǎng)條件以避免褐化，保證胚性愈傷的良好狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料

油松胚性愈傷組織試驗材料有3類，第1類是2013年獲得，已增殖繼代3.2年的3個胚性細胞系(13a2、13b2和13c2)，第2類是2015年獲得，已增殖繼代1.2年的3個胚性細胞系(15c4a、15c4b和15n38a)，第3類是2016年獲得，已增殖繼代0.2年的3個胚性細胞系(16c4a、16n77a和16z36a)。

1.2 單因素試驗

1.2.1 基礎培養(yǎng)基 采用mLV[10]基本培養(yǎng)基，90 mm一次性培養(yǎng)皿，每塊胚性愈傷稱200 mg(采用15n38a)，放置8塊，培養(yǎng)基中添加外源激素2,4-D 0.2 mg·L–1、6-BA 0.1 mg·L–1，蔗糖20 g·L–1，植物凝膠(美國Sigma公司)3 g·L–1，pH 5.8，接種2周后統(tǒng)計褐化率和平均增殖率。

1.2.2 胚性愈傷組織褐化的判斷 在油松胚性愈傷培養(yǎng)的過程中，其褐化的出現(xiàn)多呈現(xiàn)愈傷顏色變成黃色或褐色、表面變得光滑，呈萎縮狀，不再具有胚性愈傷良好的狀態(tài)；而正常的胚性愈傷則呈白色或半透明，表面呈顆?；蚣獯虪?圖1)。

1.2.3 基因型及增殖繼代年齡對褐化的影響 選擇9個胚性細胞系，接種2周后統(tǒng)計褐化率，同時對增殖繼代年齡與褐化率進行相關性分析，每試驗重復5次。

1.2.4 培養(yǎng)皿中放置愈傷塊數(shù)對褐化的影響 培養(yǎng)皿中分別放置6、7、8、9、10、12塊未褐化的胚性愈傷，其他同基礎培養(yǎng)基，同時為避免營養(yǎng)成分的影響，將統(tǒng)計褐化率和增殖率時間改為1周，每試驗重復3次。

1.2.5 pH對褐化的影響 培養(yǎng)基滅菌前分別調(diào)pH到 5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2，其他同基礎培養(yǎng)基，每試驗重復3次。

圖1 正常和褐化的油松胚性愈傷組織(15n38a)Fig. 1 Normal and browning embryogenic callus of Chinese pine (15n38a)

1.2.6 植物凝膠含量對褐化的影響 植物凝膠依次添加1.5(能使培養(yǎng)基凝固的最少含量)、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g·L–1，其他同基礎培養(yǎng)基，每試驗重復3次。

1.2.7 培養(yǎng)基中蔗糖含量和糖的類型對褐化的影響 蔗糖依次添加10、20、30、40、50 g·L–1，而葡萄糖、麥芽糖均設為20 g·L–1，其他同基礎培養(yǎng)基，每試驗重復3次。

1.3 正交設計與驗證

利用正交試驗設計，對放置愈傷塊數(shù)、pH、植物凝膠含量、蔗糖含量4個因素的單因素結(jié)果最優(yōu)范圍附近各挑選3個水平進行試驗，參照L9(34)正交表，選出最佳組合，每試驗重復3次。

為了驗證調(diào)整后的培養(yǎng)基的效果，對5周內(nèi)，原培養(yǎng)基和調(diào)整后培養(yǎng)基的褐化率進行了統(tǒng)計，繪制圖表。原培養(yǎng)基參照“1.2.1”。優(yōu)化培養(yǎng)基：采用mLV基本培養(yǎng)基，90 mm培養(yǎng)皿中胚性愈傷組織放置7塊，外源激素2,4-D 0.2 mg·L–1、6-BA 0.1 mg·L–1，蔗糖10 g·L–1，植物凝膠(Sigma) 2.5 g·L–1，pH 5.9。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，相關性分析采用SPSS雙變量相關性分析，結(jié)果取平均數(shù)±標準誤，利用最小顯著極差法(LSD)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型間褐化率的統(tǒng)計及增殖繼代年齡與褐化率的關系

9個測試基因型的褐化率是不同的，基因型對于褐化率的影響顯著(P=0.000)(圖2)；經(jīng)過回歸分析(圖3)發(fā)現(xiàn)，增殖繼代年齡與褐化率之間呈正相關關系，相關系數(shù)r=0.922，在0.01水平上顯著相關(P= 0.000)，即隨著增殖繼代年齡的加大，褐化率增高。

圖2 不同基因型的褐化率Fig. 2 Browning rates of different genotypes

圖3 增殖繼代年齡與褐化率的關系Fig. 3 Correlation between subculture time and browningrate

2.2 培養(yǎng)皿中胚性愈傷塊數(shù)對褐化的影響

從圖4中可以看出，隨著愈傷塊數(shù)的增加，褐化率整體呈上升的趨勢，而愈傷的生長受到了褐化的影響，增殖率呈下降趨勢；綜合來看，培養(yǎng)皿中放置6～8塊愈傷，其褐化率差異并不顯著，如果結(jié)合增殖率，則6或7塊最好。因此，如果要將褐化最低化，則放置的愈傷越少越好，但在培養(yǎng)基足夠的情況下，放置7塊會達到高的利用效率。

圖4 培養(yǎng)皿中愈傷塊數(shù)對于褐化率和增殖率的影響Fig. 4 Effects of callus number in the petri dish on browning and proliferation rates

2.3 pH對褐化的影響

由圖5可知，pH對愈傷組織的生長和褐變都有較大的影響。在pH為5.2～5.4時, 愈傷組織生長很慢，且褐變率最高；隨著pH的升高，愈傷組織的生長加快，褐化率降低，到pH為5.8時，褐變率最小，當pH為6.0時，褐化又開始升高，增殖受到影響。由此可知，pH為5.6～6.0時，褐化程度較小(差異不顯著)，特別是pH為5.8時，其增殖最好。

圖5 培養(yǎng)基pH對于褐化率和增殖率的影響Fig. 5 Effects of pH on browning and proliferation rates

2.4 植物凝膠含量對褐化的影響

從圖6可以看出，隨著植物凝膠用量的加大，褐化率呈逐漸升高的態(tài)勢；而且植物凝膠含量過多會顯著影響胚性愈傷的增殖率，同時會影響其形態(tài)和結(jié)構(gòu)(愈傷表面干化，呈結(jié)晶狀)；而凝膠含量過少(1.5～2.0 g·L–1)，愈傷組織周圍水分堆積，雖不會產(chǎn)生褐化，但影響其增殖和形態(tài)。所以綜合來看，培養(yǎng)基中添加3.0 g·L–1的植物凝膠是最優(yōu)的選擇。

2.5 培養(yǎng)基中蔗糖含量和糖的類型對褐化的影響

隨著蔗糖含量的增加，褐化率呈增高態(tài)勢，當蔗糖質(zhì)量濃度達到40 g·L–1時，未褐化的愈傷已所剩無幾，當蔗糖質(zhì)量濃度達到60 g·L–1時已全部褐化，而葡萄糖、麥芽糖等褐化雖不算嚴重，但會影響愈傷的增殖(表 1)；在蔗糖質(zhì)量濃度10～30 g·L–1時，增殖率隨著蔗糖含量增加而增加，但由于褐化組織的增多而導致最后的平均增殖率差異不顯著，因此10 g·L–1是最優(yōu)的選擇。

圖6 培養(yǎng)基中植物凝膠含量對于褐化率和增殖率的影響Fig. 6 Effects of phytagel content on browning and proliferation rates

表1 蔗糖含量和糖的類型對褐化率和增殖率的影響1)Tab. 1 Effects of sucrose content and type of sugar on browning rate

2.6 正交試驗結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，選定4個因素最優(yōu)范圍內(nèi)3個水平進行正交試驗，2周后愈傷組織褐化率見表2。1號處理褐化率最低(5.56%)，6號為9.53%，其他試驗褐化率均在10%～21%，8號最高，為20.83%。極差分析顯示放置愈傷塊數(shù)極差最大(7.41)，對結(jié)果影響最大，其次為蔗糖含量、pH和凝膠含量；從平均值看，如將褐化降到最低，各因素最好搭配為放置6塊愈傷，pH為5.9，植物凝膠為2.5 g·L–1，蔗糖為5 g·L–1。如將效率最大化，則可放置7塊愈傷，蔗糖添加10 g·L–1(在一定范圍內(nèi)，蔗糖含量增加，增殖率會增加)。

如圖7所示，在半固體培養(yǎng)基中隨著培養(yǎng)時間的增加，褐化也逐漸加重。在原培養(yǎng)基上，褐化率幾乎呈直線升高趨勢，2周時即可達20%左右，而胚性愈傷在優(yōu)化的培養(yǎng)基生長2周時褐化率只有不到5%，效果是比較顯著的。

表2 正交設計統(tǒng)計表Tab. 2 Orthogonal design statistics

圖7 培養(yǎng)基調(diào)整前后褐化率的統(tǒng)計Fig. 7 Browning rate before and after adjustment of medium

3 討論與結(jié)論

隨著繼代時間的增長，胚性愈傷組織往往會出現(xiàn)一些不利的甚至不可逆的變化，如壞死、胚性喪失和褐化等，而目前較好的解決方法是篩選優(yōu)秀的細胞系、在其增殖高峰時進行超低溫保存或置于懸浮培養(yǎng)條件下[11-12]。在油松胚性愈傷中，褐化的現(xiàn)象在不同基因型間差異顯著，且會隨著時間的增加而加重，在此結(jié)果來看，每年篩選優(yōu)良的基因型的確是較好的解決方法，但時間的耗費和目前并不令人滿意的誘導率遠遠不如考慮調(diào)整優(yōu)化培養(yǎng)基更為實際。

體細胞胚胎發(fā)生是細胞全能性表達最完全的一種方式，重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的進程[13]。在自然環(huán)境下，松樹種子中的合子胚是在雌配子體里面完成生長和發(fā)育過程，但是離體環(huán)境下進行體細胞胚胎發(fā)生，除了誘導初期大多數(shù)時間不是在雌配子體內(nèi)進行的，理論上人工培養(yǎng)基越接近雌配子體的環(huán)境就越利于胚性愈傷組織的生長，因而培養(yǎng)基的優(yōu)化對胚性愈傷快速、健康的生長很重要，但需要結(jié)合各方面綜合考慮。

培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基是胚性愈傷所處的環(huán)境和營養(yǎng)來源，其變化也會影響外植體狀態(tài)[3]。如果培養(yǎng)皿中放置的愈傷數(shù)量過多，相互之間的競爭及物理空間限制，一些較差的愈傷會受此影響而處于不利的狀態(tài)[14-15]。

pH與褐變也密切相關，pH對酚類和酚氧化酶結(jié)合部位產(chǎn)生影響[16]。在板栗愈傷組織培養(yǎng)中，pH在5.8以下、6.0以上時褐化明顯加劇[3]，而牡丹愈傷培養(yǎng)中培養(yǎng)基需調(diào)到6.5才能使褐化最低[17]，本研究中將培養(yǎng)基中pH調(diào)到5.9是最佳的。

在云桑的組織培養(yǎng)中，瓊脂用量大，褐變率低；隨著瓊脂用量的減少，組織褐化則加重[18]。然而，在油松胚性愈傷的培養(yǎng)中，添加過量的凝膠是不利的，會加大褐化的概率，也會對其增殖和形態(tài)產(chǎn)生不利的影響；當然，如果凝膠含量偏少，愈傷本身或培養(yǎng)基中的水分會積累過多，同樣不利于其生長。

糖類是愈傷生長的重要碳源，是必不可少的，但同時它與培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓、酚類合成、酶活動等緊密相關，含量升高時，滲透壓增大，促進細胞分裂，而過高時反而會導致細胞分裂下降，褐化升高[19-20]。而嘗試更換成麥芽糖、葡萄糖，雖未產(chǎn)生異常的褐化[9]，但愈傷生長確不如蔗糖，可見不同植物對糖源的要求是不一樣的[20]。

此外，培養(yǎng)基中無機鹽含量、激素含量等都會影響褐化[3]，但通過對2,4-D和6-BA的調(diào)整，發(fā)現(xiàn)其對褐化影響并不顯著，而無機鹽涉及到基本培養(yǎng)基，在此并未調(diào)整。但相較于原有的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過上述的調(diào)整和優(yōu)化，在2周內(nèi)，15n38a細胞系褐化出現(xiàn)頻率很低，而所有油松胚性愈傷的平均褐化率下降到了10%左右，同時又能保證增殖的效率，已經(jīng)很好地達到了目的。當然，褐化還未完全避免，研究褐化的機理、運用一些抗褐化試劑將是下一步研究的問題。

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【責任編輯 莊 延】

Investigation of browning factors in embryogenic callus culture of Pinus tabulaeformis and optimization of proliferation medium

FU Shuangbin1, LI Hui1, ZHAO Jian1, FU Xuejun2, ZHU Songlin2, ZHANG Jinfeng1
(1 National Engineering Laboratory for Tree Breeding/Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education/Key Laboratory of Forest Trees and Ornamental Plants Biological Engineering of State Forestry Administration/College of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2 National Pinus tabulaeformis seed base, State-owned Forest Administration of Lüliang Mountain, Linfen 041300, China)

【Objective】To study the effects of different factors on browning of embryogenic callus of Pinus tabulaeformis during proliferation, and optimize the culture medium based on proliferation rate for lower browning rate and higher efficiency.【Method】Embryogenic callus of P. tabulaeformis from nine cell lines and three different year were used as material.We performed a serious of single factor experiments and calculated the browning rates and proliferation rates of embryogenic callus under the treatments of different callus number, pH, phytagel content, type and content of sugars, and culturing time. Orthogonal experiment was then conducted to screen out the best cultureconditions.【Result】Results of the single factor experiments showed that browning rate was significantly different among different genotypes, and it was significantly positively correlated with the age of subculture. The browning rate was relatively low and the proliferation rate was relatively high when the callus number in each petri dish was 6–7, medium pH was 5.8–6.0, phytagel was 2.0–3.0 g·L–1, and sucrose was 10 g·L–1. Sucrose was better than glucose and maltose.【Conclusion】Based on the orthogonal design, placing 7 callus in each 90 mm petri dish, adding 2.5 g·L–1phytagel and 10 g·L–1sucrose to the medium, and adjusting the pH to 5.9 could achieve the preferred browning rate，proliferation rate and efficiency.

Pinus tabulaeformis; embryogenic callus; browning; proliferation; lorthogonal design

S722

A

1001-411X(2017)05-0091-06

付雙彬, 李慧, 趙健, 等. 油松胚性愈傷組織培養(yǎng)中褐化因素研究及增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2017, 38(5): 91-96.

2016-12-01 優(yōu)先出版時間：2017-07-14

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170714.0859.032.html

付雙彬(1989—)，男，碩士，E-mail: shuangbinfu@gmail.com； 通信作者： 張金鳳(1964—)女，教授，博士，E-mail: zjf@bjfu.edu.cn

國家自然科學基金(31370658)；948項目(2014-4-59)；北京林業(yè)大學青年教師科學研究中長期項目(2015ZCQ-SW-02)；北京市園林綠化局計劃項目(CEG-2016-01)