高鳳艷，郝國(guó)平

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

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急慢性ITP患兒外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)及意義

高鳳艷1，郝國(guó)平2*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030013)

目的：檢測(cè)急性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(AITP)、慢性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(CITP)患兒外周血CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)、白介素-10(IL-10)的變化，探討三者在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。方法：流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分別檢測(cè)35 例AITP、31 例CITP患兒及20 例健康對(duì)照兒童外周血Treg細(xì)胞百分率及血清IL-10含量，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)血清中TGF-β1含量，進(jìn)行比較及相關(guān)性分析。結(jié)果：急性組Treg細(xì)胞百分率(4.23±0.82)%顯著低于對(duì)照組的(5.05±0.90)%(P<0.01)；慢性組Treg細(xì)胞百分率(3.47±0.63)%顯著低于急性組的(4.23±0.82)%(P<0.01)。急性組TGF-β1水平(189.36±66.71) pg/mL低于對(duì)照組的(231.45±113.89) pg/mL(P<0.05)，急性組IL-10含量(34.07±11.57) pg/mL低于對(duì)照組的(43.83±10.96) pg/mL(P<0.05)。TGF-β1水平及IL-10含量慢性組低于急性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ITP患兒外周血Treg細(xì)胞百分率與TGF-β1含量呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.01)。ITP患兒外周血IL-10含量與Treg細(xì)胞百分率、TGFβ1含量則無(wú)相關(guān)性。結(jié)論：ITP患兒Treg細(xì)胞減少及相關(guān)細(xì)胞因子含量降低可能與ITP的細(xì)胞免疫紊亂有關(guān)，免疫紊亂在慢性組尤其明顯，這可能也是慢性患兒治療效果不佳，呈現(xiàn)長(zhǎng)病程的原因之一。

血小板減少癥；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；白介素10；流式細(xì)胞術(shù)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種兒童中常見的良性出血性疾病，以免疫紊亂介導(dǎo)的血小板減少為特征。近年越來(lái)越多學(xué)者關(guān)注細(xì)胞免疫異常在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。該研究檢測(cè)ITP患兒外周血中CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)百分率及其相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)與白介素-10(IL-10)含量，進(jìn)一步驗(yàn)證并分析Treg細(xì)胞、TGF-β1及IL-10與ITP發(fā)病的關(guān)系及可能機(jī)制。同時(shí)對(duì)ITP患兒急性者與慢性者外周血中Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1及IL-10變化進(jìn)行比較，綜合分析三者在疾病不同狀態(tài)的數(shù)量變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月—2016年6月山西省兒童醫(yī)院血液科住院和門診治療的ITP患兒66 例，均符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。將初診的未使用人免疫球蛋白及糖皮質(zhì)激素治療的ITP患兒納入急性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(AITP)組，共35 例，男20 例，女15 例，年齡0.5～10 歲，中位年齡5.5 歲；將病程大于12 個(gè)月的ITP患兒納入慢性原發(fā)性免疫性血小板減少癥(CITP)組，共31 例，男17 例，女14 例，年齡3～12 歲，中位年齡7.5 歲，均符合CITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；正常對(duì)照組來(lái)自山西省兒童醫(yī)院2016年1月—3月體檢中心健康體檢者20 例，男7 例，女13 例，年齡3～10 歲，中位年齡6.5 歲。所有受試者均取得患兒家長(zhǎng)的知情同意，并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：長(zhǎng)期口服抗癲癇藥所致血小板減少患兒；系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其他自身免疫性疾病患兒；嚴(yán)重心肺腹及神經(jīng)系統(tǒng)疾病患兒。

1.2 試劑和儀器

鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、CD25-PE單抗、CD127-APC單抗及同型對(duì)照IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC及人血清白介素10(IL-10)均為貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑TGF-β1購(gòu)自博士德生物公司。流式細(xì)胞儀為貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品(型號(hào)：FC 500)。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 外周血CD4+CD25+CD127-Treg百分率檢測(cè)

取患兒治療前EDTA抗凝血100 μL，依次加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單抗各20 μL及CD127-APC單抗5 μL，對(duì)照組加入IgG1-FITC，IgG1-PE各20 μL及IgG1-APC 5 μL，分別混勻后避光孵育25～30 min，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，室溫避光孵育10 min，液體澄清透明后，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，再加入2 mLPBS洗滌液混勻，同法離心棄上清，細(xì)胞則懸浮于0.5 mL PBS中，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 外周血TGF-β1含量檢測(cè)

收集外周全血2 mL(采血管為黃色，即含有分離膠和促凝劑)，3 000 r/min離心5 min，取上清凍存于-70 ℃，用ELISA方法測(cè)TGF-β1含量(具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程詳見說(shuō)明書)。

1.3.3 外周血IL-10含量檢測(cè)

收集外周全血2 mL，3 000 r/min離心5 min，取上清凍存于-70 ℃，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)IL-10含量。(IL-10的檢測(cè)是偏向于ELISA的流式細(xì)胞術(shù))。

1.3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

流式高通量多因子檢測(cè)技術(shù)(AimPlex)是依據(jù)一系列熒光強(qiáng)度不同的微球包被有特異性捕獲抗體，與待測(cè)樣本孵育后，加入檢測(cè)抗體。流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白抗原的檢測(cè)；結(jié)合抗原標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白抗原的定量檢測(cè)。

1.3.3.2 標(biāo)本的采集

取患兒治療前外周全血1 mL，室溫凝固30 min后，離心1 000×9 15 min，收集血清凍存于-70 ℃。

1.3.3.3 準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：

取一8聯(lián)管，標(biāo)記1～8號(hào)，把標(biāo)準(zhǔn)品用2 000×9離心10 s，再加樣品稀釋液250 μL，充分混勻并冰浴5 min，8號(hào)管中加入標(biāo)準(zhǔn)品原液60 μL，1～8號(hào)管中加入樣品稀釋液120 μL，充分混勻，1號(hào)管中加入樣品稀釋液60 μL，從8號(hào)管開始依次取管液60 μL到上一管，直到2號(hào)管，則完成梯度稀釋。

1.3.3.4 操作步驟

第一，取混合微球加入各孔45 μL，把孔內(nèi)液體用抽濾器抽掉。第二，取標(biāo)準(zhǔn)品加入各孔45 μL，蓋上封板膜，室溫避光振蕩60 min，把孔內(nèi)液體用抽濾器抽掉。第三，取洗滌緩沖液加入各孔100 μL，浸泡約1 min后棄液，拍干，共重復(fù)3 次。第四，取生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體工作液加入各孔25 μL，蓋上封板膜，室溫避光振蕩30 min。第五，同第三。第六，取用鏈霉親和素標(biāo)記的PE工作液加入各孔25 μL，蓋上封板膜，室溫避光振蕩20 min。第七，同第三。第八，取讀數(shù)緩沖液加入各孔150 μL，備用。第九，取洗滌緩沖液400 μL加入剩余微球中，充分混勻后倒入流式管，上流式細(xì)胞儀調(diào)整射門。第十，各孔內(nèi)液體需充分吹吸，懸浮微球后轉(zhuǎn)入流式管，上流式細(xì)胞儀測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AITP組、CITP組、對(duì)照組Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1、IL-10檢測(cè)結(jié)果比較

AITP組Treg細(xì)胞百分率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TGF-β1含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-10含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，CITP組Treg細(xì)胞百分率明顯低于AITP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，TGF-β1含量低于AITP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IL-10含量低于AITP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 三組Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1、 IL-10檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1、IL-10三者相關(guān)性分析

ITP患兒外周血Treg細(xì)胞百分率與TGF-β1含量呈正相關(guān)(r=0.75，P<0.01)；ITP患兒外周血IL-10含量與Treg細(xì)胞百分率、TGF-β1含量則無(wú)相關(guān)性。

3 討 論

ITP是一種以血小板抗體產(chǎn)生為特征的自身免疫性出血性疾病，抗體也許通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)導(dǎo)致血小板的破壞[2]。Seddiki等[3]研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞活化后高表達(dá)CD127，而真正的Treg則低表達(dá)CD127(CD4+CD25+CD127dim)，所以CD127可以幫助區(qū)別Treg與活化的T細(xì)胞。王會(huì)平等[4]也認(rèn)為CD4+CD25+CD127low標(biāo)記可以識(shí)別理想的Treg細(xì)胞，且并不影響T細(xì)胞活性。本研究采用CD4+CD25+CD127-三標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)Treg細(xì)胞百分率，可以提高真正Treg細(xì)胞的檢出率。

CD4+CD25+Treg來(lái)源于胸腺，在調(diào)節(jié)多種疾病的免疫反應(yīng)中起到重要作用，如過(guò)敏性疾病、惡性腫瘤、感染、自身免疫紊亂等方面[5]。Treg的數(shù)量和功能的異常在ITP發(fā)病中起到了一定的作用[6-7]。更有學(xué)者認(rèn)為Treg數(shù)量減低打破了自身耐受，Treg將成為未來(lái)ITP治療的依據(jù)，并且可能在兒童慢性ITP的自然病程和長(zhǎng)期結(jié)局的鑒別中成為診斷性指標(biāo)[8]。研究Treg細(xì)胞在ITP患者免疫調(diào)節(jié)功能紊亂發(fā)病機(jī)制中的作用有重要意義。本研究顯示急性組CD4+CD25+CD127-Treg細(xì)胞百分率較對(duì)照組明顯減低，慢性組較急性組明顯減低，表明Treg細(xì)胞數(shù)量減少可能與ITP的發(fā)生及疾病呈現(xiàn)慢性發(fā)展有關(guān)，可能與ITP患者體內(nèi)存在的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)，慢性ITP患兒則存在更嚴(yán)重的免疫紊亂。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，在組織損傷修復(fù)、組織細(xì)胞增殖分化、間質(zhì)形成等方面起重要作用[9]。TGF-β作為機(jī)體重要的顆粒蛋白，其在免疫調(diào)節(jié)中的重要性也逐步被認(rèn)識(shí)。IL-10是公認(rèn)的執(zhí)行免疫抑制功能的細(xì)胞因子，可被多種細(xì)胞分泌[10]。本研究顯示ITP患兒外周血中Treg數(shù)量減少，TGF-β1、IL-10含量明顯降低，且Treg百分率與TGF-β1含量呈正相關(guān)，Treg百分率與IL-10含量無(wú)相關(guān)性。Treg被激活后通過(guò)細(xì)胞相互接觸和(或)分泌IL-10、TGF-β、IL-4等細(xì)胞因子發(fā)揮作用[11-12]。用相應(yīng)抗體中和此類細(xì)胞因子則其體內(nèi)免疫抑制作用降低，說(shuō)明這些抑制性細(xì)胞因子可以輔助Treg細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Meloy等[13]的結(jié)論一致。IL-10、TGF-β在Treg細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖及介導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用，主要通過(guò)其可抑制抗原遞呈細(xì)胞及拮抗效應(yīng)T細(xì)胞的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)[14-15]。Treg百分率與IL-10含量無(wú)相關(guān)性，可能與多種細(xì)胞均可分泌IL-10有關(guān)。

本研究表明Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能障礙及其相關(guān)細(xì)胞因子含量降低可能與ITP患者體內(nèi)存在的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)，而慢性組中免疫功能的改變表現(xiàn)更為明顯，這可能也是慢性患兒治療效果不佳呈現(xiàn)長(zhǎng)病程的原因之一。

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ExpressionandsignificanceofregulatoryTcellsandtheirrelatedcytokinesinperipheralbloodofchildrenwithacuteandchronicprimaryimmunethrombocytopenia

GAO Fenyan1，HAO Guoping2

(1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.The Children′s Hospital of Shanxi，Taiyuan 030012，China)

Objective：To detect the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell，transforming growth factor β1(TGF-β1)，interleukin 10(IL-10) in children peripheral blood in acute primary immune thrombocytopenia(AITP) and chronic primary immune thrombocytopenia(CITP)，and to explore their role in the pathogenesis in primary immune thrombocytopenia (ITP).Methods：The proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and the content of IL-10 were detected by flow cytometry(FCM) in peripheral blood in AITP children of 35 cases，CITP children of 31cases and healthy children of 20 cases in control group.The content of TGF-β1was analyzed by ELISA.To compare the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and their related cytokines in the three groups and to analyze the relationships between them.Results：The proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell in acute group(4.23±0.82)% was significantly lower than that in control group(5.05±0.90)%(P<0.01)，the proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell in chronic group (3.47±0.63)% was significantly lower than that in acute group(4.23±0.82)%(P<0.01).The amount of TGF-β1in acute group(189.36±66.71) pg/mL was significantly lower than that in control group(231.45±113.89)pg/mL(P<0.05).The amount of IL-10 in acute group (34.07±11.57) pg/mL was significantly lower than that in control group(43.83±10.96) pg/mL(P<0.05)，the amount of TGF-β1and IL-10 in chronic group were significantly lower than that in acute group(P<0.01).There were psitive correlations between proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and TGF-β1in peripheral blood in ITP children(r=0.75，P<0.01).The content of IL-10 had no correlation with proportion of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and TGF-β1in peripheral blood in ITP children.Conclution：The decrease of CD4+CD25+CD127-regulation T cell and related cytokines in peripheral blood in ITP may be connected with cellular immumune disorder of ITP，the immumune disorder in chronic group was obvious，and it may be one reason of why the children of CITP with poor therapeutic effects and long course.

Thrombopenia；regulation T cell；transforming growth factor β1；interleukin 10；flow cytometry

1671-8631(2017)07-0493-05

*本文通訊作者：郝國(guó)平

R725.5

：A

2016-11-11

(本文編輯：張榮梅)

高鳳艷(1991— )，女，山西省呂梁市人，在讀碩士，主要從事小兒血液科工作。