劉忠玄 趙佳 劉雪峰 成麗萍 曹俊平 王光明

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040) (內(nèi)蒙古烏審旗森防站) (內(nèi)蒙古伊金霍洛旗森保站)

?

旱柳細菌性枯萎病室內(nèi)藥效篩選1)

劉忠玄 趙佳 劉雪峰 成麗萍 曹俊平 王光明

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040) (內(nèi)蒙古烏審旗森防站) (內(nèi)蒙古伊金霍洛旗森保站)

為了有效地防治旱柳細菌性枯萎病，在PDA培養(yǎng)基上，運用打孔注藥方法分別測試了14種殺菌劑對該病病原菌(Pantoeaagglomerans(Ewing and Fife) Gavini et al.)的抑菌效果。通過比較抑菌率和r值的大小評價各藥劑的抑菌效果，以確定藥效。結(jié)果表明：供試藥劑中有13種對該病原菌有抑菌效果，其中農(nóng)用鏈霉素、四霉素、乙蒜素和中生菌素的作用效果較明顯。

旱柳細菌性枯萎病；藥劑篩選；抑菌效果；成團泛氏菌

Bacterial wilt of willow; Screening of drugs; Bacteriostatic effect;Pantoeaagglomerans(Ewing and Fife) Gavini et al.

旱柳(SalixmatsudanaKoidz)是內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)種植最廣泛的喬木之一，屬楊柳科、柳屬，喜光，耐寒，濕地、旱地皆能生長，根系發(fā)達，抗風能力強，生長快，易繁殖[1]。在內(nèi)蒙古這種特殊的地理氣候條件下旱柳已成為重要的森林骨骼，不僅能防風固沙而且是很好的牛羊食料[2]。但近年，旱柳枯萎病在鄂爾多斯地區(qū)發(fā)生日漸嚴重，在春季和夏季起初的癥狀表現(xiàn)為柳樹的葉片和樹枝突然枯萎，有些樹枝和樹干快速的落葉，然后干枯死亡。切開感病樹枝或樹干，在邊材部位可以觀察到一條明顯呈環(huán)狀的紅褐色或棕黑色條帶，條帶處有大量的液體流出并伴有惡臭味。大面積感病時，由遠處看猶如一片火燒林。另外，由于連年發(fā)生病害，致使樹木長勢衰弱，引起天牛和蟬等昆蟲再危害。

國內(nèi)金九辰等[3]對西寧地區(qū)的柳樹細菌性枯萎病進行了研究，發(fā)現(xiàn)該病害由柳歐文氏桿菌(Erwiniasalicia)引起，該研究進行了病害調(diào)查和防治工作，但未提出良好的防治方法。國外雖然沒有對旱柳細菌性枯萎病的相關(guān)記載，但卻有一種由柳歐文氏桿菌引起的柳樹水印病的病害與旱柳細菌性枯萎病癥狀相類似。早在1924年荷蘭科學家Day[4]就首次發(fā)現(xiàn)并確定其能夠引起板球拍柳細菌水印病。國外學者Lindeijer、Dowson、Gremmen和DeKam等[5-9]也對該水印病進行了相關(guān)研究，目前在英國、荷蘭、比利時、澳大利亞、美國、日本都有關(guān)于柳樹水印病的報道，但是都沒有很好的防治方法。2014年到2016年，經(jīng)林間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害的潛育期長達2年；病原菌主要在感病樹體內(nèi)越冬，下年病原菌通過修枝、捅枝等傷口繼續(xù)侵染。該病害為木質(zhì)部病害，林間防治時，打孔注藥或灌根施藥方法比較合理，噴霧或涂抹施藥方法藥劑難以進入樹體并疏導到靶標位置。因此，為了有效防治旱柳細菌性枯萎病，進行了殺菌劑對旱柳細菌性枯萎病的藥效篩選試驗。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

病害標本采集于內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)。對發(fā)病組織進行鏡檢，并采用常規(guī)的細菌分離方法進行菌株分離和純化，得到純凈的菌株，再重新接種到健康的旱柳枝干進行致病性測定。根據(jù)柯赫氏法則，對引起感病癥狀的病樹進行分離純化。運用細菌鑒定方法，對比前后菌株，確定引起鄂爾多斯旱柳枯萎病的病原菌為成團泛氏菌(Pantoeaagglomerans(Ewing and Fife) Gavini et al.)[10]。

1.2 供試藥劑

以常見植物細菌病害的室內(nèi)藥劑篩選方法為參考[11-16]，結(jié)合實際生產(chǎn)條件，進行試驗方案設(shè)計。根據(jù)實際情況，旱柳細菌性枯萎病的發(fā)病部位在植物的木質(zhì)部，一般不能采取噴霧式施藥方法，應(yīng)采用灌根或打孔注藥的施藥方法，使藥劑更容易被植物吸收。但已有劑型中沒有打孔注藥的藥劑劑型，因此，選擇已有劑型中的14種藥劑進行藥劑篩選試驗(表1)。

表1 旱柳細菌性枯萎病室內(nèi)篩選藥劑

1.3 藥劑對病原菌生長抑制測定

采用打孔注藥測量抑菌圈大小的方法研究藥劑對病原菌的抑制作用。在前期的該病原菌培養(yǎng)基篩選中發(fā)現(xiàn)PDA培養(yǎng)基更適合其生長，細菌生長更黏稠、濃密、并且生長速度更快，所以選擇PDA作為對峙培養(yǎng)基。配制標準PDA培養(yǎng)基，準備干凈的90 mm培養(yǎng)皿若干，121 ℃滅菌20 min。烘干培養(yǎng)皿，用無菌注射器注入20 mL PDA培養(yǎng)基到培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后加入400 μL經(jīng)過180 r·min-1離心、29 ℃培養(yǎng)48 h的病原菌原液，再用滅菌的涂布器進行均勻涂布，然后使用無菌的8 mm外徑的打孔器在培養(yǎng)基上均勻打孔4個，用100 μL的槍頭向各個孔內(nèi)分別加入相應(yīng)處理藥液50 μL，每種藥劑分別稀釋100、200、400、600、800、1 000倍作為初篩試驗組(表2)。每種藥劑的每個處理重復3個培養(yǎng)皿。放入培養(yǎng)箱中29 ℃培養(yǎng)48 h后測量打孔周圍抑菌圈的大小，求取各處理下抑菌圈的平均值。同樣方法設(shè)置空白對照組，藥液改為無菌水，測定抑菌圈大小。根據(jù)藥劑產(chǎn)品說明換算每種處理下用藥量，再與抑菌圈大小進行對比，篩選出高效藥劑。計算出用藥量、用藥質(zhì)量濃度與抑菌圈的函數(shù)關(guān)系。根據(jù)以上測試結(jié)果，使用上述方法，對有效范圍超過1 000倍的藥劑設(shè)置更加廣譜的藥液質(zhì)量濃度，測出藥劑的最低有效質(zhì)量濃度。每種藥劑每個處理進行3組重復，每組重復打孔4個，孔徑8 mm，共測定抑菌圈12組，平均抑菌直徑(Dr)計算公式：Dr=∑(D1+D2+D3+…+D12)/12。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑對病原細菌生長的抑制作用

從表2可知，14種藥劑中的13種藥劑均有抑制病原菌生長的效果，但相互之間存在較大差異。根據(jù)抑菌圈的大小和抑菌率可以看出，14種藥劑中1-3號藥劑藥效較好，100倍時，抑菌圈直徑均超過1.5 cm，抑菌率均在75%以上。1號藥劑的藥效最好，400倍時，抑菌率仍在75%以上(圖1)。

A、B.400倍農(nóng)用鏈霉素抑菌效果；C、D.400倍四霉素抑菌效果。

2號藥劑的抑菌率僅次于1號藥劑，但有效成分質(zhì)量濃度處于14種藥劑中較低水平，因此，需要應(yīng)運用各種藥劑的抑菌圈直徑(D)與有效成分質(zhì)量濃度(M)的比值(r)來評價各個藥劑有效成分的作用效果。由表2可見，14種藥劑中2號和13號藥劑的r值較大，其次是5號藥劑，排在第四的是12號藥劑，而抑菌率最大的1號藥劑卻僅排第五。14號藥劑的r值為0，對病原菌無抑菌效果。

表2 14種藥劑的不同處理對旱柳細菌性枯萎病的抑制作用

藥劑編號1800倍液MD/cmP/%r5400倍液MD/cmP/%r16200倍液MD/cmP/%r20000倍液MD/cmP/%r10.40000.731.111.75000.13330.522.223.75090.04400.313.336.81820.036000020.001700000000030000000040000000050000000060000000070000000080000000090000000010000000001100000000120000000013000000001400000000

注：M為藥劑有效成分質(zhì)量濃度(g·L-1)，枯草芽孢桿菌的有效成分濃度用億個菌·mL-1進行計量；D為抑菌圈直徑；P為抑菌率；r=抑菌圈直徑(D)/有效成分質(zhì)量濃度(M)。

2.2 不同藥劑失效的臨界質(zhì)量濃度

不同藥劑的稀釋倍數(shù)相同，有效成分卻不同，抑菌率也有所差異。如表3所示，當1號藥劑用藥濃度為20000倍時失去抑菌的藥效，而2號藥劑稀釋1800倍時候就失去藥效，但當分別將2種藥劑稀釋到相應(yīng)的失效的臨界稀釋倍數(shù)時，對比2種藥劑的有效成分質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)1號藥劑的有效成分為0.044 0 g·L-1，而2號藥劑為0.001 9 g·L-1，相差20多倍。

表3 藥劑失效的臨界稀釋倍數(shù)下的有效成分

2.3 林間藥劑防治的成本估算

抑菌試驗以及各藥劑r值分析結(jié)果表明，1-3號藥劑以及5號和12號藥劑的防治效果較好。根據(jù)2015年5月在烏審旗烏審召使用農(nóng)用鏈霉素進行林間防治的成果，結(jié)合當時資本耗費情況和當?shù)叵M水平，進行成本估算。按照每人每天工作8 h，平均完成200株柳樹防治工作，再參考鄂爾多斯的物價水平以及考慮野外作業(yè)危險性和辛苦程度，核算人工費和汽油費，合計為勞務(wù)費。計算出每萬棵感病柳樹的勞務(wù)費為1萬元。根據(jù)柳樹胸徑和打孔數(shù)量估算，每萬棵樹田間施藥量約為200 L。通過分析抑菌率和r值大小，分別選取該5種藥劑100、200、400倍液，進行成本估算。每萬棵感病柳樹的防治成本=施藥量/稀釋倍數(shù)×藥劑成本+勞務(wù)費，核算結(jié)果如表4所示。藥劑的防治成本估算結(jié)果表明，勞務(wù)費占主要的部分，且各藥劑對每萬棵柳樹的防治成本較接近，因此，旱柳枯萎病病原菌的防治藥劑應(yīng)該主要根據(jù)藥劑抑菌的效果進行選擇。

表4 藥劑的成本估算

3 結(jié)論與討論

供試的14種藥劑中，除了14號藥劑外的13種藥劑都對該病原菌的生長有抑制作用。其中13號藥劑枯草芽孢桿菌為生防菌藥劑，其防治效果不理想，因此，生防菌試劑對柳樹細菌性病害的防治還需進一步篩選。其他藥劑中，1號和2號藥劑的抑菌效果優(yōu)于其他藥劑，1號藥劑100倍稀釋液的抑菌率達97.78%，且成本與其他藥劑成本相差不多，可以考慮使用。1號藥劑200倍液和2號藥劑的100倍液的抑菌率均為84.44%，成本較低，建議使用該濃度下的這2種藥劑進行田間防治試驗。若不使用成品藥劑防治，利用藥劑中有效成分配制病害防治藥劑，根據(jù)r值大小的比對結(jié)果可知，2號和5號的r值較高，若利用2號和5號藥劑的有效成分配制防治藥劑，可能會產(chǎn)生更好的防治效果。因此，1號農(nóng)用硫酸鏈霉素和2號四霉素是本試驗篩選得到的較有效的藥劑；2號四霉素和5號中生菌素有效成分的抑菌效果最好，可考慮配制藥劑進行防治；其他藥劑如3號乙蒜素和12號噻霉酮可酌情使用。本次藥劑的篩選為鄂爾多斯柳樹細菌性枯萎病的防治提供了理論依據(jù)，也為田間防治工作奠定了良好的基礎(chǔ)。

產(chǎn)品說明書試驗用量針對的是田間施藥的最佳方案，本次試驗的實驗室篩選結(jié)果與其用量有一定差異，但14種藥劑中大部分藥劑室內(nèi)篩選的有效質(zhì)量濃度范圍在建議施藥的質(zhì)量濃度范圍之內(nèi)，因此并不影響其用于鄂爾多斯旱柳細菌性枯萎病病原菌的田間防治。14種藥劑的施藥稀釋倍數(shù)從200～4 000倍各不相同，7號藥劑在果樹上施藥時稀釋倍數(shù)能達到2 500～4 000倍，但在本試驗中稀釋至1 200倍時，就已經(jīng)失去藥效。理論上用藥濃度越大，抑菌效果將會更好，但是在田間施藥時候，要考慮到環(huán)境保護、動植物保護、保護施藥人員安全、水源污染等等因素，才能給出科學合理的施藥濃度。

試驗發(fā)現(xiàn)，各藥劑臨界失效稀釋倍數(shù)和有效成分質(zhì)量濃度均不相同，形成此差異的主要原因可能是由于各種藥劑的原劑有效成分質(zhì)量濃度不同，也可能是各個藥劑自身的藥效有所差異。因此，在進行藥劑篩選時，不能單純根據(jù)各農(nóng)藥不同稀釋倍數(shù)下的抑菌率來評價抑菌效果，應(yīng)綜合考慮抑菌直徑(D)與有效成分質(zhì)量濃度(M)的比值(r)的大小，以及各藥劑失效的臨界稀釋倍數(shù)下的各藥劑的有效成分質(zhì)量濃度的多少，才能客觀評價抑菌的效果。

本試驗采用的打孔注藥的方法與產(chǎn)品說明書上的建議施藥方法不同，主要由于成品藥劑中沒有打孔注藥的劑型，但打孔注藥的方法在病蟲害的防治中起著至關(guān)重要的作用，該方法能使藥劑通過木質(zhì)部的導管傳輸?shù)綐淠镜拿總€部位，防治效果好，且污染小，安全性高。因此，建議生產(chǎn)打孔注藥這一劑型。

本研究對14種藥劑進行了室內(nèi)藥劑篩選，得到了幾種高效的藥劑，為該細菌性病害的防治提供了依據(jù)，也為防治工作奠定了基礎(chǔ)。但要投入林間防治，還需要先進行林間小范圍的試驗后才能進行大面積推廣，林間試驗需要重點考慮柳樹的品種、氣候、溫度、降雨以及施藥方式和施藥時間、環(huán)境和人員安全等因素。運用林間試驗結(jié)果，結(jié)合藥劑造價成本和安全性因素，最終決定最佳的防治藥劑，這些還有待進一步研究。

[1] 何維明,董鳴.毛烏素沙地旱柳生長和生理特征對遮蔭的反應(yīng)[J].應(yīng)用生態(tài)學報,2003,14(2):175-178.

[2] 吳統(tǒng)貴,周和鋒,吳明,等.旱柳光合作用動態(tài)及其與環(huán)境因子的關(guān)系[J].生態(tài)學雜志,2008,27(12):2056-2061.

[3] 金九辰,劉瑞,王清萍,等.西寧地區(qū)柳樹細菌性枯萎病的研究[J].中國森林病蟲,2001,20(增刊):5-7.

[4] DAY W R. The watermark disease of the cricket-bat willow (Salixcaerulea)[M]. Oxford: Clarendon Press,1924.

[5] DOWSON W J. Bacterium salicis day, the cause of the watermark disease of the cricket-bat willow[J]. Annals of Applied Biology,1937,24(3):528-544.

[6] METCALFE G. The watermark disease of willows. I. host-parasite relationships[J]. New Phytologist,1940,39(3):322-332.

[7] MAES M, HUVENNE H, MESSENS E. Brenneria salicis, the bacterium causing watermark disease in willow, resides as an endophyte in wood[J]. Environ Microbiol,2009,11(6):1453-1462.

[8] SAKAMOTO Y, SANO Y. Inhibition of water conductivity caused by watermark disease inSalixsachalinensis[J]. IAWA Journal,2000,21(1):49-60.

[9] SAKAMOTO Y, TAKIKAWA Y, SASAKI K. Occurrence of watermark disease of willows in Japan[J]. Plant Pathology,1999,48(5):613-619.

[10] 方中達.植病研究方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1979.

[11] 張艷菊,陳霞,劉海燕,等.糖槭葉枯病菌室內(nèi)藥效試驗[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2011,42(1):76-80.

[12] 伍慧雄,王勝坤,孫思.桉樹青枯病的發(fā)生與防治[J].廣東林業(yè)科技,2006,22(3):53-55,63.

[13] 車德軍,王海,高海軍.番茄細菌性病害的發(fā)生與防治[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2014,34(12):102-102.

[14] 于成明,倫瑩瑩,劉會香,等.楊樹細菌性潰瘍病菌的室內(nèi)藥劑活性篩選[J].農(nóng)藥科學與管理,2014,35(7):56-58.

[15] 余繼華,汪恩國.柑橘黃龍病發(fā)生危害與防治指標研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2009,21(4):370-374.

[16] 盧昕,李超萍,時濤,等.木薯細菌性枯萎病菌防控藥劑的篩選[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學,2013,33(2):53-56.

[17] 焦紅紅.獼猴桃細菌性潰瘍病防治藥物的篩選[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學,2014.

劉忠玄，男，1991年6月生，東北林業(yè)大學林學院，碩士研究生。E-mail：2825088250@qq.com。

劉雪峰，東北林業(yè)大學林學院，研究員。E-mail：757489401@qq.com。

2016年10月21日。

S763.1

1)事業(yè)單位委托科技項目(2015-170)。

責任編輯：程 紅。

Indoor Screening Fungicides of Willow Bacterial Wilt Disease//Liu Zhongxuan, Zhao Jia, Liu Xuefeng(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Cheng Liping, Cao Junping(Forest Protection Station, Wushen County in Inner Mongolia Autonomous Region); Wang Guangming(Forest Protection Station, Ejin Horo Banner in Inner Mongolia Autonomous Region)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：82-85,101.

In order to prevent and control the willow wilt disease effectively, the bacteriostatic effect of 14 drugs on the pathogen was tested by perforating drug injection in PDA media. The bacteriostatic effect of each drugs was evaluated by comparing the inhibitory rate and the value ofr. Thirteen of the tested drugs had bacteriostatic effects on the pathogen. The bacteriostatic effect of streptomycin, tetramycin, ethylicin and zhongshengmycin was good. Streptomycin and tetramycin had the best bacteriostatic effect, which is the best drugs selected in this experiment.