王瑩 王競(jìng)紅

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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長(zhǎng)藥景天根際抗Zn菌株的分離、篩選與鑒定

王瑩 王競(jìng)紅

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

以長(zhǎng)藥景天盆栽到Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 mg·kg-1的根際土壤為研究材料，對(duì)根際抗Zn菌株進(jìn)行富集、分離后，篩選出6個(gè)抗Zn菌株，編號(hào)分別為Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6。從形態(tài)學(xué)、生理生化、分子生物學(xué)角度進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：Zn1和Zn4均屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，相似度分別達(dá)到99%和98%；Zn2與黃色單胞菌屬(Xanthomonas)相似度達(dá)到97%；Zn3、Zn5和Zn6與腸桿菌屬(Enterobacter)的相似度均為97% 。

長(zhǎng)藥景天；根際；抗Zn菌株；菌株分離；菌株篩選；菌株鑒定

Hylotelephiumspectabile； Rhizosphere soil； Strains resisted Zn； Strains separation； Strains screening； Strains identification

重金屬Zn是動(dòng)植物所必需的微量元素，但如果重金屬Zn超標(biāo)會(huì)導(dǎo)致一系列不良的危害，包括動(dòng)物、人類[1-2]、植物[3-5]、農(nóng)作物[6]等，而這一切Zn的污染大多數(shù)來源于土壤，土壤中Zn污染的來源十分廣泛，所以治理土壤Zn污染是迫在眉睫的頭等大事。關(guān)于重金屬污染修復(fù)的方法有很多，例如，物理法、化學(xué)法等，但都由于其工程量大、處理費(fèi)用高而不能廣泛應(yīng)用，目前的生物修復(fù)技術(shù)中利用微生物處理重金屬Zn污染土壤是目前最有前途的一種重金屬污染處理方法，具有生態(tài)效益高、成本低、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，具有很高的研究?jī)r(jià)值[7]。文中通過實(shí)驗(yàn)室模擬盆栽試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取長(zhǎng)勢(shì)較好的耐Zn植物長(zhǎng)藥景天根系附近的土壤，進(jìn)行耐性菌株的分離、純化、篩選，通過形態(tài)、生理生化特性、16SrDNA三個(gè)層次進(jìn)行鑒定，為今后Zn污染提供菌株資源，為生物修復(fù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[8]。

1 材料與方法

菌株來源：菌株篩選于Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 mg·kg-1長(zhǎng)藥景天所生長(zhǎng)的根際土壤。

培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、尿素瓊脂培養(yǎng)基、菌膜培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、七葉苷培養(yǎng)基、苯丙氨酸培養(yǎng)基。

供試植物的培養(yǎng)與處理：長(zhǎng)藥景天屬喜旱植物，為使其根部具有良好的透氣性、防止?fàn)€根，在培養(yǎng)植物的土壤中添加砂子。添加標(biāo)準(zhǔn)為m(花土)∶m(砂子)=1∶1。將黑壤花土與砂子充分?jǐn)嚢杌靹?，進(jìn)行稱量，每個(gè)花盆1.5 kg花土，選擇生長(zhǎng)健康、長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 mg·kg-1土壤中的長(zhǎng)藥景天，在此脅迫條件下培養(yǎng)35 d，再對(duì)其植物根際土壤進(jìn)行取樣，以確保植物根際建立完整菌群。

抗Zn菌株的分離與純化：取土樣0.1 g溶于100 mL培養(yǎng)液中，在振蕩培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，用移液槍取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到Zn質(zhì)量濃度為800 mg·L-1的液體培養(yǎng)基(100 mL)中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，反復(fù)操作以上步驟5次。

將上述菌液分別取適量稀釋一定的倍數(shù)，取0.1 mL稀釋液滴加在固體平板(Zn質(zhì)量濃度為800 mg·L-1)中央，立即涂抹均勻。接種后移入恒溫培養(yǎng)箱中倒置，25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，直到培養(yǎng)基表面觀察到菌落。根據(jù)不同形態(tài)的菌落，挑取單菌落，移種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。上述操作反復(fù)進(jìn)行，同時(shí)用顯微鏡檢查，直至獲得純菌株[9]。將分離純化得到的菌株接種于液體細(xì)菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)后加入甘油，使甘油的最終溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，置于-80 ℃進(jìn)行保存。

菌株的形態(tài)學(xué)鑒定：將分離出的菌株用無菌水稀釋，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基的平板上，倒置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落表面形態(tài)、大小、顏色、黏稠度、透明度、邊緣形態(tài)等方面，并記錄結(jié)果。用電子顯微鏡對(duì)菌株進(jìn)行了電鏡觀察。

菌株的生理生化鑒定：淀粉水解試驗(yàn)、油脂水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、纖維素試驗(yàn)、尿素試驗(yàn)、過氧化氫試驗(yàn)、菌膜形成試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、卵磷脂試驗(yàn)、七葉苷試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)，參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]完成。

菌株的分子生物學(xué)鑒定：16SrDNA是目前被廣泛用于研究細(xì)菌遺傳特征和分類研究的方法[12-13]。通過瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，將帶有16SrDNA檢測(cè)片段的菌液送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的16SrDNA基因序列提交到NCBI Genebank中進(jìn)行相關(guān)序列的同源性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗Zn細(xì)菌的分離與篩選

通過對(duì)長(zhǎng)藥景天根際土壤中菌株的分離、純化與篩選，從長(zhǎng)藥景天根際獲得抗Zn菌株6株，編號(hào)分別為Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

6株菌株均為革蘭氏陰性菌，均為桿菌(表1，圖1)。

表1 6株抗Zn菌株的形態(tài)特征

注：—表示革蘭氏陰性細(xì)菌。

1．Zn1；2.Zn2；3.Zn3；4.Zn4；5.Zn5；6.Zn6。

2.3 菌株的生理生化鑒定

不同細(xì)菌對(duì)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的分解能力有所不同，這一特點(diǎn)對(duì)菌株的分類鑒定起到很大的推動(dòng)和促進(jìn)作用。

由表2可知，Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6甲基紅試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6纖維素試驗(yàn)均為陰性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6過氧化氫試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6菌膜生成試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6產(chǎn)氨試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6七葉苷試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn1、Zn2、Zn3、Zn4、Zn5、Zn6苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn2、Zn3、Zn5、Zn6淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；Zn2油脂水解試驗(yàn)結(jié)果為陰性；Zn1、Zn4吲哚試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn3、Zn5、Zn6能夠利用檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；Zn1、Zn4明膠試驗(yàn)結(jié)果均為陽性；Zn1、Zn4硫化氫試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn1、Zn4 V.P.試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn2尿素試驗(yàn)結(jié)果均為陰性；Zn2卵磷脂試驗(yàn)結(jié)果均為陽性。

2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 菌株DNA的提取、擴(kuò)增與克隆

提取6菌株的DNA，采用1%凝膠電泳對(duì)其檢測(cè)，電泳圖譜如圖2。DNA條帶亮度和純度較好，其片段大小約為1.5 kp，文中采用的DNA提取方法能夠保證獲得純度較高的基因組DNA。

以篩選出菌株的DNA作為模板，利用引物BSF8/20和BSR1541/20對(duì)其PCR進(jìn)行擴(kuò)增后，采用1%凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)(圖3)。擴(kuò)增效果良好，條帶亮度好，純度高，無非特異性的條帶出現(xiàn)，其片段大小約為1 500 bp。

表2 6菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：-表示陰性反應(yīng)；+表示陽性反應(yīng)。

圖2 Zn基因組DNA電泳圖譜

圖3 Zn DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

利用已被克隆的菌株DNA作為模板，利用引物RV-M和M13-47對(duì)菌落PCR進(jìn)行擴(kuò)增后，采用1%凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)(圖4)。擴(kuò)增效果良好，條帶亮度好，純度高，無非特異性條帶的出現(xiàn)，其片段大小約為1 500 bp。

2.4.2 菌株的16SrDNA序列分析

將16SrDNA的測(cè)序結(jié)果經(jīng)Vecscreen去載體后，將所測(cè)得的序列與Genbank中核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的16SrDNA進(jìn)行BLAST比對(duì)(表3)。比對(duì)結(jié)果表明，6菌株16SrDNA序列比對(duì)結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的細(xì)菌16SrDNA序列相似性為97%～100%，相似性均高于97%。

圖4 Zn菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

菌株編號(hào)最相近的種屬名稱Genbank分類號(hào)相似度/%Zn1StenotrophomonasKF059267.199Zn2Xanthomonassp.FJ600362.197Zn3Enterobactercloacaesubsp.CP003737.197Zn4UnculturedstenotrophomonasspFJ193149.198Zn5Enterobactersp.JQ231212.197Zn6Enterobactersp.HQ289883.197

3 結(jié)束語

從Zn質(zhì)量分?jǐn)?shù)為800 mg·kg-1的長(zhǎng)藥景天生活的根際土壤中進(jìn)行菌株分離、篩選、鑒定，從中獲得6個(gè)菌株。Zn1和Zn4均屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，相似度分別達(dá)到99%和98%。Zn2與黃色單胞菌屬(Xanthomonas)的相似度達(dá)到97%。Zn3、Zn5和Zn6與腸桿菌屬(Enterobacter)的相似度均為97%。

[1] OSTRIKOV K， YOON H J， RIDER A. Why small and medium chemical companies continue to pose severe environmental risks in rural China[J]. Environmental Pollution，2014，185(4)： 158-167.

[2] ASGARI K， CORNELIS W M. Heavy metal accumulation in soils and grains, and health risks associated with use of treated municipal wastewater in subsurface drip irrigation[J]. Environmental Monitoring and Assessment，2015，187(7)：1-13.

[3] MARSCHNER H． Mineral nutrition in higher plants[J]. Journal of Ecology，1995，76(4)：681-861.

[4] 房蓓，武泰存，千景安.低鋅和缺鋅脅迫對(duì)不同基因型玉米的影響及機(jī)理[J].土壤通報(bào)，2004，35(5)：617-621.

[5] 王玉梅.鋅肥對(duì)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2005(3):43-45.

[6] MUCHUWETI M， BIRKETT J W， CHINYANGA E， et al. Heavy metal content of vegetables irrigated with mixtures of wasterwater and sewage sludge in Zimbabwe： implications of human health[J]. Agriculture Ecosystems and Environment，2006，112(1):41-48.

[7] 李軍，楊卓，紀(jì)宏偉，等.污染土壤中重金屬Zn吸附菌株的篩選與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55(9)：2218-2221.

[8] 陳永華，向捷，吳曉芙，等.三株耐鉛鋅菌的分離、鑒定及其吸附能力[J].生態(tài)學(xué)雜志，2015，34(9)：2665-2672.

[9] 楊亮，郝瑞霞，吳灃，等.耐鉛微生物篩選及其鉛去除能力的初步研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，48(6)：965-970.

[10] 東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]．北京：科學(xué)出版社，2001:364-369.

[11] 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.8版.北京：科學(xué)出版社，1984：591-611.

[12] 李昂.菌株DyellaginsengisoliLA-4降解聯(lián)苯及基因的克隆與表達(dá)[D].大連：大連理工大學(xué)，2009：27.

[13] 郭亞輝，郭堅(jiān)華，李斌.根據(jù)16SrDNA序列對(duì)假單孢菌屬分類學(xué)的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2004，24(2)：38-41.

王瑩，女，1983年3月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，博士研究生；現(xiàn)工作于哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，講師。E-mail：67240473@qq.com。

王競(jìng)紅，東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，副教授。E-mail：yuanlin@nefu.edu.cn 。

2016年11月24日。

Q93-331

責(zé)任編輯：任 俐。

Separation, Screenin and Identification ofHylotelephiumspectabileStrains Resisted Zn in Rhizosphere Soil//Wang Ying, Wang Jinghong(Northeast Forestry University, Harbin 150000, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(3)：86-89.

Rhizosphere soil samples were collected from plants ofHylotelephiumspectabilewhich grew well in a pot experiment with Zn concentration of 800 mg·kg-1. After enrichment culture and separation strains which resisted Zn, six bacterial strains (Zn1, Zn2, Zn3, Zn4, Zn5 and Zn6) were screened. By morphological observation, physiological and biochemical experiments and molecular biology experiments, Zn1 and Zn4 were identified as Stenotrophomonas with the similarities of 99% and 98%, respectively, and Zn2 was identified asXanthomonaswith the similarity of 97%, and Zn3, Zn5 and Zn6 were identified as Enterobacter with the similarity of 97%.