王俊凱

(甘肅省人民醫(yī)院西院區(qū)神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730050)

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Toll樣受體4和核因子-κB在顱內(nèi)動脈瘤組織中的表達(dá)及作用機(jī)制

王俊凱

(甘肅省人民醫(yī)院西院區(qū)神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730050)

目的 探討Toll樣受體(TLR)4和核因子(NF)-κB在顱內(nèi)動脈瘤組織中的表達(dá)及作用機(jī)制。方法 在開顱動脈瘤夾閉術(shù)中收集18例動脈瘤標(biāo)本，根據(jù)Hunt-hess標(biāo)準(zhǔn)分為破裂組10例、未破裂組8例；取開顱夾閉術(shù)中獲取入路同側(cè)血管10份為正常對照組。分別行光鏡和電鏡觀察標(biāo)本病理學(xué)改變，α-actin染色結(jié)合電鏡觀察計算出血管平滑肌細(xì)胞密度；免疫組化法檢測標(biāo)本中TLR4、NF-κB、CD68、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表達(dá)水平；RT-PCR和Western印跡檢測標(biāo)本中TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果 動脈瘤血管壁分布有少量陽性平滑肌細(xì)胞，而正常血管壁平滑肌細(xì)胞α-actin染色幾乎均為陽性，其中破裂組、未破裂組的血管平滑肌細(xì)胞密度明顯低于正常對照組(P<0.01)；破裂組血管平滑肌細(xì)胞密度明顯低于未破裂組(P<0.05)。破裂組、未破裂組TLR4、NF-κB、CD68、Caspase-3表達(dá)水平明顯高于正常對照組，破裂組明顯高于未破裂組(P<0.05)。破裂組、未破裂組TLR4 和NF-κB mRNA和蛋白的相對表達(dá)量均明顯高于正常對照組，破裂組明顯高于未破裂組(P<0.05)。結(jié)論 TLR4/NF-κB信號通路在血管內(nèi)皮損傷介導(dǎo)的顱內(nèi)動脈瘤血管壁炎性反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞介導(dǎo)的退行性病變過程中發(fā)揮重要作用。

顱內(nèi)動脈瘤；Toll樣受體4；核因子-κB

顱內(nèi)動脈瘤形成過程與免疫炎癥密切相關(guān)，但其起源和機(jī)制仍未完全明確。核因子(NF)-κB是炎癥細(xì)胞因子的主要調(diào)節(jié)子，相關(guān)研究顯示，NF-κB信號傳導(dǎo)在內(nèi)皮細(xì)胞損傷介導(dǎo)的血管性疾病中發(fā)揮重要作用，TLR可激活NF-κB的信號傳導(dǎo)途徑〔1〕。TLR4是人體中首個發(fā)現(xiàn)的TLR，因其啟動炎性反應(yīng)的作用明顯而在多種疾病發(fā)展過程中均已有研究報道〔2〕，但關(guān)于其在顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病機(jī)制中的作用研究極少。本研究旨在探討TLR4/NF-κB信號通路在顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2016年10月在甘肅省人民醫(yī)院行開顱動脈瘤夾閉術(shù)，在保證手術(shù)安全前提下獲取的標(biāo)本18例。其中男6例，女12例，年齡56～78歲，平均(67.95±9.01)歲；動脈瘤分布：前交通5例、左后交通3例、右后交通4例、左大腦中3例、右大腦中3例，患者均無顱內(nèi)多發(fā)動脈瘤；根據(jù)Hunt-hess標(biāo)準(zhǔn)分為破裂組10例、未破裂組8例。在知情同意的前提下，在患者開顱夾閉術(shù)中獲取入路同側(cè)血管10份為正常對照組。

1.2 主要試劑 TLR4單克隆抗體(工作濃度1∶200)購于上海信裕生物科技有限公司；NF-κB p65抗體(工作濃度1∶100)、CD68單克隆抗體(工作濃度1∶100)購于上?？道噬锟萍加邢薰荆沪?actin多克隆抗體(工作濃度1∶100)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3多克隆抗體(工作濃度1∶200)購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病理學(xué)觀察 將術(shù)中切取的動脈瘤夾遠(yuǎn)端瘤壁標(biāo)本分為兩部分，其中一部分用4%多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。另一部分用3%戊二醛固定，丙酮梯度脫水，包埋后半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙染色后電子顯微鏡下觀察。根據(jù)Lopez-candales標(biāo)準(zhǔn)觀察并計算出每個標(biāo)本的平均血管平滑肌細(xì)胞密度。

1.3.2 免疫組化檢測 標(biāo)本用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，5 μm連線切片。常規(guī)進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯、水化后按試劑盒說明分別加入抗TLR4、抗NF-κB p65、抗CD68、抗Caspase-3以及抗α-actin一抗和二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后每張標(biāo)本切片進(jìn)行指標(biāo)染色，共5張切片完成上述指標(biāo)免疫組化染色，用磷酸緩沖液(PBS)代替為一抗作陰性對照，用廠家提供的已知表達(dá)的上述指標(biāo)切片為陽性對照。根據(jù)Takagi半定量積分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為0分；輕度染色為1分；中度為2分；重度為3分。

1.3.3 RT-PCR檢測 Trizol法提取TLR4、NF-κB穩(wěn)定表達(dá)的標(biāo)本組織細(xì)胞中的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增引物由南京信帆生物技術(shù)有限公司合成。以無cDNA模板的反應(yīng)體系為空白對照；β-actin為內(nèi)對照。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，掃描各條帶灰度值。

1.3.4 Western印跡檢測 取20 mg腦動脈瘤標(biāo)本和正常腦血管組織標(biāo)本提取總蛋白，同時測定總蛋白濃度。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，免疫雜交后發(fā)光法測定目的蛋白，圖像分析軟件測定蛋白條帶的灰度值，以TLR4、NF-κB與β-actin的比值為相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察情況 HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，動脈瘤壁變薄并向外膨出，部分存在淡黃色動脈硬化；動脈瘤內(nèi)皮細(xì)胞空泡變性，管腔中存在血栓；平滑肌細(xì)胞厚度減少，中膜、外膜存在明顯炎性細(xì)胞浸潤；局部存在內(nèi)膜增生。枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙染色后電子顯微鏡下觀察顯示，內(nèi)皮細(xì)胞空泡變性，平滑肌細(xì)胞數(shù)目減少，部分染色細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核部分裂解為碎片，局部出現(xiàn)無細(xì)胞區(qū)；動脈瘤外膜厚度變薄，可見炎性細(xì)胞浸潤，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，胞外基質(zhì)錯亂不清。

2.2 血管平滑肌細(xì)胞密度和標(biāo)本中免疫指標(biāo)表達(dá)情況 動脈瘤血管壁分布有少量陽性平滑肌細(xì)胞，而正常血管壁平滑肌細(xì)胞α-actin染色幾乎均為陽性。破裂組、未破裂組血管平滑肌細(xì)胞密度〔(49.05±6.39)、(52.61±6.80)〕明顯低于正常對照組〔(221.57±10.35)，P<0.01〕；破裂組明顯低于未破裂組(P<0.05)。破裂組、未破裂組TLR4、NF-κB、CD68、Caspase-3表達(dá)水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)；破裂組TLR4、NF-κB、CD68、Caspase-3表達(dá)水平均明顯高于未破裂組(P<0.05)。見表1。

2.3 不同血管壁中TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)情況 RT-PCR檢測顯示，破裂組、未破裂組、正常對照組TLR4 mRNA相對表達(dá)量分別為(8.31±1.08)、(6.12±0.85)、(1.48±0.92)；NF-κB mRNA分別為(15.93±3.18)、(10.42±1.87)、(3.19±0.86)。破裂組、未破裂組TLR4 和NF-κB mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，破裂組高于未破裂組(P<0.05)。見圖1。

2.4 不同血管壁中TLR4和NF-κB mRNA蛋白表達(dá)情況 Western印跡檢測顯示，破裂組、未破裂組、正常對照組TLR4 蛋白相對表達(dá)量分別為(6.96±0.80)、(5.08±0.52)、(1.31±0.09)；NF-κB 蛋白相對表達(dá)量分別為(14.82±2.05)、(7.36±1.13)、(3.15±0.60)。破裂組、未破裂組TLR4 和NF-κB 蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組，破裂組高于未破裂組(P<0.05)。見圖2。

表1 3組不同血管壁標(biāo)本中免疫指標(biāo)表達(dá)情況

與正常對照組比較：1)P<0.05；與未破裂組比較：2)P<0.05

圖1 RT-PCR檢測TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)情況

圖2 Western印跡檢測TLR4和NF-κB 蛋白表達(dá)情況

3 討 論

動脈壁血流切應(yīng)力是顱內(nèi)動脈瘤形成的關(guān)鍵因素，動脈壁炎癥反應(yīng)是動脈病變的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)〔3〕。因此，顱內(nèi)動脈血管異常血流切應(yīng)力和炎癥反應(yīng)在顱內(nèi)動脈瘤形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中NF-κB是形成的關(guān)鍵因子。NF-κB活化后既可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中的相關(guān)基因，還可轉(zhuǎn)錄性上調(diào)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)〔4〕。TLR是目前人體中發(fā)現(xiàn)的唯一能夠?qū)饪乖畔鬟f到胞內(nèi)的跨膜蛋白，是炎癥反應(yīng)的起點和調(diào)控點，涉及動脈硬化等一些列炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展。相關(guān)研究顯示，TLRs家族在調(diào)控免疫反應(yīng)的同時還與多種炎癥性疾病相關(guān)，如TLR2、4參與肺部病原菌感染〔4〕，TLR4、5參與炎性腸道疾病過程〔5〕。TLR4是在哺乳動物中首個發(fā)現(xiàn)的TLR，因其啟動和放大炎性反應(yīng)的作用明顯，在多種疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔6〕，但其在顱內(nèi)動脈瘤發(fā)病機(jī)制中的作用鮮有報道。

本研究提示在人動脈瘤形成過程中伴隨著TLR4表達(dá)上調(diào)。NF-κB被激活在動脈瘤形成中也具有關(guān)鍵作用，相關(guān)研究顯示，他汀類藥物可通過抑制大鼠腦動脈瘤壁導(dǎo)致NF-κB被激活，抑制動脈瘤的中膜退變〔7〕。本研究進(jìn)一步證實了NF-κB激活在人顱內(nèi)動脈瘤組織發(fā)展中的促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果提示CD68、Caspase-3生成可能與動脈瘤形成過程中TLR4/NF-κB信號通路被激活有關(guān)。TLR4表達(dá)水平與NF-κB激活和炎性因子CD68、Caspase-3生成呈平行相關(guān)性，說明TLR4/NF-κB信號通路在血管內(nèi)皮損傷介導(dǎo)的管壁炎性反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞介導(dǎo)的退行性病變過程中發(fā)揮重要作用。

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3 唐海濤,趙 江,付振宇,等.老年顱內(nèi)動脈瘤破裂致蛛網(wǎng)膜下腔出血患者死亡的危險因素〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(4):912-3.

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〔2017-03-27修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

王俊凱(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科研究。

R73

A

1005-9202(2017)14-3427-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.020