莊 嚴 栗俊杰 張詩蒙 陳傳綺

(深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院中心實驗室，廣東 深圳 518067)

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人漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1單核苷酸多態(tài)性與糖尿病及糖尿病腎病的關系

莊 嚴 栗俊杰 張詩蒙 陳傳綺1

(深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院中心實驗室，廣東 深圳 518067)

目的 分析人漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因(PVT)1的11個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與糖尿病(DM)及糖尿病腎病(DN)關系。方法 利用MassARRAY質(zhì)譜分析對DM及DN患者進行PVT1基因11個SNP位點(rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)檢測，分析各位點多態(tài)性在DM、DN組及健康對照組分布差異，探討PVT1基因不同SNP位點與DM及DN的相關性。結(jié)果 DN組與DM組10個SNPs (rs11993333、rs1499368、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)多態(tài)性均有顯著差異；DN組及健康對照組11個SNPs位點多態(tài)性均無顯著差異；DM組及健康對照組5個SNPs (rs2250888、rs2648876、rs2720660、rs2720666、rs2720667)具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論 中國人群PVT1基因多態(tài)性與DM及DN存在易感相關性。

人漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因；單核苷酸多態(tài)性；糖尿?。惶悄虿∧I病

人漿細胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因(PVT)1突變可能是糖尿病(DM)引起終末期腎臟病(ESRD)的獨立危險因素〔1，2〕。PVT1位于人染色體8q24，是長鏈非編碼RNA(1.9 kb)，具有作為糖尿病腎病(DN)的生物標記物的潛能，調(diào)解DN發(fā)生和發(fā)展。本研究利用MassARRAY Assay高通量技術，檢測PVT1基因的11個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)，分析其多態(tài)性與DM及DN相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院住院DN患者75例為疾病組，男40 例，女35 例，平均年齡(59.8±13.4)歲；DM組70例，男 36例，女34 例，平均年齡(59.5±9.8)歲；健康對照組為同期體檢人員70例，男35例，女35例，平均年齡(58.8±9.4)歲。3組年齡及性別無顯著差異。DM組要求DM病史10年以上無DN，DN組要求DM腎損害分期Ⅲ期以上，同時白蛋白/肌酐>30 μg/mg。并排除①1型DM、年輕起病的成人型DM、線粒體性DM病人及DM急性并發(fā)癥；②急、慢性感染性疾??；③近期創(chuàng)傷、手術(6個月內(nèi))；④嚴重心、腦、肝功能損害及影響糖代謝的其他內(nèi)分泌疾病；⑤DM酮癥和酮癥酸中毒及高滲性昏迷、低蛋白血癥、貧血。健康對照組要求無DM、高血壓、冠心病及其他慢性病史；一級親屬中無2型DM患者；血糖、尿糖及肝腎功能均正常，健康體檢者。

1.2 PVT1 SNPs 位點選擇 利用已有的文獻資料及其相應的生物信息數(shù)據(jù)庫(如dbSNP，HapMap等)篩選比較適合的PVT1易感性SNPs位點。11個：rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871。

1.3 儀器與試劑 主要試劑：QIAGEN QIAamp?RNA Blood Mini Kit,Complete iPLEX?Gold Reagent Set。主要設備：美國AgenaBioscience公司的MassARRAY質(zhì)譜系統(tǒng)：質(zhì)譜儀MassARRAY Analyzer 4 System，點樣儀(MassARRAYNanodispenser)，384孔雙頭PCR儀(GeneAmp?PCRSystem9700Dual384-WellSampleBlockModule)；由華大基因協(xié)助提供。

1.4 外周血核酸提取 枸櫞酸抗凝管抗凝全血5 ml，嚴格按照QIAamp?RNA Blood Mini Kit試劑盒說明進行操作，并就每個樣品進行分光光度測定核酸濃度不低于 10 ng/μl，純度在 OD 1.7～2.1。全血及提取物于-20℃保存用于質(zhì)譜分析。

1.5 引物設計 采用Agena Bioscience公司的ADS2.0軟件進行引物設計，由北京六合華大基因科技有限公司合成的。各位點引物序列見表1。

1.6 MassARRAY質(zhì)譜分析 選取相關基因的SNP位點為研究靶點，經(jīng)多重聚合酶鏈反應(PCR)擴增；單堿基延伸，用蝦堿性磷酸酶(SAP)去除多重PCR產(chǎn)物中殘留的dNTP，加入ddNTP，在緊鄰待檢測位點處設計一條延伸引物，在酶的催化下，只延伸待檢測位點處的堿基；高能激光能使延伸的寡核苷酸產(chǎn)物帶上單電荷，在電磁場的作用下，寡核苷酸的飛行時間與其分子量相關，由于4種堿基的分子量不同，通過質(zhì)譜檢測的延伸產(chǎn)物峰數(shù)據(jù)，即可判斷相應位點的基因型。

1.7 統(tǒng)計學處理 使用Haploview軟件經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗分組群體的代表性。使用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗。

表1 PVT1 基因11個不同SNP位點引物序列

2 結(jié) 果

2.1 3組PVT1各SNPs基因型Hard-Weinberg遺傳平衡檢驗 見表2。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，PVT1的11個SNP位點(rs11993333、rs1499368、rs1499373、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)在3組分布均H-W遺傳平衡(P>0.05)。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.2 3組PVT1 11種SNPs多態(tài)性分布比較 DN組和DM組rs1499373多態(tài)性無顯著性差異(P>0.05)；其余10個SNPs均差異顯著(P<0.05)。DN組及健康對照組11種SNPs均無顯著性差異(P>0.05)。DM組及健康對照組rs2250888、rs2648876、rs2720660、rs2720666、rs2720667各位點具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 見表3。

表3 3組PVT1 11種SNPs比較〔n(%)〕

3 討 論

DN確切發(fā)病機制至今尚未闡明，近年來臨床及實驗研究顯示：糖代謝紊亂(糖基化終末產(chǎn)物的形成，多元醇通路的激活，蛋白激酶 C 活性增高) 及腎臟血流動力學改變在DN 的發(fā)病過程中起著重要作用，同時也認為多種細胞因子的異常表達、 遺傳基因易感性、 氧化應激等因素也有一定的作用〔3〕。 遺傳因素不僅與 DN 的發(fā)生和發(fā)展密切相關，而且還決定了 DN 的易感性。DN 具有很明顯的家族聚集性及種族差異，且不是所有的DM患者都會并發(fā) DN。PVT1位于人染色體8q24，是長鏈非編碼RNA(1.9 kb)，該基因在20%的Burkitt淋巴瘤中參與該區(qū)位及2號、22號染色體間循環(huán)易位〔4〕，同時PVT1過表達也影響乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、腎癌的發(fā)生發(fā)展與預后情況，其可能導致細胞擴增失控及不能進入正常的細胞死亡程序〔5〕。美國明尼蘇達大學的研究人員發(fā)現(xiàn)，PVT1的過度表達因8q24.21的放大而促成高水平的原癌基因(MYC)，同時也促成由MYC驅(qū)動的腫瘤發(fā)生。MYC和PVT1水平在人類腫瘤中也是相互關聯(lián)的，說明二者之間存在類似的合作〔6〕。本研究結(jié)果表明：存有PVT1的10個SNPs(rs11993333、rs1499368、rs2250888、rs2648876、rs2720659、rs2720660、rs2720662、rs2720666、rs2720667、rs3815871)的DM個體在疾病發(fā)展中更易發(fā)展為DN。健康人群存在5個SNPs (rs2250888、rs2648876、rs2720660、rs2720666、rs2720667)的個體可能更容易發(fā)展為DM及DN。美國明尼蘇達大學的研究人員發(fā)現(xiàn)，PVT1作為腎衰竭或ESRD候選基因，是由于PVT1可能有助于降低腎臟過濾血液的能力，從而導致腎臟疾病、腎衰竭和死亡，該研究小組發(fā)現(xiàn)，在高血糖(常伴有DM)的情況下，PVT1的表達水平增高至5倍〔7，8〕。Hanson等〔1〕和Millis等〔2〕發(fā)現(xiàn)PVT1 (rs2720709A > G)與1型和2型DM引起的ESRD有關聯(lián)，此外Millis等〔2〕的研究發(fā)現(xiàn)rs13447075、 rs2648862、rs10808565、 rs13447075與1型DM引起的ESRD有一定關聯(lián)性。Alwohhaib等〔9〕的研究也表明G等位基因的高頻改變可能與2型DM有或沒有腎病的發(fā)展相關。Hanson等〔10〕對PVT1所有外顯子、外顯子內(nèi)含子邊界進行測序，確定了47個變異，發(fā)現(xiàn)PVT1 rs2720709與rs2648875位點與2型DM引起的ESRD有強烈的相關性。鄭萍等〔11〕對連云港市漢族2型DM患者的研究結(jié)果卻顯示PVT1 (rs2720709A > G)基因多態(tài)性與該地區(qū)漢族人的DN易感性無關，也僅是PVT1一個SNP位點，不能反映PVT1基因整體基因在DN中的作用。鑒于人種及地域之間的遺傳差異及本研究樣本數(shù)量因素等，中國人PVT1基因與DM及DN相關性的研究還有待大規(guī)模或者選用全基因組測序進行深入研究。

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5 Alvarez ML，Distefano JK.The role of non-coding RNAs in diabetic nephropathy：potential applications as biomarkers for disease development and progression〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2013；99(1)：1-11.

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9 Alwohhaib M，Alwaheeb S，Alyatama N，etal.Single nucleotide polymorphisms at erythropoietin，superoxide dismutase 1，splicing factor，arginine/serin-rich 15 and plasmacytoma variant translocation genes association with diabetic nephropathy〔J〕.Saudi J Kidney Dis Transpl，2014；25(3)：577-81.

10 Hanson RL，Craig DW，Millis MP，etal.Identification of PVT1 as a candidate gene for end-stage renal disease in type 2 diabetes using a pooling-based genome-wide single nucleotide polymorphism association study〔J〕.Diabetes，2007；56(4)：975-83.

11 鄭 萍，田小平，徐 寧，等.PVT1基因rs2720709多態(tài)性與2型糖尿病腎病的相關性〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2014；40(6)：663-5.

〔2016-10-25修回〕

(編輯 張 慧)

深圳市科技計劃項目(No.JCYJ20150403093555014)

莊 嚴(1971-)，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗診斷學研究。

R589

A

1005-9202(2017)14-3400-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.009

1 深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院內(nèi)分泌科